小鼠特拉切斯刷细胞的分离与定量评价
June 12th, 2019
刷细胞是罕见的胆碱能化学感觉上皮细胞发现在天真的小鼠气管。由于其数量有限,其功能在气道免疫和改造中的作用的体外评估具有挑战性。我们描述了一种通过流式细胞测定分离气管刷细胞的方法。
我们开发了一种分离气管刷细胞的程序，这是来自胆碱乙酰转移酶荧光记者小鼠的罕见专用化疗上皮细胞。此方法基于气管上皮与亚木科萨的初始分离，允许随后将上皮表与木瓜进行更短的孵育。这允许气管刷细胞的稳健恢复，并已成功用于通过RNA测序对刷细胞进行分离和转录分析。
用消化酶长期孵育可以降低细胞活力，改变从组织分离的细胞的转录体特征。在这里，我们分离气管上皮与消性，然后孵育与papain短时间产生高产量的可行刷细胞。我们的方法有助于上气道上皮的研究。
同样的协议可以应用于将刷细胞与其他粘膜位点（如鼻组织）隔离开来。我们高度可重复技术的演示将允许同行科学家分离和进一步研究气管刷细胞。要开始此过程，请将 dispase 和 DNase I 添加到 PBS 中，以在此显示的最终浓度下准备解胃消化溶液。
在37摄氏度的水浴中加热溶液之前，确保溶解粉末完全溶解。接下来，将 5% 的热灭活 FBS 添加到 DMEM 中，以准备停止解决方案。要准备泰洛德 I 缓冲液，请将木瓜和 L-半胱氨酸添加到 HEPES Tyrode 的缓冲液中，不带钙。
要准备泰洛德II缓冲液，将利普汀加入海佩斯泰洛德的缓冲液，每毫升浓度为2微升，不含有钙。要准备 FACS 缓冲液，请使用 Hank 的平衡盐溶液，不带钙、镁和酚红色，并辅以两毫摩尔 EDTA 和 2%FBS。对鼠标实施安乐死后，使用 21 个测量针将其固定在上肢和下肢延伸的手术板上。
用70%乙醇喷洒毛皮，以消毒该地区。使用直钳，抬起腹部的皮肤和毛皮，并使用解剖剪刀在中心切口。使用剪刀将皮肤从皮下组织从腹部分离到曼迪布拉。
在用钳子把皮下组织举起来时，用腹部壁中央的剪刀做一个小切口。然后用V形切口打开内酮。使用钳子，轻轻地将小肠移动到一边。
找到腹部主动脉和维纳卡瓦，用解剖剪刀做切口，以便快速排泄。找到隔膜。使用 18 量针，在胸骨正下方的隔膜中打开一个开口，以放气肺部。
使用锋利的尖直解剖剪刀，沿着肋骨底部切割，小心地将隔膜从肋骨分离。使用钳子抬起胸骨的外露端，将胸骨从肋骨底部纵向切割到颈部。使用短直剪刀做一个中央宫颈切口，并分离亚人膜腺的两个叶。
在此之后，使用一对细点高精度钳子小心地去除周围的结缔组织和胸腺覆盖卡琳娜。通过先分离表皮水平的近端，然后解剖气管分叉水平的端端，可释放气管。找到表皮，将气管纵向地从表皮切到卡琳娜。
首先，将气管放入含有750微升的去皮消化液的1.5毫升管中，预先加热至37摄氏度。用铝箔盖住管子，以减少直接光线的暴露，并在 200 RPM 和室温下在摇床上孵育 40 分钟。然后加入750微升DMEM与5%FBS停止反应，并将管子放在冰上。
将气管转移到培养皿中。方向气管与上皮面朝上。纵向解剖气管具有半圆柱形，由旋转环保持。
上皮在凹面上。使用直钳，将气管的表皮区域系在培养皿上，并使用大小为 22 的处置手术刀将气管上的上皮擦掉。上皮层将作为半透明板分开。
使用手术刀切碎上皮，将上皮层转移到两毫升管。用 750 微升的 Tyrode I 缓冲液冲洗 Petri 盘，然后将其转移到包含上皮层的管中。用铝箔盖住管子，以减少直接接触直光，并在 200 RPM 的摇床上孵育 37 摄氏度，持续 30 分钟。
然后添加750微升的冷泰洛德II缓冲液。大力旋转消化的组织20至30秒。使用连接到 18 量针的注射器，将均质三酯三酯三酯 10 次。
在此之后，切换到 21 量表针和三刺激 10 到 20 次。通过100微米滤株将细胞过滤成50毫升的圆锥管。以 30 比 1 的体积比添加冷 FACS 缓冲液。
在350倍g和4摄氏度下离心10分钟。丢弃上清液，将颗粒重新在冷 FACS 缓冲液中。将此悬浮液转移到 12 乘 75 毫米聚苯乙烯管中。
在350倍g和4摄氏度下再次离心10分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新在 100 微升的 FACS 缓冲液中。接下来，加入一微升抗小鼠CD1632阻断抗体，阻断非特异性结合，在冰上孵育15分钟。
然后在文本协议中概述的各自等型对中添加抗体。在冰上孵育45分钟，同时防止直接光线。在此之后，添加 4.5 毫升的冷 FACS 缓冲液并混合。
在350倍的g和4摄氏度的离心机。丢弃上清液，将颗粒重新在 300 微升的冷 FACS 缓冲液中。在流动细胞计量排序之前立即添加碘化丙二。
在这项研究中，从ChAT eGFP乙酰胆碱荧光测量小鼠的气管刷细胞被成功分离为RNA测序。通过向前和侧面散射角从碎片中识别细胞。使用正向散射高度和宽度以及侧面散射高度和宽度排除双精度值。
双精度值是具有高宽度值的单元格。在单细胞内，活细胞被确定为碘化阴性。在活的单细胞中，CD45 低至负细胞根据等型控制进行识别。
在CD45低负细胞中，EPCAM阳性细胞在F1C通道中也是eGFP阳性的，是刷细胞的种群。刷细胞号通过接触微生物代谢物和原生动物而改变，因此反映了机构微生物群的变异性。因此，我们建议通过荧光显微镜估计刷细胞的数量，通过流动细胞测量排序来测量预期隔离的刷细胞数量。
确保正确分离气管的上皮层，因为它决定孤立的刷细胞的产生。分离的气管刷细胞可用于广泛的测定，如RNA测序、细胞培养和功能分析。
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概览
本研究提出了一种用于分离气管刷细胞的方法，这些是小鼠气管中罕见的胆碱能化学感受上皮细胞。该技术增强了这些细胞在气道免疫和重塑中的功能分析的回收。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 呼吸生理学
背景
- 气管刷细胞是特化的上皮细胞。
- 它们在气道免疫中扮演角色。
- 由于它们的稀有性，分离这些细胞具有挑战性。
- 现有的方法可能影响细胞活力。
研究目的
- 开发一种可靠的分离气管刷细胞的方法。
- 增强对其功能角色的理解。
- 通过RNA测序促进转录分析。
使用的方法
- 将气管上皮与黏膜下组织分离。
- 短时间孵育纸酶以维持细胞活力。
- 使用分离酶进行有效的上皮分离。
- 高产率回收活细胞刷细胞。
主要结果
- 成功分离气管刷细胞。
- 分离细胞的高活力率。
- 该方法允许后续的转录分析。
- 为上气道上皮研究做出贡献。
结论
- 开发的方法对分离刷细胞有效。
- 它保持了细胞活力和转录完整性。
- 这种技术可以推进气道生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation of rare chemosensory epithelial cells enables mechanistic de-risking of airway biology targets by providing a validated biological system for functional interrogation. This method supports target validation and assay development in respiratory disease research by delivering viable, transcriptionally intact brush cells for downstream analysis. The procedure enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological variability associated with enzymatic dissociation artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cholinergic chemosensory pathways in airway epithelial cells for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible source of viable brush cells for functional validation of airway targets.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through transcriptional profiling of isolated brush cells via RNA sequencing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized epithelial sheets for consistent preparation of brush cell suspensions in assay workflows.
- Operational Value: Short papain incubation preserves cell viability and transcriptional integrity for reliable functional readouts.
- Scientific Value: Enables quantitative evaluation of brush cell responses to microbial metabolites and protozoa exposure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling of upper airway epithelium for preclinical target validation.
- Operational Value: Offers a transferable protocol applicable to brush cell isolation from nasal and other mucosal tissues.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by linking brush cell variability to institutional microbiota exposure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling isolation of rare epithelial cells for hypothesis-driven target validation and pathway clarification prior to screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of airway targets through viable brush cell isolation and transcriptional analysis.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions suitable for compound screening and functional assay development.
- Analytics: Provides quantitative outputs via flow cytometry and RNA sequencing for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through disease-relevant upper airway epithelium modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for brush cells across multiple mucosal sites and respiratory disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preservation of cell viability and transcriptional profiles.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined enzymatic dissociation steps and buffer preparations.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early functional analysis of rare chemosensory cells.
- Portfolio Impact: Informed go/no-go decisions based on brush cell response variability to microbial metabolites.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epithelial dissection and enzymatic tissue processing.
- Dependent on access to dispase, papain, and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates standardization of epithelial sheet separation for consistent brush cell yields.
- Involves adaptation considerations for applying the protocol to nasal or other mucosal tissues.
- Limited by the rarity of brush cells, necessitating fluorescence microscopy for yield estimation prior to sorting.
