用于解析共转录 RNA 加工事件的人工 RNA 聚合酶 II 延伸复合物

在此，我们建立了一个简单的实验体系，可用于重建具有活性的RNA聚合酶II（Pol II）转录延伸复合物，适用于研究Pol II转录与RNA加帽功能之间的偶联作用。利用该方法，仅需少量组分即可便捷地组装出具有功能的延伸复合物。延伸复合物可固定于磁珠上，因此易于更换反应条件。

将含有生物素的DNA寡核苷酸固定在磁珠上时，首先将200微升磁珠加入低蛋白结合力的1.5毫升离心管中，然后将离心管置于磁力架上静置2分钟。在离心管处于磁力架上的同时，使用移液器小心吸出管内液体，避免扰动磁珠。为洗涤磁珠，将离心管从磁力架上取下，加入1毫升含有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-hydrochloride）、乙二胺四乙酸（EDTA）和氯化钠的洗涤缓冲液。

将试管放回试管架。两分钟后，吸出洗涤液，再用200微升相同缓冲液重复洗涤两次。用400微升2X缓冲液重悬磁珠。

然后，向混合物中加入 380 微升水和 20 微升 10 微摩尔的非模板生物素化 DNA 寡核苷酸。将离心管置于旋转混合仪上，在室温下孵育 30 分钟。随后，使用 200 微升缓冲液洗涤带有固定化非模板 DNA 寡核苷酸的磁珠 3 次，再用 200 微升储存与稀释缓冲液洗涤 3 次。

将离心管于4 °C条件下过夜孵育，以完成用BSA封闭磁珠的步骤。次日，弃去溶液，将磁珠重悬于200 µL储存与稀释缓冲液中，使DNA浓度约为5 µmol/L，随后将含磁珠的溶液转移至新的离心管中。为获得DNA-RNA双链，按照书面实验方案所述，在PCR管中配制10 µL退火混合液，其中RNA与DNA的摩尔比为2:1。

将试管放入热循环仪中。设置程序为45 °C孵育5分钟，随后进行12个循环，每个循环2分钟，起始温度为43 °C，每个循环温度降低2 °C。最后在4 °C条件下静置。

为了将纯化的RNA聚合酶II加载到DNA-RNA杂交链上，取1微升DNA-RNA双链与13微升新配制的RNA聚合酶II缓冲液在离心管中混合。加入1微升纯化的RNA聚合酶II，通过轻轻吹打并用移液器枪头搅拌混合，避免产生气泡。将离心管在30°C下孵育10分钟。

为完成延伸复合物，将1微升固定化的非模板DNA寡核苷酸磁珠加入14微升非模板DNA缓冲液中，再将15微升混合液加入先前孵育的试管中，在37摄氏度下继续孵育10分钟。将样品置于磁力架上2分钟。用30微升洗涤缓冲液洗涤样品一次，以去除未结合的聚合酶II和寡核苷酸。

为了用RNA 23聚体对延伸复合物进行放射性标记，向23微升脉冲缓冲液中加入1微升ATP和1微升放射性标记的UTP，并将此混合液加入经洗涤的磁珠中以重悬。孵育反应10分钟，以合成放射性标记的23聚体。将含有100微摩尔ATP和100微摩尔UTP混合液的1.5微升溶液加入3.5微升的追加缓冲液中，并将该混合液加入含有磁珠上预组装延伸复合物的离心管中。

再次将离心管孵育5分钟，以促使所有新生转录本延伸至23个核苷酸长度。随后，将离心管置于磁力架上，按先前步骤进行洗涤，以去除未掺入的核苷酸。最后，将样品重悬于30 µL洗涤缓冲液中。

为了生成具有较长转录本的延伸复合物，请按照之前的步骤操作，并将体系扩大四倍，以制备120微升洗涤后的延伸复合物，用于四个反应。标记三个新试管分别为23mer、25mer和29mer。将30微升洗涤后的延伸复合物转移至23mer试管中，并加入含有蛋白酶K和糖原的94微升终止混合液。

将含有剩余90微升洗涤后延伸复合物的离心管置于磁力架上静置2分钟，移除上清液，然后用90微升BTB缓冲液重悬磁珠，该缓冲液中添加了1.2微升ATP和CTP。在30摄氏度下孵育10分钟。用90微升洗涤缓冲液洗涤后，取30微升延伸复合物转移至25mer离心管中，并加入含有蛋白酶K和糖原的94微升终止混合液。

再次将含有剩余60 µL延伸复合物的离心管置于磁力架上静置2分钟。用60 µL缓冲液（其中添加0.8 µL ATP和CTP）重复BTB处理。孵育并按前述方法洗涤后，将样品重悬于60 µL洗涤缓冲液中。

将30微升样品转移至29mer试管中，并加入含有蛋白酶K和糖原的94微升终止混合液。在变性聚丙烯酰胺凝胶上分析反应产物。首先，通过将先前描述的方法放大13倍，制备含有23mer的洗涤后延伸复合物，以获得用于12个反应及一个额外反应的390微升体系。

为进行聚合酶II CTD的磷酸化，将样品置于磁力架上后去除上清液，并将磁珠重悬于377微升BTB中。标记两个新离心管，分别标注为“加H”和“不加H”。向“加H”管中加入3微升浓度为300纳克/微升的转录起始因子TFIIH，向“不加H”管中加入9微升储存与稀释缓冲液。将87微升洗涤后的延伸复合物加入“加H”管，261微升加入“不加H”管。

将试管孵育10分钟，并用洗涤缓冲液洗涤。进行RNA加帽时，向加H管中加入87微升加帽混合液，向减H管中加入261微升加帽混合液以重悬。标记四个新试管，分别为5加H、5减H、15减H和45减H，并向对应的试管中分别加入3微升浓度为5、15或45纳克/微升的加帽酶。

然后，准备12个新离心管，每管中加入94微升终止缓冲液。通过将87微升经TFIIH处理的延伸复合物加入标记为“5 + H”的离心管中，启动第一个加帽反应。在30摄氏度的加热块中孵育。加帽反应必须使用秒表精确计时。

进行多个反应操作时，应依次错开每个反应的起始时间。在反应开始后一、二或四分钟时，分别取30微升的“五加”反应混合物，转移至标记为一、二、三的试管中（每管含94微升终止缓冲液），以终止反应。对于剩余的不含H试管中的样品，以完全相同的方式进行加帽反应，使用未添加TFIIH处理的延伸复合物。

在变性聚丙烯酰胺凝胶上分析反应产物。图中显示了人工延伸复合物中的DNA和RNA分子。在组装人工延伸复合物时，使用20个核苷酸的合成RNA寡核苷酸作为RNA引物，在每一步连续的行走步骤中加入核苷酸，以生成23聚体、25聚体和29聚体。

比较了使用不同来源的RNA聚合酶II进行的反应。利用从大鼠肝脏或裂殖酵母中纯化的内源性野生型RNA聚合酶II组装了人工延伸复合物，并使其延伸生成23聚体或25聚体。通过一项检测，测量了与含有23个核苷酸、具有5'三磷酸末端的放射性标记转录本相关的人工延伸复合物的加帽情况。

最后两列显示了在存在 TFIIH 的情况下，加帽酶复合物在有或无加帽酶时反应产物的结果。迁移较慢和较快的条带分别包含已加帽和未加帽的转录本。前 12 列显示了与具有磷酸化或非磷酸化 CTD 的延伸复合物相关的转录本的加帽情况。

聚合酶II及其他酶的活性可能因制备批次不同而有所差异，因此有必要通过滴定酶浓度来优化反应条件，以确定最佳酶用量。使用放射性物质时必须注意安全，并避免污染。进行放射性实验时，请务必遵守您所在实验室及机构的相关安全规范。