Name: 用于分离共转录RNA处理事件的人工RNA聚合酶II伸长复合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 了解利用合成DNA和RNA寡核苷酸组装RNA聚合酶II延伸复合物的方法，用于研究共转录RNA加帽机制。该方法通过磁珠固定实现反应条件的灵活调控，为转录调控研究提供可靠工具。

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我们感谢 S. Shuman 提供哺乳动物加帽酶 cDNA。本工作部分由堪萨斯城大社区基金会的海伦·尼尔森医学研究基金向斯托尔斯医学研究所提供的资助支持。本论文的原始数据可从斯托尔斯原始数据存储库获取，网址为 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434。

1. 人工延伸复合物的组装与Pol II行进
<ol>
	<li>将含有3’生物素分子的1 nmol非模板DNA寡核苷酸固定在磁珠上。 
	注意： 以下步骤可预先完成，以备后续实验使用。本方案中使用的所有寡核苷酸序列均列于 表1RNA 寡核苷酸经 5’-三磷酸化修饰合成。
	<ol>
		<li>向一个低蛋白结合力的1.5 mL离心管中加入200 µL磁珠（10 mg/mL），然后置于磁力架上静置2 min。</li>
		<li>当离心管置于磁力架上时，小心移除管内液体，避免扰动磁珠。为洗涤磁珠，先将离心管从磁力架上取下，加入1 mL的5&#8201;mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5&#8201;mM EDTA, 1&#8201;M NaCl，将离心管放回架上，2分钟后移除洗涤液。</li>
		<li>用相同的缓冲液再重复洗涤2次，每次200 µL。</li>
		<li>将磁珠重悬于 400 µL 的 10&#8201;毫摩尔 Tris-HCl pH 7.5，1&#8201;mM EDTA，2&#8201;M NaCl，缓冲液。然后与380 µL H2O 和 20 µL 的 10 µM 无模板生物素化 DNA 寡核苷酸。将试管置于旋转混合仪上，室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>用 200 µL 的 5 洗涤固定化的非模板 DNA 寡核苷酸 3 次&#8201;mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5&#8201;mM EDTA，1&#8201;M NaCl，然后用200 µL的20&#8201;mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% 甘油, 100&#8201;毫摩尔 KCl，1&#8201;mM EDTA，0.5&#8201;mg/mL 牛血清白蛋白</li>
		<li>4 °C 条件下孵育过夜，以完成用 BSA 封闭磁珠的过程。</li>
		<li>第二天，将试管置于磁力架上，移除并弃去液体，&#160;重悬珠子&#160;在 200 µL 的 20&#8201;mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% 甘油, 100&#8201;毫摩尔 KCl，1&#8201;mM EDTA，0.5&#8201;毫克/毫升牛血清白蛋白，并转移至新管。此DNA模板的终浓度约为5 µM。 
		注意： 孵育时间和寡核苷酸浓度需针对每种生物素标记的DNA寡核苷酸进行经验性确定。该模板足以进行200次反应，在4 °C保存时至少可稳定6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以2:1的摩尔比（分别为20 pmol和10 pmol）退火RNA与DNA模板链寡核苷酸，以获得DNA:RNA双链体。
	<ol>
		<li>配制10 µL退火反应体系，具体如下所述 表2. 
		注意： 10 µL 退火混合液足以进行 10 次反应。若需进行更多检测，可按需扩大退火混合液的配制量。</li>
		<li>在热循环仪中进行退火反应，程序如下：45 °C孵育5分钟，随后进行12个循环，每个循环2分钟，起始温度为43 °C，每个循环降低2 °C，最后在4 °C保持。 
		注意： 这是一个灵活的时间点。退火在约30分钟内完成，但可于4 °C放置更长时间。在实验室内，退火混合物放置长达4小时，未观察到反应效率下降。</li>
		<li>在将RNA与模板链DNA退火的同时，准备后续步骤所需的缓冲液。下表列出了单次反应中每种缓冲液的配制所需试剂。 表 2 到 8将洗涤缓冲液的配方按 [Y(X+1) + 1] 倍放大，其余所有缓冲液按 (X+1) 倍放大。X = 需准备的反应数；Y = 所需洗涤步骤数（最少为 3）。 
		注意：所有缓冲液均需在实验当天新鲜配制。在缓冲液中加入PVA后，切勿将离心管置于冰上。在使用前立即向缓冲液中加入Pol II或核苷酸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将纯化的RNA聚合酶II加载到DNA:RNA杂交链上。
	<ol>
		<li>将1 pmol（1 µL）DNA:RNA杂交双链与13 µL Pol II缓冲液（来自 表3).</li>
		<li>向1.3.1步骤的混合物中加入约0.02单位的纯化RNA聚合酶II（1 µL），通过轻柔吹打并用移液器吸头搅拌混匀，避免产生气泡。30 °C下孵育10分钟。 
		注意： 以下提及的体积均为单个反应所需量；根据实验中反应数量的需要按比例放大。RNA聚合酶II（RNA Pol II）按所述方法从大鼠肝脏中纯化获得10 在此示例中使用；然而，也可使用来自其他来源的RNA聚合酶II，包括培养的哺乳动物细胞或酵母中纯化的RNA聚合酶II3,4,5,11,12,13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过添加生物素标记的非模板DNA完成延伸复合物的构建。
	<ol>
		<li>加入5 pmol（1 µL）固定化的非模板DNA寡核苷酸至14 µL非模板DNA缓冲液（来自 表4），加入试管中&#160;从步骤1.3.2开始，于37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>将样本置于磁力架上静置 2 min。用 30 µL 洗涤缓冲液（来自 表7以去除未结合的Pol II和寡核苷酸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成含有放射性标记RNA 23聚体的延伸复合物。
	<ol>
		<li>在30 °C下进行所有后续孵育步骤。加入1 µL 15 µM ATP和10 µCi（1 µL）[α-32P] UTP（3,000 Ci/mmol）加入23 µL脉冲缓冲液中，并用此溶液重悬洗涤后的磁珠。 
		注意： 放射性物质具有危害性。务必穿戴适当的防护装备，并严格遵守实验室关于放射性物质安全使用和处置的所有规定。 
		注意： 当无需使用放射性标记RNA时（如进行蛋白质印迹实验），可用15 µM UTP替代放射性标记的UTP。</li>
		<li>将反应孵育10分钟，以合成放射性标记的23聚体。</li>
		<li>向3.5 µL追加缓冲液中加入1.5 µL含有100 µM ATP和100 µM UTP混合物的溶液，混匀后加入含有预先组装的延伸复合物的离心管中，孵育5分钟，使所有新生转录本延伸至23核苷酸长度。</li>
		<li>将样本置于磁力架上静置2 min，移除上清液，用30 µL洗涤缓冲液洗涤一次，以去除未掺入的核苷酸，然后将样本重悬于30 µL洗涤缓冲液中。</li>
		<li>加入94 µL含有蛋白酶K和糖原的终止混合液（stop mix）表9终止反应，或进入第1.6节以生成含有较长转录本的延伸复合物，或进入第2节进行加帽实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）使 Pol II 行进以生成 23、25 和 29 个核苷酸长度的转录本
	<ol>
		<li>按照步骤 1.2.1 至 1.5.4 中所述的程序进行操作&#160;制备含有放射性标记23mer的延伸复合物。将反应体系扩大4倍，以生成120 µL洗涤后的延伸复合物，足以用于4个反应。</li>
		<li>标记3个新离心管分别为“23mer”、“25mer”和“29mer”。将30 µL洗涤后的延伸复合物转移至“23mer”管中，加入94 µL含蛋白酶K和糖原的终止混合液。</li>
		<li>将含有剩余90 µL洗涤后延伸复合物的离心管置于磁力架上静置2分钟，移除上清液，再将磁珠重悬于90 µL BTB缓冲液中，其中添加1.2 µL 1.5 mM ATP和1.2 µL 1.5 mM CTP。在30 °C下孵育10分钟。</li>
		<li>用90 µL洗涤缓冲液洗涤一次，并按步骤1.5.4所述重新悬浮于90 μL洗涤缓冲液中后，取30 µL延伸复合物转移至“25mer”管，加入94 µL含蛋白酶K和糖原的终止混合液。</li>
		<li>将含有剩余60 µL延伸复合物的离心管置于磁力架上静置2分钟，移除上清液，然后将磁珠重悬于60 µL BTB中，其中添加了各0.8 µL的1.5 mM ATP和1.5 mM CTP。</li>
		<li>在30 °C孵育10分钟，按照1.5.5节方法用60 µL洗涤缓冲液洗涤一次，然后重悬于60 µL洗涤缓冲液中。</li>
		<li>从2x样品中转移30 µL至“29mer”管中，加入94 µL含蛋白酶K和糖原的终止混合液，或直接进入第2节进行加帽反应实验。</li>
		<li>进行RNA纯化与分析（第3节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 利用人工延伸复合物检测共转录加帽
<ol>
	<li>通过将步骤 1.2.1 至 1.5.5 所述的操作程序放大 13 倍，制备含有 23 聚体的洗涤后延伸复合物。此量足够进行 12 次反应，另加 1 次额外反应。</li>
	<li>Pol II CTD 磷酸化
	<ol>
		<li>将含有洗涤后延伸复合物的离心管置于磁力架上 2 分钟，吸除上清液，然后将磁珠重悬于 377 µL BTB 缓冲液中，并加入 13 µL 的 1.5 mM ATP。</li>
		<li>准备两个新离心管，分别标记为 +H 和 -H。向标记为 +H 的管中加入 3 µL 浓度约为 300 ng/µL 的 TFIIH；向标记为 -H 的管中加入 9 µL 的 20&#8201;mM HEPES-NaOH（pH 7.9）、20% 甘油、100&#8201;mM KCl、1&#8201;mM EDTA、0.5&#8201;mg/mL 牛血清白蛋白溶液。 
		注意：我们通常使用从大鼠肝脏中纯化的 TFIIH，但使用市售的重组 Cdk7/Cyclin H/MAT1（CAK，即 TFIIH 的激酶模块）每反应约 0.6 µg 时也获得了类似结果。详见材料表。</li>
		<li>将步骤 2.2.1 中得到的 87 µL 洗涤后延伸复合物加入标记为 +H 的管中，将 270 µL 洗涤后延伸复合物加入标记为 -H 的管中。在 30 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>将样品置于磁力架上 2 分钟。为去除多余的核苷酸和未结合的蛋白质，分别用 90 µL 或 270 µL 洗涤缓冲液洗涤 +H 和 -H 反应中的延伸复合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 加帽
	<ol>
		<li>将标记为 +H 的管中的延伸复合物重悬于 87 µL 加帽反应混合液中（BTB 缓冲液中添加 50 µM GTP（表 10））。将标记为 -H 的管中的延伸复合物重悬于 261 µL 加帽反应混合液中。</li>
		<li>准备 4 个新离心管，分别标记为 5 ng CE+H、5 ng CE、15 ng CE 和 45 ng CE。将加帽酶（CE）稀释于 20&#8201;mM HEPES-NaOH（pH 7.9）、20% 甘油、100&#8201;mM KCl、1&#8201;mM EDTA、0.5&#8201;mg/mL 牛血清白蛋白溶液中，配制成含 5 ng CE/µL、15 ng CE/µL 或 45 ng CE/µL 的溶液，并向上述 4 个管中各加入 3 µL 对应浓度的溶液。</li>
		<li>准备 12 个新离心管，每管中加入 94 µL 终止缓冲液（2.1.1）。</li>
		<li>通过向含有加帽酶的标记管中加入 87 µL 经或未经 TFIIH 处理的延伸复合物，启动各加帽反应。在 30 °C 的加热金属块中孵育。</li>
		<li>在反应 1、2 或 4 分钟后，将各反应体系中的 30 µL 转移至含有 94 µL 终止缓冲液的离心管中以终止反应。按照第 3 节所述方法纯化并分析反应产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. RNA 纯化与分析
<ol>
	<li>纯化 RNA
	<ol>
		<li>将反应产物在终止缓冲液中室温孵育 20 分钟。 
		注意：可暂停步骤。样品在此缓冲液中可保存长达 4 小时，RNA 不会损失或降解。</li>
		<li>先用 124 µL 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿:异戊醇（24:1）抽提一次。 
		注意安全：酚具有极高毒性，可经皮肤快速吸收。操作时需佩戴适当的防护装备。 
		注意：为在抽提过程中最大化回收 RNA，建议使用市售含高密度凝胶的离心管，该凝胶可在水相与有机相之间形成稳定屏障。详见讨论部分及材料表。</li>
		<li>将水相（上层）转移至含有 12.4 µL 3 M 乙酸钠（pH 5.2）的新离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乙醇沉淀
	<ol>
		<li>加入 350 µL 100% 乙醇，通过反复倒置充分混匀。</li>
		<li>在干冰上孵育至少 10 分钟。 
		注意：可暂停步骤。为方便起见，可在此暂停，并于次日继续操作；但也可直接进入步骤 3.3，并在同一天完成凝胶电泳。RNA 可在 -80 °C 保存数天后再进行后续处理，但不宜存放更长时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于凝胶电泳的 RNA 样品
	<ol>
		<li>让样品自然解冻，倒置混匀 2–3 次，然后在台式离心机中于 4 °C、21,000 x g 离心 15 分钟。同时，配制变性凝胶混合液（见第 3.4.1 节）。</li>
		<li>小心移除样品中的乙醇，避免扰动沉淀。</li>
		<li>加入 500 µL 70% 乙醇，轻轻倒置离心管数次以洗涤沉淀，然后在室温或 4 °C 下以 21,000 x g 再次离心 5 分钟。</li>
		<li>尽可能吸除乙醇，并在台式离心机中短暂离心（5–10 秒）。随后使用加样枪头吸除残留的微量乙醇。</li>
		<li>将沉淀在室温下空气干燥 3 分钟。</li>
		<li>在每份沉淀上方加入 4 µL H2O 以溶解 RNA，室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>向混合液中加入 4 µL 2x RNA 上样染料（见材料表），然后涡旋震荡数秒，使 RNA 完全重悬。 
		注意：推荐使用含甲酰胺而非尿素的 RNA 染料，因为后者在低温下易析出沉淀。</li>
		<li>短暂离心后，将样品在金属浴中 70 °C 孵育 10 分钟。</li>
		<li>将样品管置于干冰上，待凝胶准备上样时再使用。 
		注意：将 RNA 保存在干冰上，可在凝胶聚合期间灵活开展其他实验。样品解冻后无需再次加热。然而，若凝胶已准备好，RNA 也可在加热后直接上样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制尿素-PAGE 凝胶
	<ol>
		<li>配制 40 mL 凝胶混合液：在 50 mL 锥形管中加入 16.7 g 尿素、15 mL 40% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺溶液（19:1）、4 mL 10x TBE 缓冲液（1 M Tris-HCl, 1 M 硼酸钠, 20 mM EDTA）和 8 mL H2O。此体积适用于一块标准尺寸凝胶（18 cm 高 × 16 cm 宽），使用 1.0 mm 间隔垫。 
		注意安全：丙烯酰胺具有极高毒性。尽管溶液状态无吸入风险，但操作时仍需始终穿戴实验服、手套和护目镜。 
		注意：该混合液用于灌制变性 15% 聚丙烯酰胺凝胶，可有效分离长度为 15–50 nt 的 RNA。可根据需要调整双丙烯酰胺/丙烯酰胺浓度，以分辨不同长度的 RNA 转录本。</li>
		<li>将装有凝胶混合液的密闭离心管置于摇床上，直至尿素完全溶解。</li>
		<li>设置凝胶灌制装置，包括玻璃板、1 mm 间隔垫和 15 孔梳子。</li>
		<li>迅速向凝胶溶液中加入 40 µL TEMED 和 400 µL 10% 过硫酸铵溶液，充分混匀。使用 25 mL 移液管将凝胶液注入玻璃板之间，插入梳子，并静置至少 2 小时使其充分聚合。 
		注意：若凝胶在使用前超过 2 小时灌制完成，聚合后应使用湿润的纸巾覆盖（保持梳子在位），再用保鲜膜包裹，以防干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>变性凝胶 RNA 电泳
	<ol>
		<li>凝胶聚合完成后，将其转移至电泳槽中，在 1x TBE 缓冲液中以 20 mA 预电泳 15–30 分钟。</li>
		<li>同时，将样品解冻（如已冷冻），涡旋混匀，并在 4 °C、2,000 x g 离心 4 分钟。</li>
		<li>准备上样时，关闭电源，用注射器吸取 1x TBE 缓冲液小心冲洗每个加样孔。</li>
		<li>使用加样枪头将样品加入凝胶孔中。</li>
		<li>以恒定电流 20–30 mA 电泳约 2 小时，或直至下层染料（二甲苯青 FF）迁移至凝胶底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取出凝胶，置于一张吸水纸上，并用保鲜膜包裹。</li>
	<li>将放射性标记的凝胶暴露于磷屏。</li>
	<li>使用磷屏成像仪扫描磷屏并分析图像。</li>
</ol>

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<li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li>
<li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li>
<li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

研究旨在解析与RNA聚合酶II延伸复合物相关事件（如RNA加工及转录延伸本身的调控）时，使用高度纯化的酶系统可极大促进此类研究。然而，建立此类酶系统具有挑战性。RNA聚合酶II依赖启动子的转录至少需要五种通用转录因子。制备并储备这些因子可能耗时数月；因此，该过程中的限速步骤通常是制备在体外重建基础转录所必需的一系列转录因子。
本文介绍了一种对先前已建立的方法进行改进的方案，该方法仅使用纯化的Pol II以及合成的DNA和RNA寡核苷酸来构建人工转录延伸复合物2,3。所获得的延伸复合物具有转录活性，适用于研究Pol II转录与RNA加帽之间的偶联过程5。需要强调的是，转录和RNA加帽在体内是在染色质环境及多种其他蛋白质共同参与下进行的，而本体系中并未包含这些成分；因此，该体系可重现体内反应的许多特征，但并非全部。本文所述方案在先前方法的基础上，通过将生物素标记的DNA与磁珠结合，实现对人工延伸复合物的固定化，从而使研究人...

真核生物信使RNA（mRNA）的合成是一个复杂的生化过程，包括由RNA聚合酶II合成未加工的前体RNA，以及对该前体RNA进行加工以产生成熟的mRNA。加帽、剪接和多聚腺苷酸化等RNA加工步骤主要在转录过程中协同完成。RNA聚合酶II延伸复合物作为支架，招募并协调多种RNA加工酶的活性。因此，要深入理解成熟真核mRNA的生成机制，关键在于建立实验体系，以解析RNA加工酶被招募至延伸复合物以及这些酶在共转录加帽、剪接和多聚腺苷酸化过程中受调控的生化机制。
毫不奇怪，此类实验系统的建立一直十分困难。主要障碍在于Pol II转录过程本身具有显著的复杂性，仅在体外重建Pol II的基础转录，就至少需要五种通用转录起始因子：TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH1。此外，在体外重建任何一种受调控的Pol II转录过程，则需要更多种类的转录因子和共调节因子。因此，一个重要的目标一直是开发更简单的实验系统，以重建适用于研究Pol II转录与RNA加工功能偶联的活性Pol II延伸复合物。
一种用于重建具有活性的Pol II延伸复合物的较简单方法，已被证明对研究延伸状态下的Pol II的结构与生物化学特性具有重要价值，最近还被用于研究共转录RNA加工过程2,3,4,5。本文中，我们展示了如何利用纯化的Pol II和合成的转录泡制备Pol II延伸复合物，以有效研究新生Pol II转录本共转录加帽机制的分子基础。
加帽是指将一个5’-鸟苷“帽”共价添加到新生Pol II转录本的5’-三磷酸末端的过程。该帽结构对于mRNA成熟、转运、翻译及其他后续步骤具有重要作用6,7。加帽酶（capping enzyme）在转录过程中将帽结构添加至Pol II转录本上。在哺乳动物细胞中，加帽酶所具有的RNA 5’-三磷酸酶和鸟苷酰转移酶活性位点位于同一条多肽链内8。加帽酶通过与Pol II复合体上尚未明确的表面区域以及在其七肽重复序列中第5位丝氨酸（Ser5）发生磷酸化的Rpb1羧基末端结构域（CTD）相互作用，被招募至Pol II延伸复合体中5。在延伸复合体中，当新生转录本长度达到至少18个核苷酸并已从聚合酶的RNA出口通道中露出时，加帽酶即催化5’-鸟苷帽的添加。加帽反应的第一步是由三磷酸酶将RNA 5’-三磷酸水解为5’-二磷酸；第二步由鸟苷酰转移酶将GTP水解为GMP，形成GMP-加帽酶中间体；最后，鸟苷酰转移酶将GMP转移至新生转录本的5’-二磷酸末端，从而形成帽结构。
加帽反应的一个显著特征是，共转录加帽（即与功能性Pol II延伸复合物相关的转录本的加帽）比游离RNA的加帽效率高得多5,9。因此，该领域的一个关键问题是，加帽酶如何通过与Pol II延伸复合物的相互作用，实现对加帽过程的显著激活。在本实验方案中，我们描述了仅使用纯化的RNA聚合酶II和人工转录泡来组装具有活性的RNA聚合酶II延伸复合物的方法。这些方法可用于构建转录本长度和序列均明确的RNA聚合酶II延伸复合物。在最近的一项研究中，我们利用这些定义明确的RNA聚合酶II延伸复合物作为模型，研究了RNA加帽机制的若干方面5。具体而言，我们发现：（i）与这些延伸复合物相关的RNA加帽效率比游离RNA的加帽高出100倍以上；（ii）该过程可被TFIIH依赖性的Pol II CTD磷酸化所促进。此处描述的方法原则上可被调整用于生成研究其他与Pol II延伸复合物相关的共转录RNA加工反应的底物。
在本实验方案的第1部分中，通过将合成的模板链DNA寡核苷酸与一段RNA寡核苷酸退火，形成人工延伸复合物，该RNA寡核苷酸的3’端与模板链DNA的约9个核苷酸互补。随后将Pol II加载到DNA:RNA双链上。再加入一条部分互补的非模板链DNA寡核苷酸（其3’端标记有生物素），完成延伸复合物的组装（图1 和 图2A）。在这些延伸复合物中，Pol II可延伸RNA寡核苷酸，在加入适当组合的放射性标记核苷酸后，生成具有确定长度和序列的放射性标记转录本。此外，通过一系列洗涤步骤去除未掺入的核苷酸，并进一步加入不同组合的核苷酸，可使Pol II沿DNA模板“行走”至不同位置，从而合成特定长度的RNA。随后纯化RNA，并在变性尿素-PAGE凝胶中进行电泳分析。在本实验方案的第2部分中，利用人工延伸复合物分析共转录RNA加帽过程。所展示的示例用于检测TFIIH依赖性的Pol II CTD磷酸化对共转录RNA加帽的影响。在该实验中，我们检测了共转录加帽程度随加帽酶浓度（每反应5、15和45 ng）和时间（1、2和4分钟）的变化情况。

<table><tbody><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG007H001MC</td><td>用于RNA放射性标记</td></tr><tr><td>2x RNA上样缓冲液</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>B0363S</td><td>强烈推荐。用于RNA上样前的样品制备</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺:Bis溶液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610144</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（20 mg/mL）</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Cdk7/Cyclin H/MAT1（CAK复合物）蛋白，具有活性，10 &amp;micro;g</td><td>Millipore Sigma</td><td>14-476</td><td>用于磷酸化Pol II CTD</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸</td><td>IDT</td><td></td><td>纯度要求详见表8</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1磁珠</td><td>赛默飞世尔科技（Life Technologies Invitrogen）</td><td>65001</td><td>我们也曾使用Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠且无问题，但更倾向于使用MyOne链霉亲和素磁珠，因其沉降速度更慢</td></tr><tr><td>GlycoBlue共沉淀剂（15&amp;thinsp;mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技（Life Technologies Invitrogen）</td><td>AM9516</td><td>强烈推荐。可使核酸沉淀呈现蓝色，显著提高反应操作的便利性</td></tr><tr><td>Hoefer SE600标准双冷却垂直电泳系统，配备1 mm间隔垫片和15孔梳子</td><td>Hoefer</td><td>SE600-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>MaXtract高密度管（1.5 mL）</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td>强烈推荐。含有高密度凝胶，可在水相与有机相之间形成稳定屏障，提高RNA提取得率</td></tr><tr><td>蛋白酶K溶液（20&amp;thinsp;mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技（Life Technologies Invitrogen）</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNA寡核苷酸</td><td>Trilink</td><td></td><td>更多细节详见表8</td></tr><tr><td>酵母无机焦磷酸酶（100单位/mL）</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>NEBM2403S</td><td>仅在加帽反应期间需要</td></tr></tbody></table>

用于解析共转录 rna 加工事件的人工 rna 聚合酶 ii 延伸复合物

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

真核生物mRNA的合成是一个复杂的生化过程，需要由多亚基酶RNA聚合酶II将DNA模板转录为前体RNA，并通过共转录的加帽和剪接过程将前体RNA加工为成熟的mRNA。在mRNA合成过程中，RNA聚合酶II延伸复合物会受到大量转录因子的调控，这些因子不仅调控其催化活性，还调控参与mRNA成熟过程的加帽、剪接以及3'端加工酶的活性。由于mRNA合成本身具有内在复杂性，因此建立能够分离并研究其各个共转录阶段的简化实验体系具有重要意义。
本文介绍了一种适用于研究共转录RNA加帽的简单实验系统。该系统依赖于由纯化的RNA聚合酶II和人工转录泡组装而成的定义明确的RNA聚合酶II延伸复合物。当通过生物素标记的DNA固定后，这些RNA聚合酶II延伸复合物可作为一种易于操作的工具，用于解析共转录RNA加帽过程，以及延伸复合物在共转录RNA加帽过程中招募和调控加帽酶的机制。我们预计，该系统还可被改造用于研究其他mRNA成熟阶段中与RNA聚合酶II延伸复合物偶联的蛋白质或蛋白质复合物的招募和/或组装过程。

图2 和 3 展示了用于生成含不同长度转录本的人工延伸复合物的代表性反应结果，该复合物由不同来源的Pol II延伸形成。图4 描述了如何利用这些延伸复合物检测共转录的CTD磷酸化依赖性RNA加帽反应。
图2A 是人工延伸复合物中DNA和RNA分子的示意图。图2B 显示了按照方案1中所述条件完全相同的反应所生成的不同长度的转录产物，其中起始的人工延伸复合物是使用20个核苷酸（nt）的合成RNA寡核苷酸（图2A 中深蓝色部分；RNA_20mer，表1）制备的。由于已知起始RNA的长度和DNA模板序列，因此可以确定将Pol...

本文描述了仅需短合成DNA和RNA寡核苷酸以及纯化的RNA聚合酶II（Pol II）即可组装Pol II延伸复合物的方法。这些复合物可用于研究与Pol II延伸复合物相关的转录过程中RNA加工机制。

用于解析共转录 RNA 加工事件的人工 RNA 聚合酶 II 延伸复合物

真核生物mRNA的合成是一个复杂的生化过程，需要由多亚基酶RNA聚合酶以DNA为模板转录生成前体RNA……

在此，我们建立了一个简单的实验体系，可用于重建具有活性的RNA聚合酶II（Pol II）转录延伸复合物，适用于研究Pol II转录与RNA加帽功能之间的偶联作用。利用该方法，仅需少量组分即可便捷地组装出具有功能的延伸复合物。延伸复合物可固定于磁珠上，因此易于更换反应条件。将含有生物素的DNA寡核苷酸固定在磁珠上时，首先将200微升磁珠加入低蛋白结合力的1.5毫升离心管中，然后将离心管置于磁力架上静置2分钟。在离心管处于磁力架上的同时，使用移液器小心吸出管内液体，避免扰动磁珠。为洗涤磁珠，将离心管从磁力架上取下，加入1毫升含有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-hydrochloride）、乙二胺四乙酸（EDTA）和氯化钠的洗涤缓冲液。将试管放回试管架。两分钟后，吸出洗涤液，再用200微升相同缓冲液重复洗涤两次。用400微升2X缓冲液重悬磁珠。然后，向混合物中加入 380 微升水和 20 微升 10 微摩尔的非模板生物素化 DNA 寡核苷酸。将离心管置于旋转混合仪上，在室温下孵育 30 分钟。随后，使用 200 微升缓冲液洗涤带有固定化非模板 DNA 寡核苷酸的磁珠 3 次，再用 200 微升储存与稀释缓冲液洗涤 3 次。将离心管于4 °C条件下过夜孵育，以完成用BSA封闭磁珠的步骤。次日，弃去溶液，将磁珠重悬于200 µL储存与稀释缓冲液中，使DNA浓度约为5 µmol/L，随后将含磁珠的溶液转移至新的离心管中。为获得DNA-RNA双链，按照书面实验方案所述，在PCR管中配制10 µL退火混合液，其中RNA与DNA的摩尔比为2:1。将试管放入热循环仪中。设置程序为45 °C孵育5分钟，随后进行12个循环，每个循环2分钟，起始温度为43 °C，每个循环温度降低2 °C。最后在4 °C条件下静置。为了将纯化的RNA聚合酶II加载到DNA-RNA杂交链上，取1微升DNA-RNA双链与13微升新配制的RNA聚合酶II缓冲液在离心管中混合。加入1微升纯化的RNA聚合酶II，通过轻轻吹打并用移液器枪头搅拌混合，避免产生气泡。将离心管在30°C下孵育10分钟。为完成延伸复合物，将1微升固定化的非模板DNA寡核苷酸磁珠加入14微升非模板DNA缓冲液中，再将15微升混合液加入先前孵育的试管中，在37摄氏度下继续孵育10分钟。将样品置于磁力架上2分钟。用30微升洗涤缓冲液洗涤样品一次，以去除未结合的聚合酶II和寡核苷酸。为了用RNA 23聚体对延伸复合物进行放射性标记，向23微升脉冲缓冲液中加入1微升ATP和1微升放射性标记的UTP，并将此混合液加入经洗涤的磁珠中以重悬。孵育反应10分钟，以合成放射性标记的23聚体。将含有100微摩尔ATP和100微摩尔UTP混合液的1.5微升溶液加入3.5微升的追加缓冲液中，并将该混合液加入含有磁珠上预组装延伸复合物的离心管中。再次将离心管孵育5分钟，以促使所有新生转录本延伸至23个核苷酸长度。随后，将离心管置于磁力架上，按先前步骤进行洗涤，以去除未掺入的核苷酸。最后，将样品重悬于30 µL洗涤缓冲液中。为了生成具有较长转录本的延伸复合物，请按照之前的步骤操作，并将体系扩大四倍，以制备120微升洗涤后的延伸复合物，用于四个反应。标记三个新试管分别为23mer、25mer和29mer。将30微升洗涤后的延伸复合物转移至23mer试管中，并加入含有蛋白酶K和糖原的94微升终止混合液。将含有剩余90微升洗涤后延伸复合物的离心管置于磁力架上静置2分钟，移除上清液，然后用90微升BTB缓冲液重悬磁珠，该缓冲液中添加了1.2微升ATP和CTP。在30摄氏度下孵育10分钟。用90微升洗涤缓冲液洗涤后，取30微升延伸复合物转移至25mer离心管中，并加入含有蛋白酶K和糖原的94微升终止混合液。再次将含有剩余60 µL延伸复合物的离心管置于磁力架上静置2分钟。用60 µL缓冲液（其中添加0.8 µL ATP和CTP）重复BTB处理。孵育并按前述方法洗涤后，将样品重悬于60 µL洗涤缓冲液中。将30微升样品转移至29mer试管中，并加入含有蛋白酶K和糖原的94微升终止混合液。在变性聚丙烯酰胺凝胶上分析反应产物。首先，通过将先前描述的方法放大13倍，制备含有23mer的洗涤后延伸复合物，以获得用于12个反应及一个额外反应的390微升体系。为进行聚合酶II CTD的磷酸化，将样品置于磁力架上后去除上清液，并将磁珠重悬于377微升BTB中。标记两个新离心管，分别标注为“加H”和“不加H”。向“加H”管中加入3微升浓度为300纳克/微升的转录起始因子TFIIH，向“不加H”管中加入9微升储存与稀释缓冲液。将87微升洗涤后的延伸复合物加入“加H”管，261微升加入“不加H”管。将试管孵育10分钟，并用洗涤缓冲液洗涤。进行RNA加帽时，向加H管中加入87微升加帽混合液，向减H管中加入261微升加帽混合液以重悬。标记四个新试管，分别为5加H、5减H、15减H和45减H，并向对应的试管中分别加入3微升浓度为5、15或45纳克/微升的加帽酶。然后，准备12个新离心管，每管中加入94微升终止缓冲液。通过将87微升经TFIIH处理的延伸复合物加入标记为“5 + H”的离心管中，启动第一个加帽反应。在30摄氏度的加热块中孵育。加帽反应必须使用秒表精确计时。进行多个反应操作时，应依次错开每个反应的起始时间。在反应开始后一、二或四分钟时，分别取30微升的“五加”反应混合物，转移至标记为一、二、三的试管中（每管含94微升终止缓冲液），以终止反应。对于剩余的不含H试管中的样品，以完全相同的方式进行加帽反应，使用未添加TFIIH处理的延伸复合物。在变性聚丙烯酰胺凝胶上分析反应产物。图中显示了人工延伸复合物中的DNA和RNA分子。在组装人工延伸复合物时，使用20个核苷酸的合成RNA寡核苷酸作为RNA引物，在每一步连续的行走步骤中加入核苷酸，以生成23聚体、25聚体和29聚体。比较了使用不同来源的RNA聚合酶II进行的反应。利用从大鼠肝脏或裂殖酵母中纯化的内源性野生型RNA聚合酶II组装了人工延伸复合物，并使其延伸生成23聚体或25聚体。通过一项检测，测量了与含有23个核苷酸、具有5'三磷酸末端的放射性标记转录本相关的人工延伸复合物的加帽情况。最后两列显示了在存在 TFIIH 的情况下，加帽酶复合物在有或无加帽酶时反应产物的结果。迁移较慢和较快的条带分别包含已加帽和未加帽的转录本。前 12 列显示了与具有磷酸化或非磷酸化 CTD 的延伸复合物相关的转录本的加帽情况。聚合酶II及其他酶的活性可能因制备批次不同而有所差异，因此有必要通过滴定酶浓度来优化反应条件，以确定最佳酶用量。使用放射性物质时必须注意安全，并避免污染。进行放射性实验时，请务必遵守您所在实验室及机构的相关安全规范。

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