Name: 利用成像质谱技术捕获组织与细胞之间的小分子通信 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学习利用成像质谱技术检测细胞与组织间的小分子通信，并以无标记方式研究卵巢癌转移中的分子机制。该方法可揭示新的治疗靶点和信号通路。

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资金由芝加哥生物医学联盟提供，并得到芝加哥社区信托基金赛尔基金（C-076）（L.M.S.）的支持；伊利诺伊大学芝加哥分校启动资金（L.M.S.）；卵巢癌研究基金联盟资助项目543296（M.D.）；以及美国国立卫生研究院转化科学促进国家中心通过资助项目UG3 ES029073（J.E.B.）和UL1TR002003（JEB &amp;#38; LMS）提供支持。

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的规定，并经伊利诺伊大学芝加哥分校机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>在加湿培养箱中，将小鼠输卵管上皮细胞（MOE）维持于 37°C、5% CO2 条件下，培养基为添加了 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、10 mg/mL 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、1.8 ng/mL 表皮生长因子（EGF）、100 U/mL 青霉素-链霉素、1 mg/mL 庆大霉素和 18.2 ng/mL 雌二醇-17β 的 α 最低必需培养基（αMEM）。每 3–4 天传代一次细胞，并确保在小鼠安乐死当天有足够的细胞可用。</li>
	<li>通过将 1 g 低熔点琼脂糖与 50 mL 蒸馏水混合制备 2% 琼脂糖溶液。高压灭菌琼脂糖，冷却后在琼脂糖凝固前分装至 2 mL 离心管（见材料表）中，每管 1 mL。琼脂糖可无限期保存于 -20 °C。</li>
	<li>准备至少 2 mL 的 1× 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
	<li>为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）制备基质，将 5 mg/mL 的 α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）与二羟基苯甲酸（DHB）按 1:1 比例溶于 90:10 乙腈:水（ACN:H2O）并含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的溶液中，总体积为 10 mL（见材料表）。超声处理直至基质完全溶解。</li>
</ol>
2. 小鼠繁育与卵巢摘除
<ol>
	<li>采用标准饲养程序维持 CD-1 小鼠的繁殖配对。临近分娩日时，每天检查小鼠，以确保明确幼鼠的出生日期。</li>
	<li>根据美国国立卫生研究院（NIH）指南，通过吸入 CO2 对 16–18 日龄的幼鼠实施安乐死。以每分钟 10%–20% 厢体体积的流速输送 100% CO2，并在呼吸停止后继续维持两分钟。通过颈椎脱位确认动物死亡。</li>
	<li>将所有手术器械浸入 70% 乙醇中进行消毒。将含 1× 青霉素-链霉素的 Leibovitz’s L-15 培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>用 70% 乙醇润湿腹部表面，以消毒区域并减少毛发污染。用钝头镊子夹住覆盖腹壁的皮肤，使用手术剪在皮肤和腹壁上剪出一个较大的 V 形切口，暴露内脏器官。</li>
	<li>用镊子将内脏器官移向一侧。用精细镊子分别夹住每个子宫角并轻轻提起。</li>
	<li>找到位于子宫角末端、紧邻肾脏下方的卵巢。使用手术剪将卵巢从结缔组织中分离出来，随后将卵巢角切成两半。</li>
	<li>将卵巢、输卵管以及每侧子宫角约一半的组织转移至预热的 Leibovitz’s L-15 培养基中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，小心地将每个卵巢从周围的包膜中分离，使其脱离输卵管、包膜及任何脂肪组织。将每个卵巢转移至新的 Leibovitz’s L-15 培养基培养皿中。</li>
	<li>沿轴向将每个卵巢切成两半。将卵巢组织块（现称为外植体）保持在 37 °C 环境中，直至进行琼脂糖包埋操作。</li>
</ol>
3. 准备受处理的ITO载玻片并进行共培养孵育
<ol>
	<li>未分隔共培养
	<ol>
		<li>在加热板上将琼脂糖于 70 °C 下融化。</li>
		<li>将 8 孔分隔器置于氧化铟锡（ITO）处理的载玻片上方（图 1A）。分隔器底部的橡胶有助于其与载玻片粘附，但在琼脂糖铺板过程中需持续施加轻柔的向下压力，以确保各孔之间无泄漏或混合。</li>
		<li>将细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管中，离心（800 rpm，5 分钟），并用 1× DMEM 培养基重悬至每 150 µL 含 50,000 个细胞。若最适细胞密度不同，请确保此步骤中细胞悬液浓度为最终所需浓度的 2 倍（例如，若最终浓度为 300 µL 中含 50,000 个细胞，则此步骤中细胞密度应为 150 µL 中含 50,000 个细胞）。</li>
		<li>在铺板细胞培养物之前，将卵巢组织块置于孔中央（图 1B）。</li>
		<li>在即将铺板前，向各个 2 mL 离心管中的细胞培养物中加入琼脂糖。每孔操作时，在 2 mL 离心管中混合 200 µL 细胞悬液与 200 µL 液化琼脂糖。例如，对于四个孔，混合 800 µL 细胞悬液与 800 µL 2% 琼脂糖。会剩余少量混合物，但制备略多于所需量可避免移液时产生气泡。
		<ol>
			<li>在即将铺板该细胞培养物前，立即向各细胞培养物中加入琼脂糖。琼脂糖在不到一分钟内即会冷却，因此需准备迅速完成铺板。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>立即向每孔中加入 300 µL 细胞/琼脂糖混合物（图 1C）。图 1C 显示了三种细胞条件和一种培养基条件，每种均分别在有或无卵巢的情况下进行铺板。</li>
		<li>将载玻片置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分隔共培养
	<ol>
		<li>从薄而光滑的塑料材料上切割分隔条（图 2A）。 
		注：本实验使用无菌一次性培养皿的侧壁，因其平整且薄。将其裁剪至刚好能紧密插入孔的斜边（约 13 mm 宽）。</li>
		<li>在加热板上将琼脂糖于 70 °C 下融化。</li>
		<li>将 8 孔分隔器置于 ITO 处理的载玻片上方（图 2B）。分隔器底部的橡胶有助于其与载玻片粘附，但在琼脂糖铺板过程中需持续施加轻柔的向下压力，以确保各孔之间无泄漏或混合。</li>
		<li>将细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管中，离心（800 rpm，5 分钟），并用 1× DMEM 培养基重悬至每 150 µL 含 50,000 个细胞。若最适细胞密度不同，请确保此步骤中细胞悬液浓度为最终所需浓度的 2 倍（例如，若最终浓度为 300 µL 中含 50,000 个细胞，则此步骤中细胞密度应为 150 µL 中含 50,000 个细胞）。</li>
		<li>将塑料分隔条斜向插入各孔中（图 2C）。</li>
		<li>在即将铺板前，依次向每份细胞悬液中加入琼脂糖。每孔操作时，在 2 mL 离心管中混合 100 µL 细胞悬液与 100 µL 液化琼脂糖。例如，对于四个孔，混合 400 µL 细胞培养物与 400 µL 2% 琼脂糖。会剩余少量细胞/琼脂糖混合物，但制备略多于所需量可避免移液时产生气泡。
		<ol>
			<li>在即将铺板该细胞培养物前，立即向各细胞培养物中加入琼脂糖。琼脂糖在不到一分钟内即会冷却，因此需准备迅速完成铺板。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在分隔条的一侧铺入 150 µL 细胞/琼脂糖混合物。待琼脂糖冷却并凝固（约 1 分钟）后，移除分隔条（图 2D）。</li>
		<li>将卵巢组织块置于孔空半侧的中央。在卵巢上方仅于孔的正确一侧加入 150 µL 培养基/琼脂糖混合物（图 2E）。</li>
		<li>将载玻片置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 干燥载玻片并准备进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析
<ol>
	<li>四天后（或任何选定的时间点），从琼脂糖凝胶块和载玻片上移除腔室分隔器（图1D）。使用平头刮刀轻轻将琼脂糖从腔室边缘剥离，并轻柔地向上提起腔室，注意不要移动任何琼脂糖凝胶块。如果发生移动，请轻轻调整位置，确保各凝胶块互不接触。</li>
	<li>将载玻片放入37 °C烘箱中约4小时，每隔1小时旋转90°。 
	注意：旋转载玻片对于确保样品受热均匀至关重要。</li>
	<li>待完全干燥后，从烘箱中取出载玻片（图1E）。</li>
	<li>使用喷雾器施加基质溶液（图1F），参数如下：温度 = 30 °C，流速 = 0.2 mL/min，喷雾次数 = 8次，方向 = CC，喷嘴距离 = 40 mm。 
	注意：若无基质喷雾器，可使用艺术喷笔施加液态基质。可使用相同的基质溶液进行喷涂，但所需溶液量约为原来的两倍。将载玻片夹住使其垂直悬挂，从约一英尺远的距离以90°角进行喷涂（改编自&#160;Hoffmann15），直至可见基质层形成。</li>
	<li>在载玻片上的空白位置加入1 µL校准物（目标分子量&#60;500 Da时使用磷红，目标分子量&#60;5,000 Da时使用多肽混合物（见材料表））。磷红无需与基质混合，但多肽混合物需与基质按1:1比例混合以促进电离。等待校准物完全干燥。</li>
	<li>使用永久性记号笔在载玻片的每个角落画一个“X”，然后使用相机或扫描仪以1,200 dpi分辨率拍摄光学图像。</li>
</ol>
5. 成像质谱数据采集
<ol>
	<li>在IMS数据分析软件中打开新序列（参见材料表）。将光栅宽度设置为所需的空间分辨率，至少50 µm。</li>
	<li>将载玻片的光学图像上传至分析软件，并利用各角落所画“X”标记的交点设置三个教学点。</li>
	<li>在采集软件中指定成像的兴趣区域，并进行相应命名。</li>
	<li>使用数据采集软件（参见材料表）对仪器进行校准，误差控制在5 ppm以内。</li>
	<li>保存优化后的方法并开始运行。本实验优化了以下参数：极性 = 正离子模式，检测器 = 反射式，激光大小 = 2，激光功率 = 50%，反射器模式检测器增益 = 3x。</li>
</ol>
6. 处理 IMS 数据
<ol>
	<li>将 .mis 文件导入统计分析软件（参见材料表）以进行显著性分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

越来越多的证据表明去甲肾上腺素在高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中发挥作用12,17,18，而该技术为此提供了更深入的机制性信息。由于同一张切片上可同时存在至少八种生物学条件，该方法可在一次成像质谱（IMS）运行中纳入生物学对照，例如基因和细胞特异性对照以及培养基对照。尽管该方法经过优化用于评估HGSOC原发性转移模型中交换的小分子，但任何可包埋于琼脂糖中的细胞或组织类型均可替代使用，从而可用于分析多种多样的生物学问题和疾病状态。
该实验方案中最重要的步骤之一是确保组织或细胞类型彼此紧密相邻，并位于琼脂糖凝胶块的中心。另一个重要考虑因素是整张载玻片干燥时间的优化。本方法使用卵巢组织进行优化，该组织易于干燥，且因其体积较小，干燥过程中几乎不会出现问题。然而，其他成分不同的组织（如脂肪组织）具有截然不同的干燥特性，因此需要更深入的干燥条件优化。在针对特定生物样本完成干燥条件优化后，后续实验流程仅需进行...

成像质谱（IMS）已得到优化，可用于表征三种广泛应用中分子特征的空间分布：组织切片、类球体以及微生物菌落1,2,3。组织切片可用于评估代谢物在宿主特定生物学背景下的定位情况，可针对特定质荷比范围进行靶向或非靶向分析。然而，当将健康组织与疾病状态（例如肿瘤）进行比较时，分子特征之间的差异最为显著且明显。这种IMS方法特别适用于疾病生物标志物的检测；然而，由于疾病进展过程中（如肿瘤分级）的组织样本通常仅在离散阶段获取，因而难以识别可能在疾病起始阶段起重要作用的信号。信息通过空间传递是许多生物系统的普遍特征，而组织切片无法捕捉这种动态的化学信号传递过程。一种能够可视化化学交换与扩散的技术是琼脂平板上培养的微生物菌落的IMS；小分子可在琼脂中扩散并穿过琼脂，进而通过基质辅助激光解吸/电离（MALDI-TOF）质谱进行检测4。该培养体系可用于鉴定不同独立生物实体（菌落）之间交换的分子，并可确定代谢物生成的方向性。最初为微生物菌落生长设计的实验平台已被改造用于研究哺乳动物细胞共培养的组织外植体的初级代谢，同时利用IMS评估体外哺乳动物系统中的动态化学交换过程。
近年来，研究逐渐明确，高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）通常起源于输卵管上皮（FTE），并在疾病早期发展过程中转移至卵巢5,6,7,8。目前尚不清楚为何具有肿瘤发生潜能的FTE细胞会扩散至卵巢，并在该处形成巨大肿瘤，进而发生进一步转移。以往的研究主要关注卵巢蛋白在HGSOC向卵巢原发性转移中的作用；然而，最近的研究表明，组织从正常状态向肿瘤发生状态的转变会导致细胞代谢的严重紊乱，并改变小分子的生成9,10,11。因此，我们提出假设：FTE与卵巢之间交换的小分子可能在HGSOC的原发性转移中起到部分介导作用。
利用我们新开发的成像质谱（IMS）方法，我们发现致瘤性输卵管上皮细胞（FTE）与健康卵巢组织共培养可诱导卵巢产生去甲肾上腺素。然而，其他细胞类型或正常的FTE细胞并未引发这一效应。该方法的一个显著优势在于，能够可视化反映真实分子的信号分子的生成与交换过程，因此即使在共培养体系中，也能明确信号的来源。这一点优于对匀浆样本的分析，后者会丢失所有空间信息。在我们的模型系统中，我们能够清晰地将去甲肾上腺素的产生定位至卵巢组织。已有研究将去甲肾上腺素与卵巢癌的转移及化疗耐药性相关联，而我们对该分子的检测结果证实，这种新型IMS方法能够揭示具有生物学意义的分子12,13,14。这一验证结果使我们提出，该IMS新应用可特别有助于致力于在共培养环境中鉴定小分子、并探究影响细胞转化与转移早期事件的研究团队。该方法的总体目标是阐明组织与器官之间交换过程中小分子的身份及其空间分布，这些组织或器官可由体外（in vitro）三维细胞培养或离体（ex vivo）组织来代表。

<table><tbody><tr><td>15 mL Falcon 离心管</td><td>Denville</td><td>C1017-O</td><td>用于收集细胞</td></tr><tr><td>8孔腔室（Millipore EZ-slide 腔室）</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0816</td><td>由 Millipore Millicell EZ-slide 腔室载玻片改装而来</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998-4L</td><td>喷雾基质的溶剂</td></tr><tr><td>α-最低必需培养基（&amp;alpha;MEM）</td><td>Fisher</td><td>10-022-CV</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>Autoflex speed MALDI-TOF LRF</td><td>Bruker</td><td></td><td>用于成像质谱（IMS）数据分析</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>用于收集细胞并去除上清液</td></tr><tr><td>CHCA 基质</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201344</td><td>喷洒于干燥载玻片上的基质</td></tr><tr><td>DHB 基质</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201346</td><td>喷洒于干燥载玻片上的基质</td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Fisher</td><td>22-079-707</td><td>用于摘除卵巢</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fisher</td><td>13-804-6</td><td>用于摘除卵巢</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>与琼脂糖混合的培养基</td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Peprotech Inc.</td><td>100-15</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-282</td><td>用于分装琼脂糖</td></tr><tr><td>雌二醇-17&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Denville</td><td>fb5001</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>FlexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS 数据采集软件</td></tr><tr><td>FlexImaging 4.1</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS 数据分析软件</td></tr><tr><td>镊子（精细）</td><td>Fisher</td><td>22-327379</td><td>用于摘除卵巢</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Cellgro</td><td>30-005-CR</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>胰岛素、转铁蛋白、硒（ITS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11074547001</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>ITO 涂层载玻片</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>共培养孵育平台</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td>组织解剖过程中使用的培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>与培养基混合用于铺板</td></tr><tr><td>培养基容器</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>用于切割塑料隔板以制备分隔腔室</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>多肽校准标准品</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8206195</td><td>中等质量范围校准物</td></tr><tr><td>磷红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343-242-5G</td><td>低质量范围校准物</td></tr><tr><td>SCiLS Lab 2015</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS 数据统计分析软件</td></tr><tr><td>外科镊子（钝头）</td><td>Fisher</td><td>08-875-8B</td><td>用于摘除卵巢</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Technologies</td><td>A116-50</td><td>添加至基质溶液中</td></tr><tr><td>TM 喷雾仪</td><td>HTX Technologies</td><td></td><td>用于施加基质</td></tr></tbody></table>

利用成像质谱技术捕捉组织与细胞间的小分子通讯

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

成像质谱技术（IMS）通常应用于三类样品：组织切片、球状体和微生物菌落。这些样品类型已使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析，以可视化蛋白质、脂质和代谢物在目标生物样品中的分布情况。我们开发了一种新型样品制备方法，结合了上述三种应用的优势，旨在探索一种尚未充分研究的癌症化学通讯识别策略：将哺乳动物细胞培养物接种于琼脂糖中，并与健康组织共培养，随后对样品进行干燥处理。该方法使哺乳动物组织与细胞在近距离内共培养，从而通过扩散实现组织与细胞间的化学通讯。在特定时间点，将基于琼脂糖的样品以与制备用于IMS分析的微生物菌落相同的方式干燥。本方法旨在模拟高级别浆液性卵巢癌（起源于输卵管）在转移过程中与卵巢相互作用时的通讯过程。通过优化样品制备条件，鉴定出去甲肾上腺素是卵巢微环境中的一种关键化学组分。这种新开发的方法可应用于其他需要理解相邻细胞或组织之间化学通讯的生物系统。

经过最佳干燥处理的ITO载玻片将得到一个表面平整、干燥的样品，琼脂糖及其碎片在载玻片上保持空间分离，且表面几乎无或完全没有皱褶（图3）。图3A显示了理想的干燥效果，而图3B则显示了应避免出现的皱褶。该优化过程需要在烘箱中仔细监控载玻片，因为具体干燥时间会因相对湿度的不同而有所变化。虽然皱褶可能轻微影响高度，从而对成像质谱（IMS）信号的质量准确性产生一定影响，但轻微的皱褶不会影响数据的整体质量。因此，即使琼脂糖样品最终存在轻微皱褶，仍可通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析。载玻片必须完全干燥，否则在MALDI-TOF质谱仪的高真空环境中可能导致样品爆裂。
除琼脂糖外的其他基底材料可能也可使用，但通常在干燥或移除小室后无法保持其结构完整性，从...

开发了一种新的样品制备方法，用于实现细胞与组织的共培养，以通过成像质谱技术检测小分子交换。

成像质谱技术（IMS）已常规应用于三类样品：组织切片、球状体和微生物菌落。这些样品……

我们的实验方案能够绘制细胞与组织间的小分子化学通讯图谱，并已特别应用于探索卵巢癌转移过程中的小分子作用。本技术的主要优势在于能够在维持细胞和组织二维空间完整性的前提下，以无标记的方式检测小分子。该技术使我们能够以非靶向的方式深入探究小分子在卵巢癌转移中的贡献。这可能会揭示出此前被忽视的新的治疗靶点和通路。该方法可轻松拓展至其他可在琼脂糖中培养的癌症，以及任何空间结构可能对最终细胞表型具有重要意义的其他疾病。确保所有细胞和组分均准备就绪，并在干燥过程中保持耐心，对该实验方案至关重要。仓促的干燥步骤常常会导致质谱数据质量不佳。由于本方法的样品制备和干燥步骤与通常使用组织或琼脂上微生物的成像质谱实验有显著差异，因此对该方法进行可视化演示有助于理解。首先，在加热板上将琼脂糖加热至 70 摄氏度使其液化。将八孔隔片置于经 ITO 处理的载玻片上方。通过标准的胰蛋白酶处理，收集 MOE 细胞至 15 毫升锥形管中，离心后加入 1 倍体积的 DMEM 培养基重悬，使细胞浓度达到每 150 微升含 50,000 个细胞，即所需最终密度的两倍。对于未分隔的共培养体系，使用镊子将卵巢组织块添加至四个孔的中央。铺板前，将200微升细胞悬液与200微升液化琼脂糖分别加入各2毫升离心管中。移液时避免产生气泡。立即向每孔中加入300微升细胞-琼脂糖混合液，并对分隔器持续施加轻柔的向下压力，以确保孔间无泄漏或交叉混合。确保无气泡产生，且卵巢保持在孔的中央。若移液过程中琼脂糖影响了卵巢的位置，需在琼脂糖冷却前，轻轻使用移液枪头将其调整至中央。随后，将玻片置于37°C、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。对于分隔共培养，需从薄而光滑的塑料上切割分隔条，可使用无菌一次性培养基盆的侧壁材料。将其切割至恰好能紧密贴合孔板斜边的宽度。将八孔分隔器置于经 ITO 处理的载玻片上，并将塑料分隔条斜向插入各孔中。按照之前的方法制备细胞培养物，取 100 微升细胞悬液与 100 微升液化琼脂糖于 2 毫升离心管中混合。立即在分隔器的一侧加入 150 微升细胞-琼脂糖混合液，同时对分隔器保持向下的压力。让琼脂糖冷却并凝固约一分钟，然后移除分隔器。用镊子将卵巢外植体放置在孔板空半侧的中央。在卵巢上方加入150微升细胞-琼脂糖混合物。将载玻片置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。四天后，从琼脂糖凝胶块中移除腔室分隔器。用扁平刮铲将琼脂糖凝胶边缘从腔室上分离，并轻轻向上提起腔室。若有任何琼脂糖凝胶块发生移动，请轻轻调整其位置，确保彼此不接触。将载玻片置于37摄氏度的烘箱中约四小时，并每小时旋转90度，以确保样品受热均匀。载玻片必须完全干燥。否则，样品可能在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的高真空环境中发生爆炸。干燥载玻片并监测干燥进程是获得高空间分辨率和高质量质谱数据的最关键步骤。如果出现样品剥落或严重皱缩现象，我们不建议采集质谱数据。根据基质喷涂仪设定的参数，将基质溶液喷涂至载玻片上。若使用磷红（Phosphorus Red）作为校准物，取一微升磷红加至载玻片上的空白区域。若使用肽混合物作为校准物，则将其与基质在Parafilm上按1:1比例混合以促进离子化，并取0.5至1微升点样于载玻片上。在成像质谱数据采集前，等待校准物完全干燥。使用永久性记号笔在载玻片的每个角落画一个“X”，然后使用相机或扫描仪以1200 dpi的分辨率获取光学图像。在本实验中，必须仔细监测烘箱中的载玻片，以确保获得最佳干燥的ITO载玻片，从而得到表面平整、干燥且几乎无皱褶的琼脂糖样品。该图显示了应避免出现的褶皱。褶皱可能会轻微影响高度，从而影响成像质谱信号的质量准确性。轻微的褶皱不会影响数据质量。理想位置的组织应尽可能靠近中心。若组织未被分割，应将其置于孔的中央；若组织已被分割，则应将其置于半三角形的中央，以避免成像质谱（IMS）数据受到边缘效应的干扰。组织位置不佳时进行成像，可能因边缘效应而产生虚假的质谱信号。利用干燥的切片图像来指导基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）选择成像区域。在卵巢组织周围选取了若干小区域进行成像质谱分析（IMS），空间分辨率为50微米。展示了未分隔共培养体系以及分隔培养室装置中m/z信号的代表性图像。最重要的是要记住，所得数据的质量完全取决于样品制备的优劣。请特别注意干燥过程。最令人兴奋的部分是通过其他实验（如侵袭实验或定植实验）验证以此方式发现的小分子，从而确定其有效浓度，并将其结果转化为人类生物学意义。我们预期，通过更深入地理解卵巢癌原发性转移过程中的机制，将有助于发现卵巢癌潜在治疗靶点的新通路。

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科研

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癌症研究

利用成像质谱技术捕获组织与细胞之间的小分子通信

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单探针的应用：常温条件下的质谱成像与单细胞分析

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单细胞质谱代谢组学研究的样品制备：细胞洗涤、淬灭、干燥与储存的联合操作

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学习利用成像质谱技术检测细胞与组织间的小分子通信，并以无标记方式研究卵巢癌转移中的分子机制。该方法可揭示新的治疗靶点和信号通路。

利用成像质谱技术捕捉组织与细胞间的小分子通讯

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