生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

该方法可用于分析某些分子在神经系统发育过程中对轴突导向和神经元迁移的作用。该技术的主要优势在于结果分析快速简便，无需使用复杂的软件，从而避免了研究人员需要接受大量培训的问题。演示该实验操作的将由我们实验室的技术员 Mirian Segura-Feliu 和我本人完成。

将200,000个COS-1细胞接种至35毫米的培养皿中，加入完全培养基，在细胞培养箱中孵育，使其在过夜后达到70%至80%的融合度。次日，使用基于脂质体的转染方法，将编码候选分子的DNA转染至COS-1细胞中。首先，在1.5毫升离心管中混合250微升无血清培养基与1至2微克DNA，在室温下孵育5分钟。

制备脂质体管时，加入 240 微升无血清培养基和 10 微升脂质体转染试剂，室温孵育 5 分钟。孵育结束后，将 DNA 管中的内容物加入脂质体管中。轻轻混匀，室温孵育 15 分钟。

将培养细胞中的培养基更换为1.5毫升无血清培养基。将DNA-脂质体混合物缓慢地逐滴加入细胞中。在二氧化碳细胞培养箱中孵育3小时。

孵育完成后，将培养基更换为完全培养基，并在培养箱中孵育过夜。次日，用0.1摩尔的Dulbecco磷酸盐缓冲液冲洗细胞。每皿加入800微升胰蛋白酶EDTA溶液，在二氧化碳培养箱中孵育5至15分钟。

将2毫升完全培养基中的悬浮细胞收集至15毫升离心管中，并加入10毫升相同培养基。在4摄氏度下以130 × g离心5分钟。弃去上清液，将含有COS-1细胞的沉淀物置于冰上保存。

制备胶原工作混合液后，取100至150微升胶原混合液加入转染细胞沉淀中，通过上下轻柔吹打混匀。将45至50微升胶原-细胞沉淀混合物铺于35毫米培养皿中，形成一条均匀的胶原细胞带，长度约为1至1.5厘米。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，直至观察到凝胶形成。

在第二个培养皿中准备另一条含有对照细胞的细胞条，并将其放入培养箱中。当凝胶完成后，向每个含有凝固胶原细胞条的培养皿中加入3至4毫升37摄氏度预热的COS-1完全培养基，并将培养皿放回培养箱中。使用精细的手术刀或组织切片器将胶原细胞条切割成小的方形片段，每边长度为400至500微米。

将来自相同转染条件的所有切片转移至一个含有3至3.5毫升神经元培养基的培养皿中。在解剖显微镜下检查组织块的质量，随后将培养皿放入培养箱中。使用剪刀从一只处死的妊娠雌性大鼠腹腔中取出胚胎，于胚胎发育第16.5天时剪下胚胎角，并将其放入盛有冷HBSSg缓冲液的大培养皿中。

将培养皿放入超净工作台中，使用直头镊子取出胚胎，并将其放入含有冷HBBSg的新培养皿中。用小镊子去除皮肤，然后使用弯头镊和直头镊小心解剖脑组织，并将其放入含有冷HBSSg的培养皿中。在解剖显微镜下，使用手术刀或精细剪刀沿中线将脑组织切成两半，以分离两侧大脑半球。

然后，去除间脑，并用精细镊子清除脑组织块上的脑膜和血管。使用100%乙醇清洗组织切片机的所有部件，特别是聚四氟乙烯（PTFE）切割板和刀片，并将组织切片机置于超净台内，在紫外光照射下静置15分钟。将每一块组织转移至组织切片机的切割板上。

组织切碎后，将其从盛有3至4毫升完全神经元培养基（NCM）的35毫米培养皿中转移。使用精细的钨针在完全NCM中完成组织的解剖。在解剖显微镜下检查所获得的组织切片质量，确保在暗场光学条件下各层结构清晰可辨，并用钨针分离出目标区域。

将质量良好的组织块置于完全培养基（NCM）中，并在二氧化碳培养箱中保存。与共培养体系制备相关的步骤中，视觉演示至关重要，有助于通过图示理解操作过程。在超净工作台内放置数个无菌的四孔培养板，并按前述方法配制胶原工作液混合物。

向每个孔的底部加入15至20微升水凝胶混合物，以形成圆形胶原基质。将培养皿放入培养箱中，直至观察到完全凝胶化，并检查凝胶化胶原的质量。

用移液器将一小块 COS-1 细胞聚集体转移至水凝胶基质上，然后用移液器将一块组织置于同一基质上，靠近细胞聚集体，间距约为一个外植体的大小。在冰上配制新的工作浓度胶原混合液后，轻轻吸取 15 至 20 微升该混合液，覆盖在外植体和细胞聚集体上，形成类似三明治结构的水凝胶培养体系。使用细钨针调整外植体的方向，使其面向细胞聚集体，距离保持在 500 至 600 微米。

将培养板放回培养箱，直至观察到凝胶形成，然后加入0.5毫升添加了2% B27补充剂的完全NCM，并在培养箱中继续培养36至48小时。当海马轴突遇到Netrin-1时，它们优先向Netrin-1来源方向生长，表明Netrin-1对这些轴突具有化学吸引作用。在对照条件下，即模拟转染组，所有轴突均呈放射状生长，无任何方向性偏好。

当海马轴突遇到分泌 Sema3E 的细胞时，大多数轴突朝远离细胞团聚的方向生长，表明 Sema3E 对这些轴突具有化学排斥作用。该轴突反应及定量方法的示意图显示，在对照条件下，轴突在近端和远端象限中的分布大致相等，表现为辐射状生长，表明近端-远端（PD）比值为 1。

当外植体近端象限的轴突数量多于远端象限时，表明存在趋化吸引作用，此时PD比值大于1；当远端象限的轴突数量多于近端象限时，表明存在趋化排斥作用，此时PD比值小于1。采用该方法，研究人员可获得有关某些分子在神经元发育过程中所起作用的关键信息，从而为深入探索其功能建立起点。

尽管该技术在神经元发育研究中具有重要作用，但也可作为策略应用于药物筛选、血管生成以及组织工程等领域。