Name: 生成基于3-D胶原蛋白的水凝胶,分析神经系统发育过程中的Axonal生长和行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学习利用三维胶原蛋白水凝胶分析轴突导向和神经元迁移的方法。该技术使用转染的COS-1细胞和大鼠胚胎脑组织，为神经发育研究提供快速简便的实验方案，无需复杂软件即可观察分子对轴突行为的影响。

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作者感谢 Tom Yohannan 提供的编辑建议以及 M. Segura-Feliu 提供的技术支持。本工作由 CERCA 计划以及加泰罗尼亚自治区创新、大学与企业部的大学与科研委员会（SGR2017-648）资助。本工作还获得了西班牙科研、创新与大学部（MEICO）通过项目 BFU2015-67777-R 和 RTI2018-099773-B-100、西班牙朊病毒网络（Prionet Spain AGL2017-90665-REDT）以及卡洛斯三世研究所 CIBERNED（PRY-2018-2）的资助。

所有动物实验均在巴塞罗那大学动物实验伦理委员会（CEEA）的指南和规程下进行，本研究中啮齿类动物使用的方案已通过巴塞罗那大学动物实验伦理委员会（CEEA）的审查和批准（CEEA批准编号 #276/16 和 141/15）。&#160;
1. 大鼠尾部胶原蛋白的纯化
<ol>
	<li>在遵循伦理准则处死动物后，收集成年 Sprague-Dawley 大鼠尾部（8–9 周龄），用 95% 乙醇冲洗。将 2–4 条尾部置于冰上（4 °C） &#176;C）并在操作过程中保持冰上覆盖。 &#160;</li>
	<li>为获取尾腱，使用止血钳夹住尾部最尾端的尾椎骨，并用第二把止血钳夹住距离第一把约5–7 mm处的尾部并施加压力。通过同时扭转两把止血钳使尾部断裂。操作时可反复折叠/展开尾椎骨数次，直至其断裂。</li>
	<li>用止血钳缓慢拉出椎骨，使肌腱随其鞘膜一并脱离。此时，用小剪刀剪断肌腱。将这些肌腱片段置于冰上预冷的无菌100 mm培养皿中保存。</li>
	<li>重复对尾部其余部分进行夹紧和滑动操作&#160;直到肌腱完全提取为止。</li>
	<li>对所有获得的尾部重复执行步骤 1.2–1.4。</li>
	<li>在显微镜下观察肌腱，使用小型剪刀剪除血管，并用直头精细镊子夹持以提高肌腱纯度，随后用超纯水冲洗肌腱3次。</li>
	<li>收集3-4 g湿肌腱。将肌腱溶于150 mL的3%冰醋酸中，4 ℃下搅拌过夜。 &#176;在200-250 mL玻璃锥形瓶中，于温和搅拌条件下孵育24-36 h。</li>
	<li>20,000 离心 x g 孵育1小时。同时，取一段长约10–15 cm的透析袋膜，将其置于含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的超纯水中煮沸15分钟，以进行预处理。随后，用超纯水彻底轻柔冲洗透析膜。</li>
	<li>离心后，通过倾注将上清液收集至透析袋膜中。沉淀物含有酸性不溶性物质（非胶原蛋白），上清液含有可溶性胶原蛋白。</li>
	<li>将上清液在2-5 L玻璃烧杯中用2 L无菌0.1×最低必需培养基伊格尔（MEM），pH 4.0进行透析，透析持续3天。每天至少更换0.1×MEM溶液两次，每次更换前需检测pH值。若pH变为碱性，加入数滴0.1 M乙酸调节至pH 4.0。</li>
	<li>透析后，向透析过的胶原溶液中加入抗生素（1.5 mL 青霉素/链霉素溶液，Pen-Strep）。将胶原原液分装为每份 5 mL，于 4 ℃ 保存。 &#176;C. 
	注意： 从此时起，所有操作步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。</li>
	<li>按照以下步骤对制备的胶原蛋白储备液进行凝胶化测试。
	<ol>
		<li>由于储存用胶原蛋白通常浓度过高，需用0.1x MEM（pH 4.0）将其稀释，配制三种工作浓度的稀释液（75%、50%和25%胶原蛋白溶液）。每种工作浓度溶液建议最终体积为5 mL。在每种条件下，使用蛋白质比色测定法检测蛋白质浓度。</li>
		<li>将若干个空的1.5 mL锥形离心管（每个工作稀释度对应一支）、10x MEM溶液管、7.5%碳酸氢钠溶液以及不同工作浓度的胶原蛋白置于冰上。等待上述试剂冷却。</li>
		<li>加入40-50 &#181;L 的 10 倍浓缩 MEM 加入冷（4 ℃）的 &#176;C）离心管。接着，轻轻混入 7-8 &#956;L 碳酸氢钠溶液</li>
		<li>加入 310–330 &#956;L 的不同胶原稀释液加入该离心管中，用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。将胶原-MEM-碳酸氢钠混合液置于冰上（4℃）保存。 &#176;C）至少 5 分钟。</li>
		<li>移液10-25 &#956;将混合物的 L 加入 35 mm 培养皿中。</li>
		<li>将培养皿放入 CO2 37℃培养箱 &#176;C，直至羟凝胶凝胶化（&#177; 15-20 分钟）内观察到。</li>
		<li>在不同的培养皿中，对剩余的胶原蛋白稀释液重复步骤 1.12.3–1.12.6。</li>
		<li>选择能够获得最佳结果的胶原工作稀释度。 
		注意： 最佳凝胶状态的水凝胶应具有均匀的半透明质地、灰色外观，且不应出现结块或纤维状结构。根据我们的经验，胶原蛋白与0.1×MEM以3:1的比例稀释可获得最佳实验结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在三维胶原蛋白水凝胶中制备可分泌候选分子的基因修饰细胞（COS1）聚集体
<ol>
	<li>接种 2 × 106&#160;将 COS1 细胞接种至 35 mm 培养皿中，并加入完全培养基（含 10% (vol/vol) 热灭活胎牛血清、0.5% (wt/vol) 谷氨酰胺和 1% (wt/vol) 青霉素-链霉素的 100 mL D-MEM）进行培养&#160;孵育箱，以在过夜时间内达到70-80%的融合度。每个转染步骤准备一个培养皿。</li>
	<li>次日，使用基于脂质体的转染方法，按照制造商说明书将编码候选分子（Netrin-1 或 Sema3E）的 DNA 转染至 COS1 细胞中。
	<ol>
		<li>为此，混合 250 &#181;无血清培养基 L 和 DNA（1-2 &#956;每种条件取 g，加入 1.5 mL 离心管（DNA 管）中并混匀。室温（RT）孵育 5 分钟。另取一管（脂质体管），加入 240 &#181;无血清培养基的 L 和 10 &#181;L 脂质体转染试剂，室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>孵育后，将DNA管中的内容物加入脂质体管中，轻轻混匀。室温下孵育15分钟。将培养细胞中的培养基更换为1.5 mL无血清培养基，并将DNA-脂质体混合物缓慢逐滴加入培养皿中。在CO₂2 细胞培养箱</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染孵育3小时后，将培养基更换为完全培养基，并在培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>次日，用 0.1 M Dulbecco 磷酸盐缓冲液（D-PBS）冲洗细胞，以胰蛋白酶-EDTA（800 &#181;每皿 L，于 CO 中孵育 5–15 分钟2 孵育箱）并用15 mL完全培养基收集悬浮细胞。</li>
	<li>在 4 ℃ 条件下离心细胞 &#176;C 在 130 x g 离心5分钟。离心后弃去上清液，将含有COS1细胞的沉淀置于冰上保存。</li>
	<li>重复步骤 1.12.3–1.12.6 以制备胶原工作混合液。</li>
	<li>加入100–150 &#956;将 1 毫升胶原混合物加入转染细胞沉淀中，轻轻吹打混匀，然后铺加 45–50 &#181;将该混合物的 L 加入培养皿（直径 35 mm）中，形成长度约为 1–1.5 cm 的均匀胶原-细胞条带。将培养皿置于 37 ℃ 培养箱中 &#176;C（5% CO₂）2）直至凝胶化（&#177; 15-20 分钟）内观察到。</li>
	<li>在第二个培养皿中准备一条含有对照细胞（空载转染）的条带，并将其放入培养箱中培养（&#177; 15-20 分钟），待凝胶化完成后加入 3-4 mL 预热（37 &#176;C）向每皿含有凝胶化胶原-细胞条的培养物中加入COS1完全培养基，并置于CO₂培养箱中培养2 细胞培养箱。随后，将胶原-细胞条切割成小的方形片段（400 至 500） &#181;使用精细的手术刀或组织切片机切割成约 m 长的片段。</li>
	<li>将相同转染条件下的所有切片转移至含有 3–3.5 mL 神经元培养基（NCM）的培养皿中，并在解剖显微镜下检查切片质量。再次将其置于 CO2 细胞培养箱 
	注意： 神经元培养基由含1-5%（体积比）热灭活马血清、2 mM谷氨酰胺、0.5%（重量/体积）葡萄糖、1%（重量/体积）青霉素-链霉素溶液和0.044%（重量/体积）NaHCO₃的Neurobasal培养基组成。3确保 pH 值在 7.2–7.3 之间。</li>
</ol>
3. 胚胎外植体的制备与培养
<ol>
	<li>按照常规灭菌指南，通过高压灭菌法对手术器械（剪刀、手术刀片刀柄、直头和弯头镊子）进行灭菌。同时准备 500 mL 的 Hank’s 平衡盐溶液-葡萄糖缓冲液（HBSS-G），以及 4–5 个直径为 100 mm 的培养皿，每个培养皿中加入 10 mL HBSS-G。将这些培养皿置于冰上（4 °C）。</li>
	<li>在无菌区域外，按照批准的伦理操作程序处死妊娠雌性大鼠（胚胎第 16.5 天）。用剪刀从腹腔中取出胚胎子宫角，并将其放入盛有冷 HBSS-G 的大培养皿中。</li>
	<li>将培养皿放入超净工作台中，用直头镊子取出胚胎，并转移至另一个盛有冷 HBSS-G 的新培养皿中。接着，使用小镊子去除胚胎的皮肤，并用弯头和直头镊子小心分离脑组织，然后将其放入盛有冷 HBSS-G 的培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用手术刀或精细剪刀沿中线将脑组织切成两半，以分离两侧半球，并用精细镊子去除脑组织块中的间脑、脑膜和血管。</li>
	<li>对剩余的胚胎重复步骤 3.3–3.4&#160;。为保持组织质量，解剖过程不应超过 2 小时。</li>
	<li>用 100% 乙醇彻底清洁组织切片机的所有部件（特别是聚四氟乙烯（PTFE）切割板和剃刀刀片）。将组织切片机置于超净工作台内，在紫外灯下照射 15 分钟。</li>
	<li>将每一块组织（例如皮层连同海马）转移至组织切片机的切割板上。对于海马组织，应将其垂直于剃刀刀片放置，并切出厚度为 450–500 µm 的组织切片。</li>
	<li>准备多个直径为 35 mm 的培养皿，每皿加入 3–4 mL 完全神经元培养基（NCM），并将组织切片机切割板上的组织块转移至培养皿中。由于需分离多个感兴趣区域，可能需要使用多个培养皿。</li>
	<li>在完全 NCM 培养基中使用精细钨针完成组织的进一步解剖。在解剖显微镜下检查所获得切片的质量，确保在暗场光学条件下各层结构清晰可辨&#160;，并使用钨针分离出感兴趣区域（例如海马的 CA 区域）。弃去受损的切片。将海马外植体保留在完全 NCM 培养基中，并置于 CO2 培养箱内。</li>
</ol>
4. 胶原蛋白水凝胶中三维共培养的制备
<ol>
	<li>将多个无菌的4孔培养板放入超净工作台中，并按照之前步骤1.12.2-1.12.6所述配制胶原蛋白工作液。</li>
	<li>放置15-20 &#956;将适量的水凝胶混合物加入孔底部，形成圆形胶原基质。对剩余各孔重复此步骤。每次制备不超过五块培养板，以避免水凝胶基质中的液体过度蒸发。</li>
	<li>将培养皿置于培养箱中，直至完全凝胶化（&#177; 观察到凝胶化完成（约15–20分钟）后，方可将培养板从培养箱中取出。检查凝胶化胶原的质量。</li>
	<li>用移液管转移一小块 COS1 细胞聚集体，将其放置在水凝胶基质上，再用移液管将一块组织样本放置在相同基质上，紧邻细胞聚集体，间距约为一个外植块大小。</li>
	<li>在冰上按照步骤 1.12.2–1.12.6 制备新的工作用胶原蛋白混合液。</li>
	<li>轻轻吹打15-20次 &#956;将此新混合液的 L 加入并覆盖外植体和细胞团。此时可观察到类似三明治结构的水凝胶培养体系。随后，用细钨针重新调整外植体的方向（切勿触碰 COS1 细胞团！），使其朝向细胞团 &#177; 500-600 &#956;m.</li>
	<li>将培养板放回培养箱，直至观察到凝胶形成（&#177; 10–15 分钟），加入 0.5 mL 添加 2% B27 补充剂的完全 NCM，将培养物置于培养箱中（37℃）培养 36 至 48 小时 &#176;C，5% CO2).</li>
</ol>
5. 外植体-细胞团共培养物的固定及免疫细胞化学操作
<ol>
	<li>孵育 36–48 小时后，移除培养基，并用 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.3 洗涤。随后在 4 °C 条件下，用含 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.3 的 4% 多聚甲醛固定培养物 1 小时。</li>
	<li>移除固定液，并用 0.1 M PB（pH 7.3）轻轻冲洗培养物 3–4 次，每次 10–15 分钟。</li>
	<li>用刮勺或镊子将水凝胶夹心结构从孔板底部剥离。使用细毛刷将胶原块转移至含有含 0.5% 非离子型去垢剂的 0.1 M PBS 的 6 孔培养板中。</li>
	<li>将游离漂浮的水凝胶在封闭液（含 10% 血清、0.5% 非离子型表面活性剂和 0.2% 明胶的 0.1 M PBS）中于室温轻度振荡孵育 2–3 小时。</li>
	<li>用含 0.5% 非离子型表面活性剂的 0.1 M PBS 洗涤 3 次，每次 10–15 分钟。</li>
	<li>将一抗用含 5% 血清、0.5% 非离子型表面活性剂、0.2% 明胶和 0.02% 叠氮化钠的 PBS 稀释后进行孵育。在 4 °C 条件下于摇床上孵育一抗 36–48 小时。 
	注意：通常使用针对 III 类 β-微管蛋白（α-TUJ-1）的抗体（稀释比 1:2,000）来标记 3-D 水凝胶培养中的轴突生长。</li>
	<li>孵育结束后，参照步骤 5.5 进行洗涤。</li>
	<li>将二抗用含 5% 血清、0.5% 非离子型表面活性剂和 0.2% 明胶的溶液稀释后，在摇床上于室温孵育 4 小时（或在 4 °C 孵育 6–7 小时）。本实验中使用马抗小鼠生物素化抗体（稀释比 1:200）。</li>
	<li>参照步骤 5.5 的方法洗涤培养物。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，用含 5% 血清、0.5% 非离子型表面活性剂和 0.2% 明胶的 PBS 将亲和素-生物素复合物（ABC）溶液按 1:100 稀释后孵育培养物 2 天。或者，在相同缓冲液中使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（稀释比 1:300–400）。</li>
	<li>参照步骤 5.5 所述方法洗涤培养物。</li>
	<li>用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6）多次洗涤培养物，持续 1 小时。</li>
	<li>在 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6）中加入 0.03% 的 3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）溶液，孵育培养物。</li>
	<li>加入 5–8 µL 的 1% H2O2，静置 10–15 分钟。在显微镜下使用 4–10 倍物镜监测 DAB 显色反应进程。</li>
	<li>用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6）替换 DAB 溶液以终止反应。</li>
	<li>用 PBS 洗涤培养物 30 分钟（期间多次更换溶液）。</li>
	<li>使用水溶性封片剂将水凝胶封固于载玻片上。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件中的 Sholl 分析插件或 NeuriteJ 插件分析水凝胶内轴突的长度与分布30。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

发育中轴突的生长主要具有侵袭性，包括细胞外基质（ECM）的降解与重塑。通过本文所述方法，研究人员可以获得由天然I型胶原蛋白构成的均一三维基质，其中轴突（或细胞）能够对经基因修饰细胞分泌的化学梯度产生反应，如同在体内环境中的行为。可轻松比较轴突对吸引性或抑制性信号分子（蛋白质、脂类等）梯度的不同反应，并与特定对照（空载体转染细胞）进行比较。该方法的优势在于，肌腱易于分离，且通常可作为动物实验的残留组织而获得。此外，与其他组织（如皮肤或肺）相比，肌腱中I型胶原蛋白的浓度极高31。
尽管本文介绍的方法操作简单，但在实验过程中仍有一些步骤需要特别注意。在胶原蛋白提取过程中，必须彻底清除尾腱上的血管和皮肤碎片，以提高胶原蛋白的纯度和凝胶质量。此外，必须保持无菌条件，部分操作应在无菌超净工作台中进行，并在使用前对所有手术器械进行灭菌处理。同时，应严格控制溶液的pH值和温度条件。例如，若MEM 10x和碳酸氢盐溶液未达到最佳状态，胶原基质将无法均匀聚合，从而对轴突生长及实验结果产生不利影响。此外，若胶原原液浓度过高或过低，基质均不能正常凝胶化。根据...

神经元的轴突以轴突生长锥为末端，通过胚胎的细胞外基质（ECM）沿特定路径长距离迁移，以到达其正确的靶点。生长锥位于轴突的远端，具有感知细胞所处物理和分子环境的特化功能1,2。从分子角度来看，生长锥的导向至少依赖于四种不同的分子机制：由不同轴突导向信号分子触发的接触性吸引、化学吸引、接触性排斥和化学排斥3,4,5,6。接触介导的过程可在二维（2D）微图案化基底（例如含有分子的条带7,8或斑点9）的培养体系中部分观察到。然而，轴突还可通过感知环境中引导细胞释放的多种吸引性和排斥性分子，以非扩散方式导航至其靶点4,5,10。本文中，我们介绍一种简便的三维（3D）培养方法，用于检测某种分泌型分子是否对发育中的轴突产生化学排斥或化学吸引效应。
最早的研究所采用的轴突导向线索旨在利用三维（3-D）基质中的组织块培养来生成模拟体内条件的浓度梯度11,12。该方法结合体内实验，使得研究人员得以鉴定出四类主要的导向分子家族：Netrin、Slit、Semaphorin 和 Ephrin4,5,6。生长中的轴突整合这些分子信号及其他因素13，从而触发黏附复合物的动态变化，并通过细胞骨架转导机械力14,15,16。为了在三维培养体系中建立用于轴突导航的分子浓度梯度，早期研究者使用了血浆凝块基质17，该方法也曾用于器官型脑片制备18。然而，1958年，有研究报道了一种新的制备三维胶原蛋白水凝胶的方案，可用于Maximow装置19——一种适用于多种显微观察研究的培养平台20。另一项先驱性研究则报道了使用胶原凝胶包埋人成纤维细胞，以研究在伤口愈合过程中成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化21。与此同时，Lumsden和Davies应用牛皮来源的胶原蛋白分析神经生长因子（NGF）对感觉神经纤维导向的潜在作用22。随着不同公司和实验室开发出新的培养平台（例如多孔板），胶原蛋白培养体系也被适配于这些新型设备6,23,24,25,26。与此同时，源自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞系的细胞外基质（ECM）提取物也被商业化提供，以进一步拓展此类研究27。
近年来，已开发出多种利用三维水凝胶（如胶原蛋白、纤维蛋白等）生成具有轴突导向潜在作用的分子梯度的技术方案28。另一种方法是将候选分子以不同浓度固定在多孔基质中（例如NGF29），或通过在三维水凝胶的局部区域培养分泌该分子的细胞聚集体，从而形成径向梯度4,23,24,25,26。本实验方案将详细阐述最后一种方法。
本文介绍的方法是一种基于小鼠胚胎脑组织三维水凝胶培养中轴突生长分析的简便、快速且高度可重复的技术。与其他方法相比，该方案特别适合未经专门训练的研究人员，经过短期培训（1-2周）即可完全掌握。在本方案中，我们首先从成年大鼠尾部提取胶原蛋白，用于制备三维基质，随后将基因修饰的细胞聚集体与胚胎神经组织相对放置并进行共培养。这些细胞聚集体可形成候选分子的径向化学浓度梯度，从而诱导生长中轴突产生响应。最后，可通过相差显微镜直接观察，或 alternatively 采用免疫细胞化学方法，便捷地评估该分子对生长轴突的影响。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-四盐酸二氨基联苯胺10 mg片剂（DAB）</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>成年Sprague-Dawley大鼠（8至9周龄）&amp;nbsp;</td><td>Criffa-Credo，里昂，法国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>B27无血清添加剂50倍浓缩液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>双辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>cDNA质粒载体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS1细胞系</td><td>ATTC</td><td>CRL-1570</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>用于完全Neurobasal培养基的D-(+)-葡萄糖（水中45%溶液）</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>用于COS1培养基的D-MEM（Dulbecco改良Eagle培养基1倍）</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>用于细胞培养的Dulbecco&amp;rsquo;s磷酸盐缓冲液10倍浓缩液（不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;和Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）（D-PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>108543</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片介质（例如Fluoromount-G或类似产品）</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>明胶粉末&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸（Panreac，货号211008）</td><td>Panreac</td><td>211008</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>24020083</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>热灭活马血清&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，水中32至33%）</td><td>Sigma</td><td>316989</td><td></td></tr><tr><td>用于完全Neurobasal和COS1培养基的L-谷氨酰胺200 mM溶液（100倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>怀孕雌性小鼠（胚胎期12.5至16.5天；E12.5-16.5）&amp;nbsp;</td><td>Criffa-Credo，里昂，法国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>改良Eagle最低必需培养基（MEM）</td><td>Invitrogen</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>抗III类&amp;beta;-微管蛋白单克隆抗体（克隆TUJ-1）</td><td>Biolegend</td><td>801201</td><td></td></tr><tr><td>N-2添加剂100倍浓缩液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal培养基&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Merck</td><td>1,040,051,000</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液100倍浓缩液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-22</td><td></td></tr><tr><td>用于免疫细胞化学的磷酸盐缓冲液10倍浓缩液（PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>二抗：生物素化马抗小鼠抗体&amp;nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>无血清培养基（Opti-MEM）</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠&amp;nbsp;</td><td>Panreac</td><td>162712</td><td></td></tr><tr><td>7.5%碳酸氢钠溶液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养级H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>TritonTM X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma碱&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（含EDTA（1倍）的0.05%（wt/vol）胰蛋白酶）</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1把大号和1把小号弯剪用于解剖&amp;nbsp;</td><td>Fine Tools Instruments或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>Corning或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2把止血钳&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fine Tools Instruments或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2把小号直头解剖剪</td><td>Fine Tools Instruments或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于离心的200 mL离心管</td><td>Nalgene或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mL无菌玻璃锥形瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 L玻璃烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4孔和6孔培养板&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740 和 140675</td><td></td></tr><tr><td>自动移液泵及一次性含滤膜的10 mL和25 mL无菌塑料移液管</td><td>Gilson、Brand、Eppendorf或类似产品&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动移液器、无菌滤芯吸头和当前使用的无菌吸头&amp;nbsp;</td><td>Gilson、Eppendorf或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带固定角转子的台式微量离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf、Beckman Coulter或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带摆桶转子的台式制冷离心机（配有1.5、15和50 mL试管适配器）</td><td>Eppendorf、Beckman Coulter或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C、5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;和95%空气的细胞培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>透析管纤维素膜</td><td>Sigma</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>透析管封口夹&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z37101-7</td><td></td></tr><tr><td>一次性玻璃移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带暗场光学系统的解剖显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus SZ51或类似产品&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速制冷Beckman Coulter离心机或类似设备，带固定角转子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大号100 mm、60 mm和小号35 mm &amp;Oslash;细胞培养皿&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>&amp;nbsp;150679、150288 和 150318，分别对应</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器和磁力搅拌子</td><td>IKA或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>McIlwain组织切片机</td><td>Mickle Laboratory Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一对精细直头镊子和一对弯头镊子&amp;nbsp;</td><td>Fine Tools Instruments或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织切片机用刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀（15号和11号）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>两对精细刮勺，用于转移胶原蛋白和组织块</td><td>Fine Tools Instruments或类似产品</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

本方案利用天然I型胶原蛋白制备三维（3-D）水凝胶，用于监测和分析轴突生长。该方案的核心是将胚胎期或出生后早期啮齿类动物脑组织的小片段培养在由大鼠尾腱来源的I型胶原蛋白形成的三维水凝胶中，该水凝胶具有特定的孔隙率。将组织片段培养于水凝胶内，并与特定的脑组织片段或经基因修饰的细胞聚集体相对置，使其产生并分泌可在多孔基质中形成浓度梯度的分子。本方案步骤简单且可重复，但在实施过程中需谨慎考虑若干关键步骤。此外，在通过免疫细胞化学方法固定后，可直接利用相差显微镜或单光子/多光子荧光显微镜对生长中轴突的行为进行实时监测与分析。

本文介绍了一种易于实现的方法，用于研究小鼠胚胎神经系统在三维水凝胶胶原培养体系中的轴突生长。为此，我们从成年大鼠尾部提取胶原蛋白，构建三维胶原基质，并将表达Netrin-1或Sema3E的基因修饰细胞聚集体与胚胎神经组织（例如海马CA区）共同培养。这些细胞聚集体在胶原基质内形成了候选分子的径向分布梯度。最后，为了评估神经元对不同分子的反应，我们采用免疫细胞化学方法（如α-TUJ-1染色）对培养物进行标记，并结合一种简单易行的定量分析方法，获得了足够数据以确定候选分子对轴突行为的影响。
在我们的实验中，当海马轴突遇到Netrin-1时，这些轴突优先朝向Netrin-1的来源生长，表明Netrin-1对这些轴突具有化学吸引作用图1B）。相比之下，当海马轴突遇到分泌Sema3E的细胞时，大多数轴突朝向细胞团的相反方向生长，表明Sema3E对它们具有化学排斥作用（图1C）。在对照条件（模拟转染）下，所有轴...

本文提供了一种在三维基质中分析生长轴突行为的方法，以模拟其自然发育过程。

本方案采用天然I型胶原蛋白制备用于监测和分析轴突生长的三维（3-D）水凝胶。该方案是……

该方法可用于分析某些分子在神经系统发育过程中对轴突导向和神经元迁移的作用。该技术的主要优势在于结果分析快速简便，无需使用复杂的软件，从而避免了研究人员需要接受大量培训的问题。演示该实验操作的将由我们实验室的技术员 Mirian Segura-Feliu 和我本人完成。将200,000个COS-1细胞接种至35毫米的培养皿中，加入完全培养基，在细胞培养箱中孵育，使其在过夜后达到70%至80%的融合度。次日，使用基于脂质体的转染方法，将编码候选分子的DNA转染至COS-1细胞中。首先，在1.5毫升离心管中混合250微升无血清培养基与1至2微克DNA，在室温下孵育5分钟。制备脂质体管时，加入 240 微升无血清培养基和 10 微升脂质体转染试剂，室温孵育 5 分钟。孵育结束后，将 DNA 管中的内容物加入脂质体管中。轻轻混匀，室温孵育 15 分钟。将培养细胞中的培养基更换为1.5毫升无血清培养基。将DNA-脂质体混合物缓慢地逐滴加入细胞中。在二氧化碳细胞培养箱中孵育3小时。孵育完成后，将培养基更换为完全培养基，并在培养箱中孵育过夜。次日，用0.1摩尔的Dulbecco磷酸盐缓冲液冲洗细胞。每皿加入800微升胰蛋白酶EDTA溶液，在二氧化碳培养箱中孵育5至15分钟。将2毫升完全培养基中的悬浮细胞收集至15毫升离心管中，并加入10毫升相同培养基。在4摄氏度下以130 × g离心5分钟。弃去上清液，将含有COS-1细胞的沉淀物置于冰上保存。制备胶原工作混合液后，取100至150微升胶原混合液加入转染细胞沉淀中，通过上下轻柔吹打混匀。将45至50微升胶原-细胞沉淀混合物铺于35毫米培养皿中，形成一条均匀的胶原细胞带，长度约为1至1.5厘米。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，直至观察到凝胶形成。在第二个培养皿中准备另一条含有对照细胞的细胞条，并将其放入培养箱中。当凝胶完成后，向每个含有凝固胶原细胞条的培养皿中加入3至4毫升37摄氏度预热的COS-1完全培养基，并将培养皿放回培养箱中。使用精细的手术刀或组织切片器将胶原细胞条切割成小的方形片段，每边长度为400至500微米。将来自相同转染条件的所有切片转移至一个含有3至3.5毫升神经元培养基的培养皿中。在解剖显微镜下检查组织块的质量，随后将培养皿放入培养箱中。使用剪刀从一只处死的妊娠雌性大鼠腹腔中取出胚胎，于胚胎发育第16.5天时剪下胚胎角，并将其放入盛有冷HBSSg缓冲液的大培养皿中。将培养皿放入超净工作台中，使用直头镊子取出胚胎，并将其放入含有冷HBBSg的新培养皿中。用小镊子去除皮肤，然后使用弯头镊和直头镊小心解剖脑组织，并将其放入含有冷HBSSg的培养皿中。在解剖显微镜下，使用手术刀或精细剪刀沿中线将脑组织切成两半，以分离两侧大脑半球。然后，去除间脑，并用精细镊子清除脑组织块上的脑膜和血管。使用100%乙醇清洗组织切片机的所有部件，特别是聚四氟乙烯（PTFE）切割板和刀片，并将组织切片机置于超净台内，在紫外光照射下静置15分钟。将每一块组织转移至组织切片机的切割板上。组织切碎后，将其从盛有3至4毫升完全神经元培养基（NCM）的35毫米培养皿中转移。使用精细的钨针在完全NCM中完成组织的解剖。在解剖显微镜下检查所获得的组织切片质量，确保在暗场光学条件下各层结构清晰可辨，并用钨针分离出目标区域。将质量良好的组织块置于完全培养基（NCM）中，并在二氧化碳培养箱中保存。与共培养体系制备相关的步骤中，视觉演示至关重要，有助于通过图示理解操作过程。在超净工作台内放置数个无菌的四孔培养板，并按前述方法配制胶原工作液混合物。向每个孔的底部加入15至20微升水凝胶混合物，以形成圆形胶原基质。将培养皿放入培养箱中，直至观察到完全凝胶化，并检查凝胶化胶原的质量。用移液器将一小块 COS-1 细胞聚集体转移至水凝胶基质上，然后用移液器将一块组织置于同一基质上，靠近细胞聚集体，间距约为一个外植体的大小。在冰上配制新的工作浓度胶原混合液后，轻轻吸取 15 至 20 微升该混合液，覆盖在外植体和细胞聚集体上，形成类似三明治结构的水凝胶培养体系。使用细钨针调整外植体的方向，使其面向细胞聚集体，距离保持在 500 至 600 微米。将培养板放回培养箱，直至观察到凝胶形成，然后加入0.5毫升添加了2% B27补充剂的完全NCM，并在培养箱中继续培养36至48小时。当海马轴突遇到Netrin-1时，它们优先向Netrin-1来源方向生长，表明Netrin-1对这些轴突具有化学吸引作用。在对照条件下，即模拟转染组，所有轴突均呈放射状生长，无任何方向性偏好。当海马轴突遇到分泌 Sema3E 的细胞时，大多数轴突朝远离细胞团聚的方向生长，表明 Sema3E 对这些轴突具有化学排斥作用。该轴突反应及定量方法的示意图显示，在对照条件下，轴突在近端和远端象限中的分布大致相等，表现为辐射状生长，表明近端-远端（PD）比值为 1。当外植体近端象限的轴突数量多于远端象限时，表明存在趋化吸引作用，此时PD比值大于1；当远端象限的轴突数量多于近端象限时，表明存在趋化排斥作用，此时PD比值小于1。采用该方法，研究人员可获得有关某些分子在神经元发育过程中所起作用的关键信息，从而为深入探索其功能建立起点。尽管该技术在神经元发育研究中具有重要作用，但也可作为策略应用于药物筛选、血管生成以及组织工程等领域。

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生成基于3-D胶原蛋白的水凝胶,分析神经系统发育过程中的Axonal生长和行为

本文描述了一种制备由I型胶原和原代人成纤维细胞组成的三维基质的方法。这种类器官凝胶能够模拟组织间质的基本特征，适用于多种显微镜观察，因此是评估细胞侵袭性迁移的有用基质。...

三维环境中的细胞行为评估：可调节的I型胶原类器官培养检测平台

我们演示了如何分离和培养鸡胚第4天的前庭耳蜗神经节以及第6天的脊髓外植体。外植体在无血清条件下于三维胶原凝胶中培养24小时。通过添加生长因子的培养基以及包被蛋白质的微珠来检测神经突的反应性。...

鸡胚前庭耳蜗神经节和脊髓组织块在胶原凝胶中的分离培养及其用于神经突起生长实验

中脑多巴胺系统和纹状体的外植体被用于胶原基质实验，以研究 体外...

小鼠多巴胺能神经元和纹状体组织三维胶原基质培养物的分离与培养

本视频展示了一种在水凝胶微柱内生成三维星形胶质细胞支架的方法。微柱内部涂有胶原蛋白，将星形胶质细胞引入后，细胞会黏附于胶原蛋白上，并在进一步培养过程中自组装形成三维支架。...

一种在水凝胶微柱内体外生成星形胶质细胞支架的方法

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

深入了解大脑复杂的活动需要先进的研究工具。在此，我们展示了一种基于丝素-胶原蛋白的新型三维神经组织工程模型，其结构类似于大脑组织。该模型可用于研究神经元网络的组装、轴突导向、细胞间相互作用以及电活动。...

基于丝素蛋白-胶原的极化神经组织工程化三维模型

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

本文介绍了一种大鼠脑源性胶质细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）的三维培养方案。我们展示了原代细胞培养、甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶的合成、HAMA光聚合与细胞包封，以及用于共聚焦显微镜和扫描电子显微镜成像的样品处理方法。...

改进的原代胶质细胞三维水凝胶培养方法 体外 神经炎症建模

在本论文中，我们展示了含有石墨烯的生物杂化水凝胶生物墨水的制备方法，用于外周组织工程。利用这种3D生物杂化材料，实施干细胞的神经分化方案。这可能是将类似生物材料推向临床应用的重要一步。...

基于石墨烯的三维生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征及其在外周神经工程中的应用

本方案演示了使用沿流体流动方向具有变化几何结构的微流控通道，以产生拉伸应变（拉伸），从而在三维胶原水凝胶（&lt;250 µm...

微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

学习利用三维胶原蛋白水凝胶分析轴突导向和神经元迁移的方法。该技术使用转染的COS-1细胞和大鼠胚胎脑组织，为神经发育研究提供快速简便的实验方案，无需复杂软件即可观察分子对轴突行为的影响。

生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

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