小鼠胰岛细胞亚群中钙动力学的成像

该方案可快速分离胰岛朗格汉斯细胞群中的小亚群细胞。此技术的优势在于所获取数据具有实时性、高统计效力，因而具有高重复性。为固定胰岛以进行成像，需组装一个倒置显微镜用的成像室，并将玻璃盖玻片放入成像室内。

确保玻璃腔室接口密封不漏水，并确认盖玻片位于显微镜物镜的工作距离范围内。接着，裁剪20 mm × 20 mm的细网和粗网方片，并使用45至50 µm厚的粘性胶带在细网上制作两条间隔壁。将粗网和配重浸入盛有成像溶液的35 mm培养皿中，然后将细网置于解剖显微镜下。

将带有间隔壁的细网翻转，使间隔壁朝上。使用P20移液器将多个胰岛转移至两个间隔壁之间。用钟表匠镊子将细网倒置放入倒置显微镜的成像室中，使间隔壁朝下，直接接触载物片盖玻片，从而将胰岛固定在间隔壁与细网之间，位于盖玻片中央。

注意保持网格充分水化，但避免含有过多溶液，以免引起样本的侧向移动。随后将粗网和重物置于腔室内的细网之上，并向腔室内加入成像溶液。胰岛固定后，在倒置显微镜上选择成像模式和物镜，将含有胰岛的腔室放置在显微镜的温度控制载物台上。

设置灌流后，将灌流 chamber 内的流入端位置置于流出端下方，并使流出通量大于流入通量。确保流出端与溶液接触最小，以使其以多个连续的小液滴形式移除溶液，避免长时间连续排出溶液。接下来，使用含有 3 mM 葡萄糖的成像溶液启动灌流，并选择适合绿色荧光染料成像的光路和滤光片。

然后进行活体成像，以设定成像参数并调整视野，从而捕获目标胰岛。为优化图像的信噪比，需调节激发光强度、曝光时间及像素合并（binning）设置，确保在尽可能低的光照强度和曝光条件下，仍能清晰显示胰岛内每个细胞。随后以0.1至5赫兹的频率对胰岛进行成像，并在数据采集过程中实时检查所获取数据的质量。

当可检测到α细胞活性时，应尽可能使用采集软件中的在线图表来监测信号动态，并向灌流液中加入肾上腺素或谷氨酸，持续两到五分钟。此时可观察到钙离子水平迅速升高，随后α细胞的振荡活动减慢或消失。接下来，加入最近报道可选择性激活δ细胞的胃饥饿素（ghrelin）。

将在胰岛细胞的一个小亚群中观察到钙离子的快速可逆性升高。随后加入10毫摩尔葡萄糖，将在β细胞亚群中观察到协调的振荡反应。

同时注意先前被肾上腺素、谷氨酸或胃饥饿素激活的细胞的反应。保存图像后，将数据导入适当的数据分析软件，并将原始荧光强度数据归一化至荧光初始值。如果细胞间荧光强度数据的变异性仍然较大，可定义一个对照区域，对应于施加对照溶液的时间范围。

如果对照区域具有明显的非振荡信号，则假设每次加入对照溶液后，荧光强度均恢复至基线水平。为校正每个细胞的时间推移数据，需将数据按对照溶液添加的时间点划分为多个片段，并对每个片段应用线性校正。若对照区间存在明显振荡或存在其他干扰因素，则应使用峰检测算法。

为了测量钙峰的频率以及对激动剂和拮抗剂添加的响应，将记录分割为相等的时间区间，统计每个区间内的峰数量，并将其归一化至区间时长，以计算部分频率的时间过程。或者，设定阈值并计算每个区间内的平台期比例。该比例表示细胞处于兴奋状态的时间占整个区间时间的百分比。

或者计算曲线下每个区间的部分面积。除非膜的脂质组成受到影响，胰岛对热带染料的负载效果通常较好。人5型腺病毒载体也能成功靶向胰岛细胞。

在低葡萄糖水平下，α细胞中的钙振荡可被 readily 检测到，并且低葡萄糖条件下的细胞活动与对肾上腺素和谷氨酸反应之间存在较高的单细胞相关性。在低葡萄糖条件下，饥饿素可激活部分对肾上腺素有反应的细胞，但对大多数由低葡萄糖激活的细胞的钙动力学无影响。从部分频率的角度分析，在全或无条件下，肾上腺素或饥饿素刺激的细胞表现出显著增加，尽管基础钙振荡与肾上腺素效应之间的总体变化较为细微。

相比之下，曲线下部分面积对肾上腺素在所有细胞中引入的变化均具有敏感性，即使基础活性较高时也是如此。确保所有网格均与成像溶液接触，并注意将组织合理密集地放置，以避免产生气泡。该方法可进一步扩展，以纳入人工智能技术用于区分不同细胞类型。

药理学标记可被模式识别技术取代，从而缩短记录时间。