使用新型锥形海绵尖电极记录幼年斑马鱼的视网膜电图

本方案有助于简化斑马鱼幼鱼视网膜电图（ERG）的测量，从而为视觉发育及遗传疾病模型提供重要的功能读出。本方案所用记录电极的软质海绵尖端可利用经济且易于获取的材料制备，避免对幼鱼眼睛造成潜在损伤。较柔软的海绵尖端电极可实现对同一只眼睛进行多次ERG测量。

初次接触该操作的研究人员可能会发现，在整个实验过程中使用的暗红色弱光照明下工作较为困难。但保持暗适应状态至关重要。准备锥形海绵记录电极时，需剪下铂电极导联延长线的一端，并使用手术刀从该延长线新端去除10毫米的外层聚四氟乙烯绝缘涂层。

截取一段40毫米长、直径为0.3毫米的银丝，将银丝与电极导线裸露的内芯缠绕，以牢固地将银丝连接至电极导线。用绝缘胶带包裹连接处，使约15毫米长的银丝保持裸露。将另一根导线连接至电池的负极，并将该导线的另一端浸入生理盐水中。

将暴露的银丝浸入生理盐水中，并将另一端连接至9伏直流电源的正极。60秒后，将银丝置于吸水纸上晾干。在此期间，将一块20毫米×20毫米的聚乙烯醇乙酸酯海绵剪成圆锥形，并用1倍林格缓冲液充分浸润海绵。

在带有目镜标尺的光学显微镜下，使用手术刀片将锥体尖端修整至直径约40微米。将锥形海绵置于吸水性滤纸上空气干燥，直至其变为固体状。在将银丝从锥体底部插入已干燥的固体锥形聚醋酸乙烯酯海绵之前，使用遮蔽胶带包裹任何暴露在外的多余金属部分，以绝缘并减少光伏伪影。

实验当天，将海绵头电极浸入林格氏液中15分钟，以充分饱和海绵。记录开始前至少8小时，将不超过20条斑马鱼幼鱼放入一个无盖的15毫升离心管中，用铝箔包裹后置于黑暗培养箱内。培养结束后，在发光二极管提供的微弱红光照射下，将暗适应的斑马鱼倒入培养皿中。

为制备海绵平台，裁剪一块聚乙酸乙烯酯海绵，其厚度大致等于35毫米培养皿的深度，以便海绵能紧密地放入培养皿中。在海绵一端垂直方向上切一个小口，用于容纳参比电极的银丝。将海绵浸入金鱼林格氏缓冲液中，直至海绵完全饱和。然后将海绵放入洁净的35毫米培养皿中，并用纸巾吸去多余液体，直至轻轻按压海绵时无液体渗出为止。

为进行实验，使用一支3毫米的巴斯德移液管将麻醉后的幼虫转移至一块3厘米×3厘米的纸巾上，并用镊子将纸巾放置在湿润的海绵上。用浸有林格氏液的细刷轻轻调整幼虫位置，使其一只眼睛朝上，并远离幼虫下方纸巾上的液体。在幼虫体表涂抹保湿眼用凝胶，以确保在整个视网膜电图记录过程中动物保持湿润。

将培养皿放置在法拉第笼内全视野碗状光源刺激器前方的一个小型水浴加热平台上。将参考电极插入平台海绵的切口中，并将一个 commercially-obtained 接地电极连接到法拉第笼上。

将记录电极连接至电极夹持器，并将夹持器固定在显微操作仪的立体定位臂上。使用一支3毫米的巴斯德移液管，向电极的海绵尖端滴加一滴林格氏液以重新饱和，并将显微镜置于法拉第笼内的眼电图平台上。用吸水纸轻轻吸去电极海绵尖端多余的液体，在显微镜下调整活性电极位置，使海绵尖端轻柔接触幼年斑马鱼眼睛的中央角膜表面。

然后将Ganzfeld碗移向海绵平台，注意确保幼鱼被碗完全覆盖，并关闭屏蔽笼以减少外界电磁噪声。斑马鱼幼体视网膜对微弱闪光的敏感性随年龄增长而增强。在受精后四天，当刺激强度低于-1.61 log 坎德拉·秒/平方米时，a波和b波尚不可识别；而在较老的幼体中，这些强度下已可检测到清晰的信号。

受精后第四天到第五天之间，b波振幅显著增加。在第七天时，2.48 log 坎德拉·秒/平方米处的信号强于受精后第五天和第六天。受精五天后，a波和b波的潜伏期显著缩短。

总体而言，这些结果表明斑马鱼视网膜功能在受精后四至七天之间逐渐成熟。要成功实施本方案，关键在于确保海绵充分浸透液体，这有助于维持记录电极的导电性并降低噪声水平。如果特别关注a波，可采用药理学处理方法阻断b波成分，从而暴露完整的a波。