在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

我们此前已设计了一种用于对贴壁细胞施加机械应变的装置。在本研究中，我们重新设计了基底的几何结构，并对装置进行了定制化改进，以实现对这些应变细胞的高分辨率成像。该细胞拉伸系统的主要优势在于，能够对处于应变状态的细胞进行100倍放大下的高分辨率亚细胞成像。

由我实验室的研究助理Vicki演示基底的制备过程。首先，参照随附的文字方案设计一个单孔聚二甲基硅氧烷模具。接着，在一次性杯子中将20份聚二甲基硅氧烷基料与1份固化剂混合均匀。

混合后，将聚二甲基硅氧烷混合物置于0.8 bar的真空除泡器中30分钟，以去除混合物中的气泡。然后将聚二甲基硅氧烷混合物倒入模具和培养皿中。此阶段再次于0.8 bar真空条件下脱气30分钟，以除去残留的气泡。

脱气完成后，在水平台上将样品于 80 摄氏度烘烤两小时。接着，小心地将样品从烘箱中取出，使其冷却至室温。用刀片切去边缘，然后轻轻剥离出固化的聚二甲基硅氧烷。

在直径为150毫米的聚二甲基硅氧烷上，用记号笔绘制一个2厘米×2厘米的网格。在每个方格内，绘制一个1厘米×1厘米的小方格，四周保留0.5厘米的边距。使用刀片沿线条仔细切割，得到方形隔室。

接下来，将样品依次在100%丙酮中孵育4小时，再在100%乙醇中孵育4小时，随后在高压灭菌水中孵育4小时，以进行清洗。将清洗后的样品置于直径150毫米的塑料培养皿内铺有石蜡膜背衬纸的表面上，并在80°C烘箱中干燥4小时。完成后，用石蜡膜密封培养皿，并将样品置于冷藏室中保存，直至后续使用。

准备前体细胞，并将其悬浮于增殖培养基中。以每平方厘米35,000个细胞的密度将这些细胞接种至多聚赖氨酸（PDL）包被的塑料表面。根据表面积，每10平方厘米加入3毫升增殖培养基，调整培养液体积。

培养基体积过少可能导致细胞聚集，这是由于表面张力作用所致；而培养皿中培养基过多则可能导致液体溢出。接种后第三天，收集细胞并使用血细胞计数板进行计数。随后，将35,000个细胞接种至每个含700 µL增殖培养基的聚二甲基硅氧烷（PDMS）板中。

接着，按照制造商的说明，加入质粒构建体，用绿色荧光蛋白标记细胞的组蛋白 H2B 复合物。24 小时后，将带有细胞的聚二甲基硅氧烷样品安装到单轴拉伸装置上。然后，将所有样品中的培养基更换为诱导分化培养基。

测量未受应变的细胞腔室长度，并转动显微镜载物台微调螺丝，将细胞腔室长度增加至所需的应变程度。将拉伸和未拉伸的聚二甲基硅氧烷样品置于37摄氏度培养箱中，直至成像。通过将显微镜培养箱温度设定为37摄氏度，准备用于活细胞成像的显微镜培养系统。

接下来，将100倍油镜物镜移至中心位置，因为后续将无法再调整物镜转盘。物镜到位后，先将其卸下，然后与一个物镜环重新旋紧安装，以便使物镜更接近细胞。随后，在物镜上滴加一滴镜油。

使用定制打印的样品槽，在窗口边缘涂抹真空脂，并将一片厚度为零的玻璃盖玻片放置在样品槽的顶面。用胶带将塑料窗口固定在显微镜载物台上。接着，将Z轴平移台旋紧在显微镜载物台上，并将其移至最高的Z位置。

从待成像的拉伸聚二甲基硅氧烷板中移除 500 微升培养基，并将此培养基加入白色塑料窗孔内的玻璃盖玻片上。然后，使用一对无菌镊子小心地将方形腔室从聚二甲基硅氧烷板上分离。将拉伸装置保持直立，使细胞朝上，位于白色塑料窗孔上方，再小心翻转拉伸装置，使多余的培养基直接滴落在玻璃盖玻片中央，此时细胞朝下。

使用双面胶带将应变装置的底部固定在Z轴平移台上。在明场下通过目镜观察，非常缓慢地降低应变装置，同时提升物镜以对细胞进行聚焦。此聚焦过程应缓慢进行，交替降低Z轴平移台和升高物镜。

如果Z轴平移台下降过多，细胞可能会受压而死亡。如果将物镜抬得过高，则可能压碎玻璃盖玻片，导致培养基泄漏。使用488纳米激发光进行落射荧光观察，同时在X和Y方向扫描聚二甲基硅氧烷（PDMS）板，以寻找具有荧光细胞核的细胞。

同时，在明场下观察样本时，确保细胞具有适当的形态。使用488纳米波长激发，以每帧30秒的间隔，对细胞核进行宽场或针孔全开成像，同时对细胞进行明场激发成像，总时长至少30分钟。本视频中展示的聚二甲基硅氧烷基底的重新设计几何结构以及成像装置，可最大限度缩短细胞与物镜之间的距离。

这使得能够使用100倍油浸物镜对荧光标记的细胞核进行延时成像。为测量细胞核的波动，首先绘制细胞核面积随时间变化的曲线，然后使用三阶多项式对数据进行去趋势处理。

最后，绘制残差波动图并计算残差波动的标准差。少突胶质前体细胞在化学诱导分化后（有或无10%拉伸应变）的细胞核波动结果显示：仅使用化学诱导时，细胞核波动幅度在48小时显著降低，但在24小时无显著变化；而化学诱导结合10%拉伸应变时，细胞核波动幅度在24小时即显著降低，并在48小时维持该水平，未进一步下降。

需要牢记的最重要一点是，所选物镜的工作距离应等于或大于细胞腔室的深度加上盖玻片的厚度。可对基底进行重新设计，加入网格结构，以便在施加应变前后对同一细胞进行成像，因为前后对比类型的数据集能够减少来自实验误差的噪声。利用此成像装置，可在施加机械应变后的数秒内，对贴壁活细胞内的多种亚细胞现象（如蛋白质定位或细胞组分的动态变化）进行成像。