利用快速生长的细菌 Vibrio natriegens 进行无细胞蛋白表达

我们的无细胞蛋白表达方案利用了一种快速生长的细菌——海洋弧菌（Vibrio natriegens）制备的高活性粗提物，该粗提物通过一种简单且省时的两步法（超声-离心）制备而成。单个操作者可在一至两天内完成粗提物制备和无细胞蛋白合成，因此该技术可轻松整合到生物制造或合成生物学应用的工作流程中。首先，取1毫升过夜培养的海洋弧菌（Vibrio natriegens）菌液，在台式离心机中以10,600 × g离心1分钟，进行洗涤。

吸出上清液，注意不要扰动沉淀，并用一毫升新鲜的LB-V2培养基重悬。将一毫升洗涤后的过夜培养物接种到一个装有带无菌盖的四升挡板锥形瓶中的新鲜LB-V2生长培养基（一升）中，以实现1:1000的稀释比例。在30°C、225 RPM振荡条件下培养菌液。

使用分光光度计监测培养物在 600 nm 处的光密度（OD 600）。当 OD 值达到 1.0 ± 0.2 时，将培养物分装至两个 500 毫升离心管中，在 4 °C 条件下以 3,500 × g 离心 20 分钟收集菌体，随后置于冰上。吸除上清液，并立即处理沉淀物。

开始细胞裂解步骤前，将新配制的 S30 裂解缓冲液（pH 7.7）冷却至约 4 摄氏度。用 10 毫升预冷的 S30 裂解缓冲液重悬来自同一升培养物的所有沉淀，并将悬液转移至 50 毫升离心管中。在 4 摄氏度下以 3,500 × g 离心 10 分钟，随后小心吸除上清液（勿扰动沉淀），并将沉淀置于冰上。

在低温室中操作，向置于冰上的50毫升离心管中的沉淀加入500微升预冷的S30裂解缓冲液。使用宽口移液枪头重悬沉淀，并小心转移至另一置于冰上的2毫升离心管中。为了获得活性很高的粗提物，必须确保细胞在S30缓冲液中不过度稀释，同时又含有足够液体以保证超声处理的效率。

取一个600毫升的烧杯，装满冰，并将一个2毫升的离心管架放在冰上。短暂涡旋混匀细胞。轻弹管底以去除管盖底部附着的细胞，然后将离心管开口朝上放入管架中。

将超声波破碎仪的探头尖端插入管中的细胞悬液，使其刚好位于液面下方。使用超声波破碎仪和直径为1/8英寸的探头准备超声处理装置。将超声波破碎仪设置为20千赫兹频率和50%振幅。

脉冲开启时间为10秒，脉冲关闭时间为60秒。重复此脉冲超声处理程序三个循环。然后将粗制细胞提取物在4摄氏度下以16,000 ×g离心30至45分钟，直至裂解液中无任何细胞碎片。

在超声处理过程中，目视检查细胞裂解情况至关重要，以确保超声处理达到预期效果。在低温室中，将所得上清液各50微升分装至新的2毫升离心管中，注意不要扰动沉淀。为快速冷冻这些粗制细胞提取物，将离心管放入带有浸入式绳索的管架中，浸入装有液氮的杜瓦瓶内，并检查是否已冻结。

进行无细胞蛋白表达时，将10倍能量溶液预混液、4倍氨基酸预混液以及DNA模板在室温下解冻。随后从零下20摄氏度冰箱中取出T7 RNA聚合酶和RNase抑制剂储备液，并置于冰上。待DNA模板、10倍能量溶液预混液和4倍氨基酸预混液完全解冻后，立即置于冰上。

在冰上将各组分按准确顺序加入一个2毫升离心管中，配制无细胞反应主混合液，每加入一种组分后轻轻弹击管壁混匀。从-80 °C冰箱中取出解藻酸盐弧菌（Vibrio natriegens）粗细胞裂解液，置于冰上10至20分钟，直至完全解冻。将适量解冻后的粗细胞提取物加入无细胞反应主混合液中，用移液器轻轻混匀。

使用热循环仪进行终点法无细胞蛋白表达时，首先在96孔PCR板的每个孔底部加入10微升无细胞反应预混液，并确保在每次向PCR板转移过程中，通过轻轻弹动离心管使预混液充分混匀。将PCR板在1,000 × g条件下离心10秒，使可能附着在孔壁上的预混液沉降至孔底。随后用板密封膜封住各孔，防止蒸发。

将反应板放入已预热至26摄氏度且热盖温度设为105摄氏度的PCR仪中。在PCR板中孵育反应体系至少三小时后，即可对表达的蛋白质进行纯化、定量，并用于后续实验。若需使用酶标仪监测无细胞蛋白表达动力学，可将10微升无细胞反应主混合液逐孔加入底部为透明玻璃的黑色384孔检测板的孔底。

使用透明板粘合剂密封各孔，以防止蒸发。将检测板放入设定为26°C的酶标仪中，在3至6小时内孵育，同时监测与表达蛋白相对应的适当荧光激发/发射波长。本方案中所述的无细胞表达系统在使用质粒DNA模板时效果最佳，终点法和动力学检测结果均显示，其产生的蛋白量显著高于等量的线性DNA。

通过体外转录反应生成的 mRNA 也可使用，但需要更高量的 mRNA。蛋白质生产的产量显著受到镁离子和钾离子浓度的影响。在优化条件下，镁离子的最佳浓度为 3.5 毫摩尔，钾离子为 80 毫摩尔。

因此，离子浓度偏离这些最佳值可能导致该表达系统产生大量蛋白质的能力下降。应尽可能将所有试剂保持在冰上或在冷室中操作。此外，充分且彻底的超声处理对该实验方案的成功至关重要。

按照本实验方案，用户将能够以高通量的形式表达蛋白质，可用于纯化并筛选多种不同蛋白质的活性。该技术展示了利用具有独特特性的新型生物体进行无细胞表达的方法。Vibrio natriegens 是一种嗜盐且生长迅速的细菌，可能为在传统模式生物中尚未探索过的蛋白质或小分子的表达提供独特的条件。