用于分离共转录RNA处理事件的人工RNA聚合酶II伸长复合物

在这里，我们建立了一个简单的实验系统，允许重组适合研究Pol II转录和RNA封顶功能耦合的有源Pol II伸长复合物。使用这种方法，只需几个组件就可以轻松组装功能伸长复合物。伸长复合物固定在磁珠上，因此很容易改变反应条件。

要固定磁珠上含有生物素的DNA寡头，首先将200微升磁珠加入低蛋白结合1.5毫升管中，然后将磁悬浮管放在磁架上两分钟。当管子在磁架上时，使用移液器将液体从管子中去除，而不会干扰磁珠。要清洗珠子，请从机架上取出管子，并加入一毫升含有三氧化三氧化、EDTA 和氯化钠的洗涤缓冲液。

将管子返回到机架。两分钟后，取出洗涤液，再使用同一缓冲液的 200 微升重复洗涤两次。将磁珠重新悬浮在 400 微升 2X 缓冲器中。

然后，加入380微升水和20微升10微摩尔非模板生物基化DNA寡糖混合。将管子放在螺母上，在室温下孵育30分钟。之后，使用200微升缓冲液用固定非模板DNA寡糖三次清洗珠子，然后用200微升的储存和稀释缓冲液洗涤三次。

将管子在四摄氏度下过夜，用 BSA 完成珠子堵塞。第二天，丢弃溶液，将珠子重新在200微升的储存和稀释缓冲液中，达到5微摩尔的近似DNA浓度，然后用珠子将溶液转移到新管中。为了获得DNA-RNA双面体，在PCR管中准备一个10微升退火组合，其RNA-DNA摩尔比为2比1，如书面协议中所述。

将管子放在热循环器中。将程序设置为 45 摄氏度，每次 5 分钟，然后是 12 个周期，每个周期为 2 分钟，从 43 摄氏度开始，每个周期温度降低 2 摄氏度。最后，保持四摄氏度的怠速。

要将纯化的RNA聚合酶II加载到DNA-RNA混合物中，在管中将DNA-RNA双性复用的1微升与13微升新鲜准备的聚合酶II缓冲液混合。加入一个纯化RNA聚合酶II微升，轻轻上下移液，用移液器尖端搅拌，不产生气泡。在30摄氏度下孵育管子10分钟。

要完成伸长复合物，在14微升非模板DNA缓冲液中加入一微升固定非模板DNA寡糖珠，将15微升混合物加入先前孵化的管子，并在37摄氏度下再孵育10分钟。将样品放在磁性机架上两分钟。用30微升洗涤缓冲液清洗样品一次，以去除未合成的聚合酶II和寡糖。

要用RNA 23mer对伸长复合物进行放射性标记，在23微升脉冲缓冲液中加入一个ATP微升和一微升放射性标记的UTP，并将这种混合物添加到洗涤的磁珠中以重新悬浮。孵育反应10分钟，允许合成放射性标记的23mer。将含有100微摩尔ATP和100微摩尔UTP混合物的1.5微升溶液加入3.5微升的追逐缓冲液中，并将混合物加入含有珠子上预组装伸长复合物的管中。

再次，孵育管5分钟，追逐所有新生的成绩单到23默。然后，将管子放在磁架上，然后像以前一样清洗，以去除未合并的核苷酸。将样品重新在 30 微升洗涤缓冲液中。

要生成具有较长笔录的伸长复合物，请按照以前的程序进行扩展四倍，生成 120 微升洗涤伸长复合物，用于四种反应。标记三个新管 23mer， 25mer 和 29mer.将30微升洗涤的伸长复合物转移到23mer管中，并加入94微升含有蛋白酶K和糖原的停止混合物。

将装有其余 90 微升的洗涤伸长复合物的管子放在磁架上两分钟，取出上经剂，并在 BTB 的 90 微升中重新悬浮珠子，并辅以 1.2 微升 ATP 和 CTP。在30摄氏度下孵育10分钟。用90微升洗涤缓冲液洗涤后，将30微升的伸长复合物转移到25mer管中，并加入94微升含有蛋白酶K和糖原的停止混合物。

再次，将装有剩余 60 微升伸长复合物的管放在磁架上两分钟。使用 60 微升缓冲液重复 BTB 处理，并辅以 0.8 微升 ATP 和 CTP。在孵育和清洗后，将样品重新用60微升洗涤缓冲液中重新暂停。

将30微升从样品转移到29mer管，并加入94微升含有蛋白酶K和糖原的停止混合物。分析变性多丙烯酰胺凝胶上的反应产品。首先，通过放大之前描述的13倍程序，生成含有23mer的洗涤伸长复合物，以获得390微升，用于12次反应和1次额外反应。

为了对聚合酶 II CTD 进行磷酸化，将样品放入磁架后去除上经剂，并将珠子重新悬浮在 BTB 的 377 微升中。标注两个新管加 H 和减 H.To 加 H，以每微升 300 纳米的浓度添加转录起始因子 TFIIH 的三微升，并添加 9 微升的存储和稀释缓冲液。将 87 微升的洗涤伸长复合物添加到加 H 管中，在负 H 管中加入 261 微升。

孵育管10分钟，用洗涤缓冲液清洗。要执行RNA封顶，在加H管中加入87微升封盖混合物，在负H管中加入261微升以重新暂停。标记四个新管，五加H，五减H，15减H，和45减H，并分配三微升的5，15，或45纳米每微升封盖酶到相应的管。

然后，准备12个新管与94微升停止缓冲液。开始第一次封盖反应，将87微升的伸长复合物加入标有5加H.孵化的管中，在30摄氏度的高温块中处理TFIIH。使用秒表对封顶反应进行精确定时。

处理多个反应时，每个反应的开始时间应交错。在一、二、四分钟后，将五加反应混合物中的30微升转移到标有一、二和三个含有94微升停止缓冲液的管子上，以停止反应。使用未 TFIIH 处理的伸长复合物，以完全相同的方式继续对剩余减 H 管中的样品进行封顶反应。

分析变性多丙烯酰胺凝胶上的反应产品。此处显示了人工伸长复合物中的DNA和RNA分子的图。在人工伸长复合物的组装过程中，使用20个核苷酸的合成RNA寡糖作为RNA底因，在协议的每个连续行走步骤中加入核苷酸，生成23mer、25mer和29mer。

比较了不同来源RNA聚合酶II的反应。人工伸长复合物由内源性野生型聚合酶II组装，从大鼠肝脏或裂变酵母中纯化，然后步行产生23默或25默。进行了一项检测，以测量与人工伸长复合物相关的放射性标记记录片的封顶，这些转录物包含23个核苷酸转录本，其端有5个主要三磷酸盐。

最后两条通道显示了在TFIIH存在的情况下，用或不带封盖酶孵育的拉长复合物的反应产品。更缓慢和速度较慢的迁移波段分别包含封顶和未封顶的脚本。前 12 条通道显示与拉长复合物相关的与磷酸化或无磷化 CTD 相关的成绩单的封顶。

聚合酶 II 和其他酶的活动可能因准备而有所不同，因此有必要通过滴定酶浓度来优化反应条件，以定义最佳水平。安全使用放射性物质和避免污染非常重要。在进行放射性实验时，请务必遵循实验室和研究所指南。