Name: 工程生物膜的三维造型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学习利用低成本3D打印机构建工程生物膜的方法，使用海藻酸盐生物墨水与细菌进行三维打印。该技术可创建可重复的模型生物膜，用于开发新型抗菌疗法，为生物膜工程研究提供经济高效的解决方案。

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本工作得到了AOARD基金（编号：FA2386-18-1-4059）、荷兰科学研究组织（NWO/OCW）纳米科学前沿项目以及NWO-NSFC先进材料项目（编号：729.001.016）的支持。作者感谢Ramon van der Valk和Roland Kieffer提供的实验协助。

1. 将商用3D打印机改装为3D生物打印机
<ol>
	<li>从商用3D打印机（材料表）的机架上拆下挤出机和加热器，并将控制这些部件的线路从主电路板上拔下（图1A）。由于控制打印机工作温度的传感器需要保持功能正常以与打印机软件通信，因此需从打印软件中移除在达到工作温度前延迟打印的算法。</li>
	<li>通过硅胶管（内径1 mm）将移液器吸头（200 µL吸头）连接至装有5 mL注射器的注射泵。将该移液器吸头安装到3D打印机的挤出头位置，以替代原有的挤出装置（图1B）。</li>
	<li>若需使用多种生物墨水，则应在打印机上安装额外的管路系统和移液器吸头。</li>
</ol>
2. 3D打印的基底制备
<ol>
	<li>在400 mL含有适当抗生素和诱导剂（此处为34 µg/mL氯霉素和0.5%鼠李糖）的LB培养基（Luria-Bertani broth）中，加入4 mL 5 M CaCl2溶液，并将该溶液与1% w/v琼脂混合。</li>
	<li>将20 mL LB-琼脂溶液分装至每个150 mm × 15 mm的培养皿中，在室温下将皿盖半开，干燥30分钟。 
	注意：此步骤可暂停，将打印基底于4 °C保存数天。</li>
</ol>
3. 生物墨水制备
<ol>
	<li>配制海藻酸钠溶液（3% w/v），加热至沸腾三次以灭菌。储存于 4 °C 待用。</li>
	<li>在含有 34 µg/mL 氯霉素和 0.5% 鼠李糖的 50 mL LB 培养基中，37 °C、250 rpm 振荡过夜培养携带质粒 pSB1C3-绿色荧光蛋白（GFP）（组成型 GFP 表达）2 或 pSB1C3-GFP-CsgA（组成型 GFP 表达，鼠李糖诱导型 CsgA 表达）的 E. coli MG1655 PRO ΔcsgA ompR234（E. coli ΔcsgA）细菌。</li>
	<li>将菌液在 3,220 × g 离心 5 分钟，使细菌沉淀，弃去上清液。</li>
	<li>用 10 mL LB 培养基重悬细菌沉淀，并加入 10 mL 海藻酸钠溶液（3% w/v）。</li>
</ol>
4. 3D 打印过程
<ol>
	<li>在计算机上安装并打开 3D 打印软件（材料表），将 3D 打印机连接至计算机。通过点击 X、Y 和 Z 轴的归位按钮，将打印头移至其初始位置&#160;。</li>
	<li>每次打印时，将准备好的打印基材放置在打印平台上的特定位置。</li>
	<li>校准打印头在 Z 轴方向的高度。
	<ol>
		<li>在手动控制下将打印头抬升至 22&#160;mm 高度，以确保其在移动至目标位置时不会与培养皿边缘发生碰撞。将打印头移至培养皿上方，并向下移动直至移液管尖端接触打印表面。将此 Z 轴位置设定为 Z1（即打印表面高度）。</li>
		<li>抬起打印头，并通过手动控制在 X、Y 和 Z 轴方向将其移出培养皿区域。若将打印头与培养皿表面之间的工作距离定义为 Z2，则在打印程序中输入 Z1 + Z2 作为打印时的 Z 值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据预期轨迹，采用自主开发的逐点坐标确定法对打印形状进行编程。
	<ol>
		<li>若预期轨迹为直线，仅需定义起点和终点。在曲线路径上增加更多点可获得更平滑的曲线。手动依次将打印头移动至各点，并按顺序记录这些点的坐标。将所有坐标以及每段打印路径的打印头移动速度输入 G 代码编辑器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在打印前后，均应将打印头抬升至高于培养皿边缘的距离（20 mm），并直接移出培养皿区域。将该程序保存为 G 代码文件，供后续打印直接调用，但每次更换新的打印基材时需重新测量 Z 轴高度。 
	注：参见 表 1 中打印正方形的 G 代码示例。</li>
	<li>加载预编程的 G 代码文件。在软件中打开 G 代码编辑器，并输入用于打印目标形状的指令。在每一行指令中，可更改打印头在 X、Y 和/或 Z 轴的位置。在所有打印步骤中输入的 Z 值应为 Z1 + Z2（打印表面高度 + 工作距离）。 
	注：移动速度也可调节；9,000 mm/min 是典型打印速率下的合适值。</li>
	<li>将液态生物墨水装入注射器，并将其安装至 3D 生物打印机的注射泵中。</li>
	<li>点击 打印 按钮，将生物墨水打印至打印基材上。</li>
	<li>打印过程中，完全通过软件控制打印头的移动。在打印头接触打印表面之前，手动启动注射泵。 
	注：注射泵与打印机的协同操作需根据挤出速度、打印头移向首个打印点的速度以及打印头的初始位置经验性确定。若打印头初始位置为 20 mm，打印头速度为 9,000 mm/min，挤出速度为 0.1 mL/h，则应在开始打印后立即启动注射泵。若挤出速度由 0.1 mL/h 改为 0.3 mL/h，则应在开始打印后等待 2−3 秒再启动注射泵。</li>
	<li>当打印头到达最后一个打印点时，立即停止注射泵。在打印过程结束、打印头抬升前停止注射泵，否则多余的生物墨水会滴落在打印基材上，降低打印分辨率。</li>
	<li>为构建三维结构，需在 G 代码编辑器中控制打印头的所有移动。输入第一层的打印高度。第二层在 G 代码中将 Z 值增加 0.2 毫米以提高打印高度。此后，每上升一层 Z 值增加 0.1 毫米。打印过程中不得移动培养皿。</li>
	<li>为测量打印出的水凝胶的宽度和高度，可将钢尺置于样品下方或旁边进行测量。</li>
</ol>
5. 生物膜生成能力的培养与有效性检测 E. coli
<ol>
	<li>将打印样品在室温下孵育3−6天，以促进生物膜组分（纤维素纤维）的生成。使用相机或荧光扫描仪对平板进行成像。</li>
	<li>为溶解海藻酸盐基质，向打印基底中加入20 mL 0.5 M柠檬酸钠溶液（用NaOH调节pH至7），在室温下以30 rpm振荡孵育2小时。弃去液体后再次对平板成像，并与柠檬酸钠处理前的图像进行比较。</li>
</ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+material+design+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li>
<li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+of+Patterned%2C+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li>
<li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li>
<li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287(2017).</li>
<li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Polyhydroxyalkanoates%2C+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers%2C+in+Bacteria+and+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li>
<li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+fermentative+production+of+poly%28lactate-co-glycolate%29+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li>
<li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860(2017).</li>
<li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria-based+self-healing+concrete%5BTitle%5D)+AND+%22Heron%22%5BJournal%5D)">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li>
<li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+bacteria+to+make+improved%2C+nacre-inspired+materials%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Advances%22%5BJournal%5D)">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li>
<li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li>
<li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li>
<li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li>
<li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li>
<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li>
<li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li>
<li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materiomics%3A+biological+protein+materials%2C+from+nano+to+macro%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%2C+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li>
<li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li>
<li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li>
<li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li>
<li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li>
<li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthcare-associated+infections%2C+medical+devices+and+biofilms%3A+risk%2C+tolerance+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的工程化生物膜3D打印方案包含两个关键步骤。首先是制备琼脂打印表面，这是决定打印分辨率的关键因素。必须确保打印表面平整，并将打印头上的移液管尖端与表面保持在合适的高度。如果表面不平整，打印过程中的工作距离会发生变化。当工作距离小于0.1 mm时，CaCl2溶液可能进入移液管尖端内部，导致水凝胶形成，从而使移液管堵塞；当工作距离大于0.3 mm时，则无法连续打印凝胶。本研究中的最佳工作距离为0.2 mm。制备平整琼脂打印表面的有效方法包括：使用直径较大的培养皿（150 mm直径培养皿而非90 mm直径培养皿）、将培养皿放置在平坦的桌面上、以快速且均匀的速度倾倒琼脂溶液，并在琼脂凝固过程中避免移动培养皿。
第二个关键步骤是选择理想的打印参数，包括泵送速度、所用生物墨水的黏度以及打印头速度，这些参数决定了最终的打印分辨率。为了高效地选择这些参数，用户可以在恒定的挤出速率下，选取若干个打印头速度的极端值进行测试，并记录每种条件下打印出的水凝胶的宽度。然后，再用另外4种不同的挤出速率重复该实验。接下来，选取产生最佳打印分辨率的五组参数组合，并逐步缩小泵送速度和打...

由于对空间图案化材料的市场需求不断增长，目前迫切需要开发环境友好且可持续的制备方法1。本文介绍了一种简单且经济的方法来制备此类材料，因而具有广泛的应用前景。该方法可利用含有活菌的生物墨水实现空间图案化结构的三维（3D）打印。打印后的结构中细菌可保持活性超过一周，从而能够执行天然或经基因工程改造的代谢活动。通过这种方式，打印的细菌可在结构内部生成并沉积所需组分，例如形成具有功能性的交联生物膜2。
传统先进材料的制备方法通常需要消耗大量能量（例如高温和/或高压），并可能产生大量化学废料，这些废料往往是需要高昂成本进行处理的有毒物质3,4。相比之下，多种细菌能够生产出可广泛应用于不同工业领域的材料。这些材料包括聚羟基脂肪酸酯（PHA）5、聚（乙交酯-共-丙交酯）（PGLA）6等聚合物、细菌纤维素7、细菌混凝土材料8、仿生复合材料9、基于淀粉样蛋白的粘合剂10以及生物基电控开关11等。此外，细菌生产这些高价值材料通常在接近常温常压的水相环境中进行，无需使用或产生有毒化合物。尽管已有文献报道并出现了一些工业应用实例12,13，但如何实现此类材料的空间可控图案化仍是一个挑战。
本文展示了一种简单直接的方法，可将低成本的商用3D打印机改装为3D细菌打印机。该实验方案详细说明了如何制备含有并维持活细菌存活的生物墨水，以及如何准备适用于3D打印的基底材料。该方法适用于多种能够产生物质的天然或工程化细菌菌株。这些细菌可在3D打印结构中实现空间分布，并持续进行代谢活动，从而在结构中形成由细菌产生的目标物质的空间分布。
这种打印方法能够实现生物膜的增材制造，生物膜是由细菌及其自身产生的胞外基质组成的聚集体。生物膜是具有异质性的三维网络结构，其中蛋白质、聚合物、细菌细胞、氧气和营养物质均具有空间上的有序分布14。当处于生物膜形态时，细菌对抗生素的耐受性增强，并具有更强的结构稳定性，因此难以从医疗导管和植入物等表面彻底清除。生物膜特性的关键所在，同时也是生物膜研究面临的最大挑战，似乎是其结构的异质性15,16,17。制备空间结构可控的模型生物膜具有特殊意义，因为它将有助于重现或调控生物膜组分的空间分布模式，从而促进对生物膜在自然界几乎所有表面上稳定附着机制的理解。
本文介绍了一种利用含有工程化 E. coli 细菌的3D打印水凝胶制备生物膜的方法，这些细菌在诱导剂存在下可产生生物膜蛋白，同时介绍了验证生物膜形成的相应方法2。这些生物膜的主要胞外基质成分为含有自组装CsgA蛋白的curlin淀粉样纤维18。当工程化 E. coli 细菌被诱导表达CsgA蛋白时，会形成稳定的模型生物膜，保护细胞不被从打印表面冲刷掉。此类3D打印生物膜具有空间可控性，可作为研究多尺度生物膜结构-功能力学或材料组学19 的有用研究工具。这些定制化生物膜将有助于理解生物膜形成的原理及其力学特性，推动对耐药机制等其他应用领域的进一步研究。

<table><tbody><tr><td>3D 打印机</td><td>CoLiDo</td><td>3D-P Kit</td><td></td></tr><tr><td>3D 打印软件</td><td>CoLiDo</td><td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3886.1</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>型号 3500</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>150 × 15 mm</td></tr><tr><td>鼠李糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83650</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>DENE 3100103/25</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>ProSense B.V.&amp;nbsp;</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸一钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71498</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>VWR</td><td>28244.295</td><td></td></tr></tbody></table>

使用自制生物打印机对工程化生物膜进行三维图案化

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

生物膜是由细菌聚集形成的群落，其内部细菌被自身产生的具有空间结构的胞外基质所包裹。生物膜中的细菌对抗生素的耐受性显著增强，这可能带来潜在的健康风险，但在某些环境应用中也具有积极意义，例如用于饮用水净化。为了进一步开发抗菌治疗手段以及受生物膜启发的功能材料，亟需建立可重复、可调控的生物膜构建方法。近期已开发出一种利用改造的三维（3D）打印机结合细菌墨水制备生物膜的新方法。本文详细描述了构建这种高效、低成本3D生物打印机的步骤，该设备在细菌诱导的材料加工领域具有多种应用前景。该方案基于一台经过改造的商用3D打印机，其挤出装置已被替换为连接至注射泵系统的生物墨水分配装置，从而实现对生物墨水流速的精确控制和连续供给。为制备适用于生物膜打印的生物墨水，将基因工程改造的Escherichia coli细菌悬浮于海藻酸钠溶液中，使其在接触含钙表面时迅速固化。在打印基底中加入诱导剂化学物质，可驱动打印后生物墨水内生物膜相关蛋白的表达。该方法能够实现由多层生物膜构成的多种三维空间结构的打印。此类具有空间可控性的生物膜可作为模型系统，在多个对社会具有广泛影响的领域中得到应用，包括抗生素耐药性防控和饮用水净化等。

成功进行生物膜3D打印的第一步是将商用3D打印机改装为生物打印机。该改装通过移除专为聚合物墨水打印设计的打印机挤出装置和加热器，并替换为适用于含有活细菌的生物墨水打印的组件来实现（图1A）。挤出装置被替换为连接至注射泵的管路系统，并在其末端安装移液枪头（若打印过程中需使用多种生物墨水，则可安装多个枪头）（图1B）。改装是否成功，可通过生物墨水是否能够从注射泵经管路系统和枪头准确转移至打印表面，且无泄漏或受热现象来评估。若在打印过程中因生物墨水流过导致管路膨胀，可更换为管壁更厚的管路。需要注意的是，该打印技术应适用于任何可将管路连接至打印头的商用3D打印机。
3D 生物打印机可打印出多种二维（2D）和三维（3D）形状的包埋细菌的水凝胶（图2）。打印基底中的钙离子可在打印过程中诱...

本文介绍了一种将低成本商用3D打印机改造为细菌3D打印机的方法，该设备可用于打印具有特定图案的生物膜。文中详细描述了生物打印机和生物墨水制备所需的所有关键步骤，以及用于评估生物膜形成效果的验证方法。

生物膜是嵌于细菌自身产生的具有空间结构的胞外基质中的细菌聚集体。生物膜内的细菌会形成增强的……

利用细菌进行3D生物打印是一种新近开发的技术。本方案提供了一种简便的方法，用于构建由细菌3D打印而成的工程化生物膜。该技术的主要优势在于能够使用低成本的自制3D打印机制造3D打印的生物膜。我们3D打印机的一个可能应用是创建可重复的模型生物膜，用于开发新的抗菌疗法。我们的3D打印方法可适用于任何与基于海藻酸盐的生物墨水相容的细菌类型。生物墨水和打印基底的制备是相对标准的操作流程，而3D打印过程，特别是Z轴的校准，是需要一定实践经验的关键步骤。设定喷嘴高度的校准将影响我们3D打印机的分辨率，且高度依赖于个人经验。该操作需要手动调整，难以用书面形式准确描述。将200微升移液器吸头连接到一段硅胶管上，并将该移液器吸头安装至3D打印机的挤出头上，以替代原有的挤出装置。接下来，将4毫升5摩尔的氯化钙溶液加入400毫升溶于LB肉汤的1%琼脂中，并补充适当的抗生素和诱导剂。然后，将20毫升LB琼脂溶液分装至每个150毫米×15毫米的培养皿中。在室温下将培养皿盖半开，干燥30分钟。制备3%的海藻酸钠溶液，并加热至沸腾三次以灭菌。然后将无菌溶液储存在4摄氏度，直至使用。为制备生物墨水的细菌组分，将携带组成型表达GFP质粒的大肠杆菌在含有抗生素的50毫升LB培养基中培养。将培养物在37摄氏度、250 RPM条件下振荡培养过夜。培养过夜后，在3,220 ×g离心5分钟收集细菌沉淀，并弃去上清液。用10毫升LB培养基重悬细菌沉淀，然后加入10毫升3%海藻酸钠。将3D打印机连接到计算机，并打开3D打印软件。点击X、Y和Z轴的“归位”按钮，使打印头移动到初始位置。每次打印时，将准备好的打印基板放置在打印平台的特定位置上。在手动控制下将打印头抬升至超过 22 毫米的高度，以避免其在移动过程中与培养皿边缘发生碰撞。将打印头移至培养皿正上方，并向下移动，直至移液管尖端接触打印表面。将此 Z 轴位置设定为 Z1，即打印表面的高度。接下来，抬起打印头并手动将其移至培养板区域之外。如果打印头与培养板表面之间的工作距离定义为 Z2，则在打印程序中将打印表面高度加上工作距离作为打印时的 Z 值输入。加载包含打印目标形状指令的预编程 G 代码文件。在每个命令行中，可改变打印头在 X、Y 和/或 Z 轴上的位置。在所有打印步骤中，务必输入 Z 值，该值应为打印表面高度加上工作距离。将液态生物墨水装入注射器，并将其安装到 3D 生物打印机的注射泵中。然后，将挤出速度设置为 0.3 毫升每小时。通过单击“打印”按钮，将生物墨水打印到打印基材上。在打印开始后、打印头接触打印表面之前，再启动注射泵。打印过程中，完全通过软件控制打印头的移动。当打印头到达打印终点时，立即停止注射泵，否则多余的生物墨水会滴落在打印基底上，降低打印分辨率。对于三维结构的构建，打印头的所有移动均由G代码编辑器控制。为了增加第二层的打印高度，输入第一层的打印高度，并在代码中将 Z 值增加 0.2 毫米。此后，每升高一层，Z 值增加 0.1 毫米。将打印后的样品在室温下孵育三至六天，以促进生物膜组分（如 Curlin 纤维）的生成。然后，将培养板置于荧光扫描仪上成像。为溶解海藻酸盐基质，向打印的基质中加入 20 毫升 pH 7 的 0.5 摩尔柠檬酸钠溶液。在室温下孵育培养板，同时以 30 转/分钟振荡 2 小时。然后，弃去液体，再次对平板进行成像，以与柠檬酸盐处理前后的平板图像进行比较。3D生物打印机能够制造出包埋细菌的水凝胶，形成多种二维和三维结构。这些打印结构可用于评估生物膜的形成是否成功，或通过柠檬酸钠溶液是否已完全溶解海藻酸盐基质。对于不含可诱导Curli生成质粒的生物墨水，经柠檬酸钠处理后，打印图案完全溶解，表明未形成生物膜Curli网络。含有可诱导Curli生成质粒的细菌在经过柠檬酸钠处理后未被溶解，说明打印的细菌能够形成足够广泛的Curli网络，从而稳定细菌的打印图案。为了构建多层结构，可通过控制G代码编辑器打印额外的层。增加样品的打印层数会导致打印结构的宽度和高度逐步增加。当将经基因工程改造后可诱导表达Curli蛋白的大肠杆菌（E.coli）打印成多层结构时，柠檬酸钠处理不会使样品溶解；而含有非Curli蛋白表达型大肠杆菌的多层结构则会被溶解。3D打印过程中最关键的步骤是Z轴的校准，以及打印启动与注射泵启动之间的协调。为此工艺开发的生物墨水相对较软，韧性较低。可对生物墨水进行进一步改性，以提供并改善其机械稳定性。该3D打印技术能够制备具有优异机械性能的生物膜，有望用于制造仿生材料。处理这些细菌时，应佩戴适当的防护装备，例如手套。

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