利用人诱导性多能干细胞来源的肠道类器官研究并调控上皮细胞对损伤的防护作用 沙门氏菌 及其他病原体

本方案展示了利用干细胞来源的肠道类器官系统模拟肠道病原体对上皮细胞侵袭的过程，并通过细胞因子对该过程进行调控。显微注射技术可将目标病原体直接递送至类器官的管腔内，更接近体内感染的真实过程。该方法可应用于研究不同的肠道病原体或感兴趣的其他细胞因子。

我建议仅使用酚红进行一次试验性操作，以在使用病原体之前熟练掌握显微注射技术。在第2天，通过更换为10毫升干细胞培养基（添加生长因子）开始诱导分化。在第6天，将培养基更换为10毫升RPMI-B27培养基，添加6微摩尔CHIR99021和3微摩尔视黄酸，以启动后部内胚层向后肠的模式形成。

在分化第10天，将后肠嵌入基底膜基质中。首先，从后肠培养板中移除培养基，并用无钙镁的DPPS洗涤一次。向培养板中加入5毫升胶原酶溶液，在37°C下孵育5分钟。

接下来，向培养板中加入5毫升类器官基础生长培养基以灭活胶原酶。此时后肠细胞应处于悬浮状态。将后肠细胞悬液收集至15毫升锥形管中。

然后在240 × g条件下离心1分钟。离心后，用移液器吸去上清液，加入10 mL类器官基础生长培养基，通过轻柔吹打将后肠组织分散成更小的片段，再在95 × g条件下离心1分钟。用类器官基础生长培养基将细胞洗涤两次。

将细胞重悬于300至500微升的基础培养基中，并取约100微升该溶液加入到1.5毫升的基底膜基质中。将24孔板置于37摄氏度的板式加热器上，取60微升后肠细胞-基质混合物点种至24孔板的一个孔中。

静置片刻，于显微镜下观察其密度。将剩余基质液点样至24孔板后，将培养板置于37°C孵育10分钟。随后向24孔板的每孔中加入800 µL含有生长因子的基础生长培养基。

传代类器官时，首先移除其培养基，并每孔加入500微升细胞解离液。在4摄氏度下孵育40至50分钟，此时类器官应悬浮于溶液中。轻柔地将类器官和细胞解离液用移液器转移至15毫升锥形管中，注意尽量不要破坏类器官结构。

让类器官静置三到五分钟，随后去除上清液和单细胞。用五毫升基础生长培养基重悬类器官，并轻轻吹打洗涤。以95 × g离心两分钟。

接下来，在生物安全柜内将24孔板置于37摄氏度的板式加热器上，移除类器官沉淀中的上清液。然后使用P1000移液器将类器官重悬于300至500微升的基础生长培养基中，以将类器官分散成较小的团块。取约100微升类器官悬液加入到1.5毫升基底膜基质中，并轻轻吹打混匀。

将60微升基底膜基质点样至24孔板的一个孔中。静置30秒使其凝固后，在显微镜下检查其密度。将剩余基质点样至24孔板的其他孔中后，将该板置于37摄氏度培养箱中孵育10分钟，然后根据实验方案加入800微升含生长因子的基础生长培养基覆盖于表面。

进行重组人IL-22预刺激的显微注射实验时，应在注射前18小时将重组人IL-22加入培养基中，使其终浓度为100纳克/毫升。将含有类器官的显微注射培养皿置于显微镜载物台上，打开盖子，调节类器官至清晰对焦状态，准备开始注射。打开注射仪和操纵臂控制装置的电源。

确保注射器的压力设置为600千帕，注射时间为0.5秒。如果注射器尚未从显微镜载物台移开，应旋转注射臂使其移开，并卸下其夹持头。用钻头钝端轻轻夹住，吸取10 µL的接种液。

将钻头尖端插入夹持头中，并重新将其连接到显微注射臂上。轻柔移动注射臂，使针头位于显微注射培养皿上方一至两厘米处。使用臂控装置将针头尖端定位在培养皿中央，然后缓慢下降，直至针尖刚好接近培养基表面。

编程臂控工作站，使所有注射完成后将针头返回此位置。将显微镜聚焦于类器官，并选择待注射的目标。将针头置于待注射类器官的右上方，然后将针头向下并向侧方移动，插入类器官腔内。

按下显微注射仪上的注射按钮，使含酚红染色的细菌混合物从针尖渗出，对每个类器官注射三次。当所有需要注射的类器官完成注射后，将显微注射板从载物台上取下，盖上盖子，并在37摄氏度下孵育90分钟。

孵育结束后，吸除培养基，加入三毫升细胞解离液。然后在4°C孵育45分钟。接着，将类器官和细胞解离液轻柔转移至含有五毫升DPBS的15毫升锥形管中。

以 370 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，加入 1 毫升含有 0.1 毫克/毫升庆大霉素的基础生长培养基。接着，使用 P1000 移液器上下吹打约 50 次，以分散类器官。

加入四毫升培养基，37摄氏度孵育一小时，以杀灭细胞外细菌。接着，将类器官在370×g离心三分钟。吸除上清液，尽量减少残留。

用 DPBS 清洗类器官一次，再次离心。加入 500 微升裂解缓冲液，上下吹打约 50 次，以手动解离人肠道类器官。室温孵育 5 分钟后，用 DPBS 将所得溶液进行 10 倍系列稀释。

将未稀释和稀释的溶液分别用移液器吸取三滴（每滴20微米）加到预热的LB琼脂平板上。最后在37摄氏度下过夜培养，并进行菌落计数。将酚红细菌溶液显微注射至人肠道类器官中。

类器官对这种红色的保留可防止重复注射。利用重组人IL-22预处理源自COF-2细胞系的人肠类器官，可限制伤寒沙门菌SL1344侵入肠上皮细胞。感染后的类器官经免疫染色或透射电子显微镜处理，以利于观察宿主肠上皮细胞与细菌之间的相互作用。

可以从注射后的类器官中提取RNA，以分析感染引起的转录组反应。还可以使用荧光显微镜和电子显微镜更详细地观察宿主与病原体之间的相互作用。最重要的是要确保您已对显微注射仪进行了足够的练习，能够快速高效地完成注射，以获得一致的结果。

微注射钻头的尖端精细且锋利，在将其装入和卸下微注射器时应格外小心。该技术使得上皮细胞与病原体之间的相互作用能够以前所未有的细节水平进行研究。此感染模型将特别适用于研究人类特异性病原体的研究人员。