Name: 集成张力传感器在亚微米分辨率下的成像整合和细胞力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学习使用DNA集成张力传感器（ITS）进行亚微米分辨率细胞力成像的方法。该技术可在皮牛灵敏度下实时测量整合素张力，为细胞生物学和生物物理学研究提供高空间分辨率的力学分析工具。

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本工作由艾奥瓦州立大学提供的启动资金以及美国国家普通医学科学研究所（R35GM128747）资助。

本研究所述所有方法均已获得爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，8-16-8333-I）的批准。
1. 整合张力传感器的合成
<ol>
	<li>定制并订购ssDNA（参见材料表）。 
	注意：ssDNA序列如下。上链为 /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2/。下链序列如下： 
	12 pN ITS：/5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/ 
	23 pN ITS：/5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT/ CCC 
	33 pN ITS：/5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/ CCT CCC 
	43 pN ITS：/5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC 
	54 pN ITS：/5Biosg//iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC 
	其中，/5ThioMC6-D/ 表示5'端的硫醇修饰C6 S-S（二硫键），/3BHQ_2/ 表示3'端的Black Hole Quencher 2。/3Bio/、/5Biosg/ 和 /iBiodT/ 分别表示在3'端、5'端以及内部DNA胸腺嘧啶上的生物素化修饰。/iCy3/ 表示Cy3荧光染料插入ssDNA的内部骨架。这些代码由本实验所用的特定商业供应商定义，其他DNA公司可能使用不同的编码方式。</li>
	<li>将RGD肽偶联至SH-ssDNA-淬灭剂。 
	注意：所用试剂包括磷酸盐缓冲液（PBS）、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐（sulfo-SMCC）、RGD肽以及盐酸三(2-羧乙基)膦（TCEP-HCl）。
	<ol>
		<li>使用TCEP溶液对上链DNA的硫醇修饰基团进行去保护。 
		注意：从商业来源订购的硫醇修饰DNA通常以氧化形式运输，其硫原子通过二硫键保护，需在RGD-DNA偶联前进行还原。TCEP是一种无味的还原试剂，用于硫醇去保护。
		<ol>
			<li>将14.3 mg TCEP-HCl溶解于300 µL水中。用1 M NaOH溶液（约150 µL）调节TCEP溶液pH至~7.2–7.4（使用pH试纸检测）。加纯水定容至0.5 mL，最终TCEP浓度为100 mM。 
			注意：建议每次进行DNA硫醇去保护时新鲜配制TCEP溶液，避免长期储存。</li>
			<li>向TCEP溶液中加入100 µL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液和400 µL水。</li>
			<li>将10 µL TCEP+EDTA溶液加入20 µL 1 mM硫醇-DNA-BHQ2的PBS溶液中，室温反应30分钟。 
			注意：该ssDNA 5'端硫醇修饰C6 S-S的二硫键将被TCEP裂解，暴露出可用于下一步与马来酰亚胺反应的游离硫醇基团。TCEP不会干扰后续的硫醇-马来酰亚胺反应，因此此步骤后无需去除或钝化TCEP。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将RGD-NH2与sulfo-SMCC偶联。
		<ol>
			<li>将5 mg RGD-NH2溶解于100 µL PBS中，得到11 mM RGD-NH2溶液。</li>
			<li>向含有2 mg sulfo-SMCC（由供应商预先称量）的离心管中加入200 µL纯水。用移液枪头压碎sulfo-SMCC固体，并同时剧烈吹打以促进其在水中溶解，最终浓度为23 mM。 
			注意：由于sulfo-SMCC中的NHS酯易发生水解，半衰期仅数分钟，因此溶解过程应在1分钟内完成，以避免NHS酯因水解而大量损失。应使用纯水而非PBS或其他缓冲液溶解sulfo-SMCC，因其在缓冲液中溶解度较差。</li>
			<li>将40 µL sulfo-SMCC溶液加入100 µL RGD-NH2溶液中，孵育20分钟。 
			注意：sulfo-SMCC中的NHS酯将与RGD-NH2中的氨基反应，形成连接RGD与sulfo-SMCC的酰胺键。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将RGD-SMCC与SH-ssDNA-淬灭剂偶联。
		<ol>
			<li>混合步骤1.2.1和1.2.2中制备的溶液，室温孵育1小时，随后转移至4 °C冰箱中继续反应过夜。上链DNA上的硫醇基团将与sulfo-SMCC上的马来酰亚胺基团反应，形成硫醚键，从而将RGD连接至上链DNA。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过乙醇沉淀法纯化RGD-ssDNA-淬灭剂，去除未反应的sulfo-SMCC、RGD和TCEP。
		<ol>
			<li>将10 mL无水乙醇置于15 mL锥形离心管中，在-20 °C冰箱中预冷至少30分钟。</li>
			<li>按体积比1:10:25混合3 M NaCl溶液、DNA溶液和预冷乙醇，将混合液置于-20 °C冰箱中30分钟或直至DNA完全沉淀。</li>
			<li>在10,000 x g条件下离心30分钟，弃去上清液。</li>
			<li>向DNA沉淀中加入PBS，使用分光光度计测定DNA浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>（可选）进行DNA电泳以获得更高纯度的RGD-ssDNA。 
		注意：根据上述方案，约70%–90%的ssDNA可成功偶联RGD。若需更高纯度，可通过DNA电泳分离偶联与未偶联的DNA。
		<ol>
			<li>组装垂直电泳系统。</li>
			<li>通过混合50 mL纯水、20 mL 40%丙烯酰胺凝胶溶液、8 mL 10x三羟甲基氨基甲烷-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液和800 µL 10%过硫酸铵（APS）配制10%聚丙烯酰胺凝胶溶液。</li>
			<li>向凝胶溶液中加入80 µL四甲基乙二胺（TEMED），立即倒入电泳装置的玻璃槽中，插入单孔梳子以形成加样孔，静置10分钟至凝胶完全交联。</li>
			<li>将DNA溶液与100%甘油按1:1体积比混合，取出梳子后将混合液加入凝胶孔中。</li>
			<li>在200 V电压下电泳，观察到两条DNA条带，其中迁移较慢的条带为偶联产物。</li>
			<li>切下含有偶联DNA的凝胶条带，并切成小块。</li>
			<li>将切碎的凝胶分装至两个带滤膜的1.5 mL离心管中，每管加入500 µL PBS。</li>
			<li>将PBS浸泡的凝胶置于室温避光处静置1天，使DNA从凝胶碎片中扩散至PBS溶液中。</li>
			<li>在1,000 x g条件下离心2分钟，收集DNA溶液。</li>
			<li>再次进行乙醇沉淀（步骤1.2.4）以回收DNA。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过RGD-ssDNA-淬灭剂与染料-ssDNA-生物素杂交合成ITS。
	<ol>
		<li>以上链和下链DNA溶液按1.1:1的摩尔比混合，在4 °C孵育过夜，通过DNA杂交生成ITS。 
		注意：采用1.1:1而非1:1的摩尔比进行DNA杂交，使用过量的RGD-ssDNA-淬灭剂以确保所有染料-ssDNA-生物素均能与其杂交。未杂交的RGD-ssDNA-淬灭剂将在表面包被过程中被洗脱，不会影响ITS表面包被质量。</li>
		<li>分装ITS溶液并于-20 °C长期保存。 
		注意：保存缓冲液为PBS，保存浓度一般应高于10 µM。常规使用时，ITS溶液可在4 °C保存数周而不发生明显质量下降。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过在玻璃底培养皿上固定ITS来制备ITS表面
注意：所用试剂包括生物素标记的牛血清白蛋白（BSA-biotin）、亲和素蛋白和ITS。将所有试剂和PBS缓冲液置于冰桶中，冰浴冷却至约0 °C。
<ol>
	<li>在玻璃底培养皿（直径29 mm，内孔14 mm）的孔中加入200 µL PBS配制的0.1 mg/mL BSA-生物素溶液。在4 °C冰箱中孵育30分钟。BSA-生物素将物理吸附于玻璃表面。</li>
	<li>用移液器吸出孔中溶液，重新加入200 µL PBS以洗涤表面。重复此步骤3次，完成洗涤。</li>
	<li>在孔中加入200 µL浓度为50 µg/mL的亲和素（avidin）蛋白溶液，在4 °C孵育30分钟。用PBS洗涤3次。此步骤后，亲和素蛋白将结合至BSA-生物素，并固定于玻璃表面。</li>
	<li>在孔中加入200 µL浓度为0.1 µM的ITS溶液，在4 °C孵育30分钟。用PBS洗涤3次。细胞接种前始终保持孔内含有PBS。此步骤后，带有生物素标签的ITS将结合至亲和素蛋白，并固定于表面。 
	注意：在ITS固定过程中，确保ITS包被质量和均一性的关键注意事项是：切勿让培养皿表面干燥。将所有试剂和PBS保持在4 °C或冰桶中接近0 °C，有助于在洗涤步骤中（当PBS从孔中吸出时）降低水分蒸发速率。</li>
</ol>
3. 细胞接种至ITS表面
<ol>
	<li>培养鱼类角质细胞。 
	注意：此处以金鱼（Carassius auratus）为例，但其他鱼类物种也可能适用。
	<ol>
		<li>用平头镊子从鱼体上取下一小片鱼鳞。将鱼鳞轻轻按压在玻璃底培养皿的孔中，使鱼鳞内侧接触玻璃表面。静置约30秒，使鱼鳞牢固黏附于培养皿的玻璃表面。</li>
		<li>加入1 mL完全培养基（Iscove改良的Dulbecco培养基，IMDM），完全覆盖鱼鳞。将培养皿置于黑暗且湿润的盒子中，在室温下孵育6–48小时。 
		注意：IMDM完全培养基包含79% IMDM + 20%胎牛血清（FBS）+ 1%青霉素。无需额外提供氧气或CO2。可在盒内放置数卷浸湿的纸巾以维持高湿度环境。数小时后，鱼类角质细胞将以细胞片层的形式从鱼鳞中迁移出来，可通过组织培养显微镜观察。细胞通常在48小时内保持活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将角质细胞从鱼鳞上解离并接种至ITS表面。
	<ol>
		<li>移除培养鱼鳞的培养皿中的培养基。用细胞解离液清洗孔内1次，加入解离液覆盖鱼鳞，并孵育3分钟。 
		注意：细胞解离用EDTA溶液的配方如下：100 mL 10倍Hanks平衡盐溶液（HBSS）+ 10 mL 1 M HEPES（pH 7.6）+ 10 mL 7.5%碳酸氢钠 + 2.4 mL 500 mM EDTA + 1 L H2O。调节pH至7.4。</li>
		<li>吸除全部细胞解离液，加入IMDM完全培养基。通过轻柔吹打使角质细胞分散。将细胞悬液浓度调整至所需水平（1 × 104–1 × 105/mL）。将细胞接种至ITS表面（按第2节方法制备）。成像前于室温孵育30分钟。 
		注意：细胞解离后可使用血细胞计数板进行计数。接种密度相对较低，以确保角质细胞有足够的表面积进行迁移。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将CHO-K1细胞和NIH 3T3细胞接种至ITS表面。 
	注意：CHO-K1细胞的培养基为89% Ham’s F12 + 10% FBS + 1%青霉素；NIH 3T3细胞的培养基为89% Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）+ 10%小牛血清（CBS）+ 1%青霉素。培养条件为37 °C和5% CO2。
	<ol>
		<li>在培养皿（或培养瓶）中将CHO-K1细胞或NIH 3T3细胞培养至80%–100%汇合度。</li>
		<li>将细胞解离液和培养基预热至37 °C。</li>
		<li>用移液器吸除培养皿中的全部培养基。用细胞解离液清洗细胞1次。加入解离液覆盖细胞，并在37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>通过吹打使细胞分散。收集细胞悬液，并在300 × g下离心3分钟。</li>
		<li>吸除上清液，加入完全培养基或无血清培养基。</li>
		<li>将细胞悬液浓度调整至所需水平（1 × 105 – 1 × 106/mL）。将细胞接种至ITS表面（按第2节方法制备）。成像前于37 °C孵育1–2小时，或录像前孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成像、视频记录与实时整合素张力作图
<ol>
	<li>活细胞中整合素张力的准实时成像
	<ol>
		<li>将角质形成细胞在ITS表面（按第2节所述方法制备）上于室温孵育30分钟，或将CHO-K1细胞或NIH 3T3细胞在37 °C培养箱中的ITS表面上孵育1小时。</li>
		<li>将培养皿置于荧光显微镜载物台上。以1秒的曝光时间进行细胞力成像。放大倍数为40倍或100倍。</li>
		<li>以20秒的帧间隔对角质形成细胞拍摄ITS图像视频，或以1–2分钟的帧间隔对CHO-K1细胞或NIH 3T3细胞进行拍摄。</li>
		<li>使用MATLAB或其他图像分析工具，将ITS视频的当前帧减去前一帧，以计算在最新帧间隔内新生成的ITS信号。新生成的ITS信号代表在最新帧间隔内产生的整合素张力，从而以准实时方式反映细胞受力情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色细胞中整合素张力与细胞结构的共成像
	<ol>
		<li>在步骤3.2.2或步骤3.3.6之后，进行免疫染色以标记目标结构蛋白。 
		注意：使用不同的染料以避免整合素张力成像与细胞结构成像之间的荧光串扰。本研究中，鬼笔环肽使用Cy5荧光染料，连环蛋白（vinculin）染色使用Alexa 488。一抗和二抗的浓度均为2.5 µg/mL。鬼笔环肽的浓度为1.5 units/µL。</li>
		<li>进行多荧光通道成像，同时获取整合素张力图谱和细胞结构图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li>
<li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074(2011).</li>
<li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li>
<li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+signaling%3A+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li>
<li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li>
<li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li>
<li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+effects+of+%CE%B21+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430(2016).</li>
<li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li>
<li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li>
<li>Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li>
<li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Insights%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li>
<li>Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates%3A+A+guide+to+recent+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li>
<li>Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXie%2C+T+%22Fibrosis.+Methods+and+Protocols%22">Fibrosis. Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).</li>
<li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li>
<li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li>
<li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969(2010).</li>
<li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact%2C+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li>
<li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li>
<li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li>
<li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959(2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li>
<li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Path+Quenchers%3A+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li>
<li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+%CE%B1v%CE%B23+integrin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li>
<li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent%2C+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li>
<li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li>
<li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002(2018).</li>
<li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex%3A+From+Fundamentals+to+Force+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li>
<li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li>
<li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unzipping+DNA+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li>
<li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%E2%80%99Acad%C3%A9mie+des+Sciences+-+Series+IV+-+Physics%22%5BJournal%5D)">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li>
<li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920(2008).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

ITS 是一种在合成与应用两方面均具有高度可及性且功能强大的细胞力学作图技术。在所有材料齐备的情况下，ITS 可在 1 天内完成合成。实验过程中，在细胞接种前仅需进行三步表面包被操作。近期，我们进一步将包被步骤简化为一步，即通过将 ITS 直接连接至牛血清白蛋白，从而实现 ITS 在玻璃或聚苯乙烯表面的直接物理吸附33。ITS 可将细胞力学信号的荧光强度提升至与细胞结构成像相当的水平。其便捷的合成与样品制备流程、对显微镜设备要求适中，以及对细胞力学信号的高度灵敏性，使 ITS 成为研究细胞力学的一种稳健且可靠的技术。本文中，我们提供了一套完整的 ITS 合成与应用方案。
将 RGD 配体与 ssDNA 偶联是 ITS 合成中最关键的步骤。如实验方案部分所述，磺基-SMCC 上的 NHS 酯在水中不稳定。磺基-SMCC 在水中溶解所需时间越长，越多的磺基-SMCC 会因水解而失去 NHS 酯，变成“失活”分子，这类分子可通过马来酰亚胺-巯基反应与 DNA 偶联，但无法与 RGD-NH2 发生偶联。因此，大量 DNA...

细胞依赖整合素与细胞外基质黏附并施加细胞力。整合素介导的细胞黏附和力传递对细胞铺展1,2、迁移3,4以及存活5,6,7至关重要。从长期来看，整合素生物力学信号还影响细胞增殖8,9,10和分化11,12。研究人员已开发出多种方法用于测量和绘制细胞-基质界面处整合素传递的细胞力。这些方法基于弹性基底13、微柱阵列14或原子力显微镜（AFM）15,16。弹性基底和微柱方法依赖于基底的形变来报告细胞应力，在空间分辨率和力敏感性方面存在局限性。AFM具有较高的力敏感性，但无法同时在多个位点检测力，因此难以绘制整合素传递的细胞力分布图。
近年来，已开发出多种技术用于在分子水平上研究细胞受力。一系列基于聚乙二醇17,18、蜘蛛丝肽19和DNA20,21,22,23的分子张力传感器被开发出来，用于可视化并监测分子蛋白传递的张力。在这些技术中，DNA最初被用作张力调节系留装置（TGT）的合成材料，该装置是一种可断裂的连接子，可调控活细胞中整合素张力的上限值22,24。随后，DNA与荧光共振能量转移技术相结合，由Chen课题组23和Salaita课题组20率先开发出基于发夹结构DNA的荧光张力传感器。这种基于发夹DNA的张力传感器可实时报告整合素张力，并已成功应用于一系列细胞功能的研究21。此后，Wang实验室将TGT与荧光团-淬灭剂配对结合，用于报告整合素张力，该传感器被称为ITS25,26。ITS基于双链DNA（dsDNA），具有更宽的动态范围（10–60 pN），适用于整合素张力的校准。与基于发夹DNA的传感器不同，ITS不能实时报告细胞受力，而是将所有历史整合素事件记录为细胞受力的“足迹”；这种信号累积过程提高了细胞受力成像的灵敏度，使得即使使用低端荧光显微镜也能实现细胞受力成像。ITS的合成相对更为简便，其通过两条单链DNA（ssDNA）杂交而成。
ITS 是一种由18个碱基对组成的双链DNA（dsDNA），其上偶联有生物素、荧光团、淬灭剂（黑洞淬灭剂2 [BHQ2]）27以及环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽28，后者作为整合素的肽配体（图1）。其中，下链偶联有荧光团（本文使用Cy3，但在本实验室中也已证实其他染料如Cy5或Alexa系列同样可行）和生物素标签，通过生物素-亲和素结合将ITS固定在基底上。上链则偶联有RGD肽和黑洞淬灭剂，该淬灭剂对Cy3的淬灭效率约为98%26,27。根据本文所述的实验方案，ITS在基底上的包被密度约为1,100/µm2。该密度值是我们此前通过相同的包被方法，对标记生物素的18 bp双链DNA在中性亲和素功能化基底上的包被密度进行校准所得的结果29。当细胞黏附于包被有ITS的基底时，整合素通过RGD与ITS结合，并向ITS传递张力。ITS具有特定的张力耐受阈值（Ttol），定义为在2秒内导致ITS中双链DNA发生力学解离的张力阈值22。当整合素施加的张力使ITS断裂时，淬灭剂与荧光染料分离，从而引发荧光发射。因此，原本不可见的整合素张力被转化为荧光信号，细胞受力情况可通过荧光成像进行图谱化分析。
为了展示ITS的应用，我们在此使用鱼角质细胞（一种广泛用于细胞迁移研究的细胞模型）30,31,32、CHO-K1细胞（一种常用的非运动性细胞系）以及NIH 3T3成纤维细胞。同时进行了整合素张力与细胞结构的共成像分析。

<table><tbody><tr><td>BSA-生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>中性亲和素（Neutravidin）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素（Streptavidin）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>上链DNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>客户设计。DNA序列见“实验方案”部分</td></tr><tr><td>下链DNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>客户设计。DNA序列见“实验方案”部分。</td></tr><tr><td>磺基-SMCC（sulfo-SMCC）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A39268</td><td></td></tr><tr><td>含氨基的环状肽RGD</td><td>Peptides International</td><td>PCI-3696-PI</td><td></td></tr><tr><td>IMDM培养基</td><td>ATCC</td><td>&amp;lrm;62996227</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>青霉素（Penicillin）</td><td>gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦（TCEP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>200 μL 培养皿</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>SE410 高型风冷垂直蛋白电泳仪</td><td>Hoefer</td><td>SE410-15-1.5</td><td>用于电泳的设备</td></tr><tr><td>CHO-K1细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>抗Vinculin抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>90227</td><td>用于Vinculin免疫染色的一抗</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）超纯二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Invitrogen</td><td>A28175</td><td>用于Vinculin免疫染色的二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647标记的鬼笔环肽（Phalloidin）</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>显微镜</td></tr></tbody></table>

以整合型张力传感器实现亚微米分辨率的整合素张力与细胞力成像

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

由整合素-配体键传递的分子张力是整合素通路中的基本力学信号，在多种细胞功能与行为中发挥重要作用。为了以高力敏感度和空间分辨率对整合素张力进行校准与成像，我们开发了一种整合式张力传感器（ITS），这是一种基于DNA的荧光张力传感器。当ITS承受分子张力时会被激活并产生荧光，从而在分子水平上将力学信号转化为荧光信号。ITS激活的张力阈值可在10–60 pN范围内调节，恰好覆盖细胞内整合素张力的动态范围。在修饰有ITS的基底上，可通过荧光对贴壁细胞的整合素张力进行可视化，并以亚微米分辨率成像。ITS还可与活细胞和固定细胞的细胞结构成像兼容。该传感器已成功应用于血小板收缩和细胞迁移的研究。本文详细描述了ITS的合成及其在整合素介导的细胞力研究中的应用流程。

利用ITS技术，捕获了鱼类角质细胞的整合素张力图谱。结果显示，角质细胞在迁移过程中沿两条受力轨迹产生整合素张力（图2A）。该受力图谱的空间分辨率为0.4 µm（图2B）。高整合素张力主要集中于细胞后缘（图3A）。ITS还揭示了不同类型细胞具有不同的特异性张力模式。例如，非运动性细胞NIH-3T3所形成的整合素张力模式（图3B）与快速迁移的角质细胞显著不同。
通过免疫染色，对鱼类角质细胞的黏着斑及整合素张力进行了共聚焦成像（图4A）。Wang 等人对角质细胞中整合素张力与细胞结构之间的关系进行了详细研究25。在 ...

整合素张力在多种细胞功能中发挥重要作用。利用一种整合式张力传感器，可对整合素张力进行皮牛顿（pN）级灵敏度的校准，并以亚微米分辨率成像。

由整合素-配体键传递的分子张力是整合素通路中的基本力学信号，在许多...中发挥重要作用

这种基于DNA的整合性张力传感器（ITS）能够将力信号在局部转化为荧光信号，从而实现利用荧光显微镜直接成像细胞受力情况。ITS具有高空间分辨率和高灵敏度，其激活阈值可调，可选择性地成像不同水平的整合素张力。在收到目标定制单链DNA（ssDNA）后，若要将RGD肽与硫醇化ssDNA淬灭剂偶联，首先在约450微升新配制的TCEP溶液中加入100微升0.5摩尔EDTA溶液和400微升水。然后，将10微升TCEP-EDTA溶液加入20微升浓度为1毫摩尔的硫醇化DNA淬灭剂PBS溶液中，在室温下孵育30分钟。为将RGD胺与sulfo-SMCC偶联，将40微升新配制的23毫摩尔sulfo-SMCC溶液加入100微升新配制的11毫摩尔RGD胺溶液中，在室温下孵育20分钟。将硫醇化ssDNA淬灭剂溶液的全部体积与RGD胺SMCC溶液的全部体积混合，在室温下孵育一小时，以实现RGD胺SMCC与硫醇化ssDNA淬灭剂的偶联。孵育结束后，将溶液转移至4°C环境中过夜保存。次日早晨，按照1:10:25的比例，向巯基偶联的DNA溶液中加入三倍摩尔浓度的氯化钠以及经-20°C预冷的100%乙醇，混匀后于-20°C条件下放置约30分钟。当DNA沉淀完全后，通过离心收集DNA，并将沉淀重悬于PBS中，随后使用分光光度计测定DNA浓度。对于整合张力传感器（ITS）的合成，将上链与下链DNA溶液按1.1:1的摩尔比混合，在4°C条件下孵育过夜，随后将混合物分装并置于-20°C长期保存。对于ITS的固定化，使用200 µL浓度为0.1 mg/mL的生物素化牛血清白蛋白（BSA-biotin）在4°C条件下对直径为29 mm的玻璃底培养皿进行包被处理，孵育30分钟。当BSA-生物素在玻璃表面发生物理吸附后，每次用200微升新鲜PBS洗涤培养皿三次，随后加入200微升浓度为每毫升50微克的亲和素蛋白，在4摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，如前所述用PBS洗涤培养皿三次，然后加入200微升0.1微摩尔的ITS，在4摄氏度下继续孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤培养皿三次，最后一次洗涤后将PBS保留在培养皿中，直至进行细胞接种。为建立鱼类角质细胞培养，使用平头镊子从鱼体上拔取一片鳞片，并轻轻将鳞片内侧朝下按压在未经处理的玻璃底培养皿的孔中，使其内表面与玻璃接触。等待约30秒，使鱼鳞牢固黏附于培养皿的玻璃表面，随后加入1毫米厚的完全Iscove改良Dulbecco培养基覆盖鳞片。然后将鳞片置于黑暗且湿润的容器中，在室温下孵育6至48小时。为了将角膜细胞接种到ITS表面，将角膜细胞培养皿中的培养基替换为1X细胞解离溶液，在室温下孵育3分钟。孵育结束后，用新鲜的完全培养基替换解离溶液，并通过轻柔吹打使细胞解离。随后，将细胞调整至适宜的浓度，接种于涂有ITS的培养皿中，在室温下孵育30分钟，然后进行成像。为了在活细胞中进行准实时整合素张力成像，将细胞转移至荧光显微镜的载物台上，并选择40倍或100倍物镜。在成像软件中，将曝光时间设置为1秒，帧间隔设置为20秒，以获取ITS图像的视频。然后，使用合适的图像分析软件，将当前帧的ITS视频减去前一帧，以计算在最新帧间隔内新产生的ITS信号。新生成的ITS信号代表了在最近一个帧间隔内产生的整合素张力，从而以准实时的方式报告细胞受力情况。此处，整合素张力成像显示在角质形成细胞迁移过程中，两条受力轨迹上均出现了整合素张力的诱导。随后，该力图的分辨率可校准为0.4微米。高整合素张力集中在运动性鱼类角质细胞的后缘。在非运动细胞中，会形成一种与快速迁移的角质细胞中所观察到的截然不同的特定整合素张力模式。可通过共成像鱼类角质细胞的黏着斑和整合素张力，来评估目标细胞中整合素张力与细胞结构之间的关系。利用ITS技术，细胞黏附力的观测分辨率和灵敏度可达到与细胞结构成像相当的水平。该技术为研究细胞内力与结构之间的相互作用奠定了基础。

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生物工程

集成张力传感器在亚微米分辨率下的成像整合和细胞力

该视频展示了一种利用聚乙二醇锚定的金纳米颗粒和DNA发夹张力探针来评估免疫细胞施加的受体力的方法。CD8阳性T细胞的相互作用会触发探针的展开，从而发出荧光，而锁定链则维持信号，用于量化免疫细胞施加的力。...

利用基于DNA的张力探针评估免疫细胞施加的受体作用力

近年来，已开发出多种基于FRET的力学生物传感器，能够实现对细胞内力的蛋白质特异性解析。在本方案中，我们演示了如何使用一种针对核骨架-细胞骨架（LINC）复合物蛋白Nesprin-2G的连接区设计的传感器，来测量作用于细胞核LINC复合物上的肌动球蛋白力。...

使用 Förster 共振能量转移（FRET）力生物传感器测量细胞核 LINC 复合物跨膜机械力的实验方案

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。...

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

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通过连接蛋白43结构破坏干扰内皮细胞生物力学

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无参考牵引力显微镜平台的构建与应用

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本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

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整合型细胞信号分析工具包：力学、运动、形态与荧光

TGT 表面是一种用于研究生长因子与整合素串扰的创新平台。该平台采用灵活的探针设计、特异性的黏附配体以及对刺激条件的精确调控，可对 EGFR 与整合素之间的相互作用进行可靠的定量评估。研究结果表明，EGFR...

用于量化生长因子介导的整合素力学与黏附的张力测量锚定探针

本文描述了一种微张力计/共聚焦显微镜的设计与操作方法，可用于在观察界面形貌的同时，同步测量界面张力和界面膨胀流变学性质。该方法可实时构建在技术和生理过程中具有重要意义的界面结构-性能关系。...

用于共聚焦显微镜观察动态界面的微张力测定仪

学习使用DNA集成张力传感器（ITS）进行亚微米分辨率细胞力成像的方法。该技术可在皮牛灵敏度下实时测量整合素张力，为细胞生物学和生物物理学研究提供高空间分辨率的力学分析工具。

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