集成张力传感器在亚微米分辨率下的成像整合和细胞力

这种基于DNA的综合张力传感器（ITS）可将力信号在局部上转换为荧光，从而通过荧光显微镜直接成像细胞力。ITS 具有高空间分辨率和高灵敏度。激活阈值是可调的，允许在不同级别选择性地显示集成张力。

在收到感兴趣的定制单链DNA（或ssDNA）将RGD肽加入硫化sSSDNA淬火剂后，首先在400微升水中加入100微升0.5摩尔EDTA，加入约450微升新鲜准备的TCEP溶液中。然后，在PBS中20微升的1毫摩尔硫醇DNA淬火器中加入10微升的TCEP-EDTA溶液，在室温下孵育30分钟。要将RGD胺与磺胺-SMCC结合，将40微升新鲜准备的23毫摩尔磺胺-SMCC加入100微升新鲜准备好的11毫摩尔RGD胺溶液，在室温下孵育20分钟。

要将RGD胺SMCC与硫化sSDNA淬火器结合，将硫化sSSDNA淬火剂溶液的整个体积与RGD胺SMCC溶液的整个体积混合，在室温下进行一小时的孵育。在孵化结束时，将溶液转移到四摄氏度的储存过夜。第二天早上，将三摩尔氯化钠与硫醇结合DNA溶液和零下20摄氏度、冷藏、100%乙醇混合在1比10-25的比例下，将反应在零下20摄氏度左右，约30分钟。

当DNA沉淀时，通过离心收集DNA，并在PBS中重新预支颗粒，以测量光谱仪上的DNA浓度。对于综合张力传感器（或 ITS）合成，以 1.1 比 1 摩尔比混合上链和下链 DNA 溶液，并在 4 摄氏度下孵化反应，然后将混合物的等分在零下 20 摄氏度进行长期储存。对于 ITS 的固定，在 4 摄氏度下涂上 200 微升 0.1 毫克每毫升 0.1 毫克生物素化牛血清白蛋白（BSA-生物素）的玻璃底培养皿，30分钟。

当 BSA-生物素在玻璃表面物理吸附时，每次洗涤用 200 微升新鲜 PBS 洗三次，然后用 200 微升 50 微克每毫升 avidin 蛋白质孵育 30 分钟，温度为 4 摄氏度。在孵化结束时，如证明，用PBS洗三次，并添加200微升0.1微摩尔 ITS，在4摄氏度下再孵育30分钟。在孵育结束时，用PBS洗三次盘子，最后一次洗在盘子里直到细胞电镀。

要启动鱼角细胞培养，请使用平尖的钳子从鱼身上拔出一块秤，然后轻轻地将水平压在未修改的玻璃底培养皿的井上，与玻璃质接触。等待约 30 秒，让鱼量表粘附在鱼的玻璃表面，然后用一毫米完整的 Iscove 的修改 Dulbecco 介质覆盖鱼型水表。然后，在室温下在黑暗潮湿的盒子里孵育6至48小时。

要将角核细胞板到 ITS 表面，请用 1X 细胞分离溶液替换角蛋白培养皿中的介质，在室温下孵育三分钟。在孵育结束时，用新鲜的完整介质替换分离溶液，用温和的移液分离细胞。然后，将细胞调整到适当的浓度进行电镀，并在成像前在室温下将其播种到 ITS 涂层盘中 30 分钟。

对于活细胞中的准实时整数张力成像，将细胞转移到荧光显微镜的阶段，并选择40或100倍的目标。在成像软件中，将曝光时间设置为 1 秒，帧间隔为 20 秒，以获取 ITS 图像的视频。然后，使用适当的图像分析软件程序从当前帧中减去 ITS 视频的前一帧，以计算最新帧间隔中新产生的 ITS 信号。

新生成的 ITS 信号表示最新帧间隔中产生的整数张力，从而以准实时方式报告蜂窝力。在这里，在角细胞迁移过程中，集成张力映射演示了在两个力轨上诱导的整流蛋白张力。然后，力图的分辨率可校准为0.4微米。

高整数张力集中在莫蒂鱼角细胞的后缘。在非分子细胞中，形成了一种与快速迁移角细胞中观察到的非常不同的特异性张力模式。可以共同成像鱼角细胞的聚焦粘附和整数张力，以评估细胞内整数张力与细胞结构之间的关系。

使用 ITS 时，细胞粘附力以分辨率和与细胞结构成像相媲美的灵敏度变得可见。这项技术为研究细胞中的力-结构相互作用铺平了道路。