工程生物膜的三维造型
May 16th, 2019
本文介绍了一种将低成本商用3D 打印机转换为细菌3D 打印机的方法, 该打印机可促进图案生物膜的打印。介绍了制备生物打印机和生物油墨的所有必要方面, 以及评估生物膜形成的验证方法。
细菌3D生物印印是一种新开发的技术。该协议提供了一种简单的方法来构建用细菌打印的3D工程生物膜。该技术的主要优点是能够使用廉价的家用 3D 打印机生产 3D 打印生物膜。
我们的 3D 打印机的一个可能应用是创建可重复的模型生物膜，可用于开发新的抗菌疗法。我们的 3D 打印方法可应用于与我们的藻酸盐生物墨水兼容的任何类型的细菌。生物墨和印刷基板的制备是相当标准的过程，而 3D 打印过程，尤其是 Z 轴的校准是需要一些实践的关键步骤。
设置访问高度的校准将影响我们的 3D 打印机的分辨率，并且在很大程度上取决于个人体验。此过程需要手动调整，并且很难用书面格式进行描述。将 200 微升移液器尖端连接到硅胶管的长度，然后将移液器尖端安装到 3D 打印机的挤出机头上，以替代原始挤出机。
接下来，在卢里亚-贝尔塔尼肉汤中溶解的400毫升1%阿加糖中加入四毫升的五摩尔氯化钙溶液，并辅以适当的抗生素和诱导剂。然后，将 20 毫升 LB agar 溶液分配到每 150 毫米的 15 毫米培养皿中。在室温下将盘子晾干30分钟，盖子半开。
准备3%的藻酸钠溶液，加热至沸点三次，对溶液进行消毒。然后，将无菌溶液存放在摄氏四度，直到使用。为了准备生物墨水的细菌成分，生长携带质粒的大肠杆菌，在含有抗生素的50毫升LB介质中进行GP表达。
在 250 RPM 和 37 摄氏度的温度下摇动文化。培养物过夜后，在重力的3，220倍下分粒细菌5分钟，然后去除上经剂。将细菌颗粒重新在10毫升的LB介质中，并加入10毫升3%的藻酸钠。
将 3D 打印机连接到计算机，然后打开 3D 打印软件。单击 X、Y 和 Z 轴的"主页"按钮，将打印头移动到其主位置。对于每次打印，请将准备好的打印基板放在打印床上的特定位置。
在手动控制下，将打印头提升至超过 22 毫米的高度，这样在移动过程中不会与 Petri 盘的边缘碰撞。将打印头放在印版顶部，然后向下移动，直到移液器尖端接触打印表面。将此 Z 轴位置分配为 Z1，即打印表面的高度。
接下来，抬起打印头，然后手动将其移出板区域。如果打印头和印版表面之间的工作距离定义为 Z2，请在打印过程中将打印表面的高度加上工作距离输入打印程序作为 Z 值。加载预编程的 G 代码文件，其中包含用于打印所需形状的命令。
在每个命令行中，打印头的位置可能会以 X、Y 和或 Z 轴更改。确保所有打印步骤中输入 Z 值，如打印表面的高度和工作距离。将液体生物墨水装入注射器，并安装在 3D 生物打印机的注射器泵中。
然后，将挤出速度设置为每小时 0.3 毫升。单击"打印"按钮将生物墨水打印到打印基板上。等待启动注射器泵，直到打印开始，直到打印头与打印表面接触。
在打印过程中，完全通过软件控制打印头的移动。一旦打印头到达打印的最后一点，请停止注射器泵，否则多余的生物墨将掉落到打印基板上并降低打印分辨率。对于 3D 结构的构造，打印头的所有移动都在 G 代码编辑器中控制。
要增加第二层的打印高度，请键入第一层的打印高度，并在代码中增加 0.2 毫米的 Z 值。此后，在移动到较高层时，将 Z 值增加 0.1 毫米。在室温下孵育印刷样品三至六天，以生产生物膜成分，如卷曲纤维。
然后，将板放在荧光扫描仪上，对板进行成像。要溶解藻酸基质，在pH 7下加入20毫升0.5摩尔柠檬酸钠溶液，加入印刷基材。在室温下孵育板两小时，同时在转速为 30 rpm 时摇晃。
然后，丢弃液体并再次成像板，以比较柠檬酸盐处理之前和之后板的图像。3D 生物打印机可以产生以各种二维和三维形状封装水凝胶的细菌。然后，这些印刷形状可用于评估生物膜的形成是否成功，或者藻酸基质是否使用柠檬酸钠溶液完全溶解。
在无可教育的柯利生产质粒的生物墨水的情况下，印刷图案在柠檬酸钠处理后完全溶解，表示未形成生物膜柯利网络。含有可教育的柯利生产质粒的细菌在柠檬酸钠处理后未溶解，表明印刷细菌能够形成足够广泛的柯利网络，以稳定细菌的印刷模式。要构造多层结构，可以通过控制 G 代码编辑器来打印其他图层。
增加样本中的打印图层数导致打印结构的宽度和高度逐渐增加。当大肠杆菌被设计成可不知不觉地生产柯利蛋白被打印成多层结构时，柠檬酸钠处理不会溶解样品，而含有非柯利产生的大肠杆菌的多层结构则溶解。3D 打印过程最关键的部分是 Z 轴的校准，以及启动打印和启动注射器泵的协调。
为这个过程开发的生物墨水是相当软的，具有低韧性。为了提供和提高机械稳定性，可以对生物墨进行进一步的修改。这种 3D 打印技术能够生产具有优异机械性能的生物膜，从而制造仿生材料。
处理这些细菌时，请戴上适当的防护服，如手套。
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概述
本文介绍了一种将低成本商用3D打印机转变为能够打印图案化生物膜的细菌3D打印机的方法。它详细说明了生物打印机、生物墨水的准备以及评估生物膜形成的验证方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 3D生物打印
- 微生物学
- 生物工程
背景
- 使用细菌进行3D生物打印是一种新兴技术。
- 该方法允许构建工程化的生物膜。
- 它利用了廉价的自制3D打印机。
- 应用包括开发新的抗菌疗法。
研究目的
- 创建可重复的模型生物膜。
- 促进抗菌疗法的开发。
- 展示使用各种兼容细菌的3D打印的多功能性。
使用的方法
- 海藻酸盐基生物墨水的制备。
- 3D打印机Z轴的校准。
- 打印基底的标准程序。
- 生物膜形成的验证方法。
主要结果
- 成功打印图案化生物膜。
- 证明了与各种细菌的兼容性。
- 建立了模型生物膜的可重复性。
- 为生物膜工程提供了一种经济有效的解决方案。
结论
- 该方法增加了3D生物打印技术的可及性。
- 它为抗菌疗法研究开辟了新途径。
- 鼓励进一步优化打印过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables reproducible, engineerable biofilm model systems for antibacterial therapeutic development and environmental applications. By providing a low-cost, accessible platform for spatially-controlled biofilm fabrication, it supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery pipelines. The approach facilitates predictive confidence in biofilm-related mechanisms without requiring specialized bioprinting infrastructure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of biofilm formation mechanisms through inducible expression of matrix proteins like Curli.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of genetic and environmental factors influencing biofilm stability and antibiotic resistance.
- Predictive Value: Provides quantifiable biofilm output via resistance to sodium citrate dissolution, enabling go/no-go decisions on target pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, spatially-patterned biofilm substrates for consistent compound screening against biofilm-associated phenotypes.
- Operational Value: Uses alginate-based bioink compatible with various bacteria, allowing assay adaptation across target strains without reformulation.
- Scalability: Enables multi-layered structure production with incremental Z-axis adjustments, supporting dose-response and time-course screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Produces biofilm models that mimic extracellular matrix-mediated antibiotic resistance, relevant for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Allows visualization of biofilm components (e.g., Curli fibers) via fluorescence imaging before and after matrix dissolution, confirming target engagement.
- Continuity: Supports progression from discovery-scale biofilm modeling to preclinical evaluation of antibiofilm agents.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for antimicrobial programs focusing on biofilm-associated tolerance.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by engineering biofilm-deficient strains and assessing structural integrity post-treatment.
- Screening: Delivers reproducible biofilm formats with quantifiable readouts (e.g., fluorescence, dissolution resistance) for high-content compound evaluation.
- Analytics: Enables comparison of biofilm formation across conditions via imaging and biochemical extraction, supporting data-driven prioritization.
- Translational Research: Connects in vitro biofilm models to preclinical validation by demonstrating matrix-dependent phenotypic resistance.
- Enterprise Reuse: Represents a modular, adaptable platform applicable across bacterial targets and biofilm-related indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in biofilm formation by linking genetic induction to matrix production and structural stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized bioink preparation and Z-axis calibrated printing, minimizing variability across runs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling biofilm model generation on low-cost, modified consumer-grade printers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying compounds that disrupt biofilm matrix without affecting planktonic growth.
Implementation Considerations
- Requires microbiological expertise for sterile bioink preparation and bacterial handling under biosafety guidelines.
- Depends on precise Z-axis calibration and synchronization of print head movement with syringe pump extrusion to maintain resolution.
- Necessitates standardization of substrate preparation (e.g., calcium chloride-agar plates) and induction timing for consistent biofilm protein expression.
- Adaptation to alternative bacterial strains may require optimization of inducer concentration and alginate concentration for viability and printability.
- Practical limitations include bioink softness and low toughness, which may restrict mechanical testing applications without further crosslinking or polymer modification.
