Name: 胎儿和新生儿小鼠长骨的培养与测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学习胎儿和新生儿小鼠长骨离体培养与测量技术，用于研究骨骼发育和软骨稳态。该方法支持活体成像和药物处理，可分离局部遗传效应与全身影响，为骨生物学研究提供精确可控的实验平台。

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我们感谢 Alexandra Joyner 在本方案建立过程中提供的支持，感谢 Edwina McGlinn 和 Yi-cheng Chang 分享视黄酸。澳大利亚再生医学研究所获得了维多利亚州政府和澳大利亚政府资助项目的支持。

所有实验均应遵循当地政府和机构关于实验动物伦理管理的指导原则进行。
1. 骨培养实验前的准备工作
<ol>
	<li>设置定时交配的小鼠以获取胚胎第14.5天（E14.5）及之后的胎鼠和仔鼠。 
	注意：长骨培养可成功应用于不同小鼠品系；本方案中使用远交型Swiss Webster野生型小鼠。</li>
	<li>准备解剖培养基（改编自Houston等15）：将α-最低必需培养基（α-MEM）或杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）用磷酸盐缓冲液（PBS）按1/13稀释，并加入2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA），通过0.22 µm、33 mm直径的注射器滤器过滤除菌。分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>在提取胎鼠的前一天，准备无血清骨培养基，其成分为含0.2% BSA、0.5 mM L-谷氨酰胺、40 U/mL青霉素/链霉素、0.05 mg/mL抗坏血酸和1 mM β-甘油磷酸钠的DMEM。通过0.22 µm、33 mm直径的注射器滤器过滤除菌，4 °C保存，可使用长达1个月。</li>
	<li>在培养当天，于处死小鼠前，用解剖培养基准备24孔板和60 mm培养皿，并保持其冰上低温。将骨培养基在37 °C水浴中预热。用80%（v/v）乙醇喷洒将用于处理胎鼠的工具（镊子和小剪刀）。将双目解剖显微镜转移至II级生物安全柜内。</li>
</ol>
2. 胎儿和新生小鼠胫骨和股骨的培养
<ol>
	<li>在所需妊娠阶段（E14.5 至 E18.5）通过颈椎脱位处死怀孕小鼠。若使用新生幼鼠，则逐个从母鼠身上取出，并通过断头法处死。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，并用 80%（v/v）乙醇喷洒腹部区域进行消毒。</li>
	<li>使用小剪刀剪开皮肤和腹肌，以暴露子宫角。</li>
	<li>借助镊子和小剪刀将子宫从腹腔中取出，去除子宫系膜并剪除子宫角基部。将子宫放入盛有冰上预冷的解剖液的 60 mm 培养皿中，并在整个操作过程中将培养皿保持在冰上。</li>
	<li>将含有子宫的培养皿转移至生物安全柜中，并自此在其中进行后续操作。</li>
	<li>用剪刀在胎膜之间剪开，分离各个胎儿。</li>
	<li>将单个胎膜转移至含有解剖液的洁净 60 mm 培养皿中，在解剖体视显微镜下用镊子打开胎膜，分离胎儿与胎盘，并清除膜组织。 
	注意：每次仅操作一个胚胎，其余胚胎保持在冰上。</li>
	<li>将胎儿断头，用 1 mL 剪口无菌塑料移液管将躯体转移至新的洁净 60 mm 培养皿中。</li>
	<li>用镊子从背部开始剥离胎儿或幼鼠的皮肤，一直剥至脚趾。</li>
	<li>用镊子在靠近脊柱处剪断，分离后肢，并将其转移至盛有冰上预冷解剖液的洁净培养皿中。</li>
	<li>用镊子小心插入股骨远端与胫骨近端的软骨表面之间，分离胫骨与股骨。</li>
	<li>从股骨近端去除髋骨，从胫骨去除跟骨和腓骨。</li>
	<li>通过夹取并拉除的方式，用镊子小心去除股骨和胫骨上的软组织。 
	注意：应尽可能彻底去除软组织，特别注意清除连接两个软骨极的组织，但避免损伤软骨、软骨膜和骨骼。</li>
	<li>用塑料 1 mL 无菌移液管将四根骨骼（左右胫骨和股骨）放入 24 孔板的第一个孔中。或者，若需比较不同处理对左右肢体的影响，可将对侧肢体分别放入不同孔中。 
	注意：将骨骼转移至孔板时需格外小心，因其易粘附于移液管上。</li>
	<li>根据需要，以相同方法处理尽可能多的胎儿。 
	注意：一旦解剖液变得过于浑浊，应立即更换培养皿中的解剖液，因清晰观察解剖后的骨骼至关重要。</li>
	<li>当所有目标骨骼均已转移至孔板后，用塑料 1 mL 无菌移液管吸除解剖液，并特别注意避免吸走骨骼。
	<ol>
		<li>根据实验目的，可在去除解剖液前拍摄骨骼图像，作为实验的零时间点。使用连接数字相机的显微镜拍摄图像，并标注曝光参数和比例尺。为确保测量简便可靠，应拍摄对比度良好的图像以区分矿化部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每孔加入 1 mL 培养基。若需对骨骼进行处理（如多西环素、他莫昔芬、生长因子等），应在此时加入。</li>
	<li>为观察培养条件下生长抑制效应，用视黄酸（RA，500 nM）处理左侧胫骨，同时用等体积溶剂（二甲基亚砜 [DMSO]，终浓度 0.1%）孵育右侧胫骨作为对照。</li>
	<li>将骨骼置于细胞培养箱中，在标准细胞培养条件下（37 °C，5% CO2）培养两天或更长时间。</li>
	<li>为评估细胞增殖，在固定前 1–2 小时向培养基中加入 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）或 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），终浓度为 10 µM。 
	注意：EdU 储存液浓度为 20 mM。 
	警告：EdU 和 BrdU 为胸苷类似物，具有毒性及致突变性。</li>
	<li>解冻 4% 多聚甲醛（PFA），并将骨骼分别浸入 2 mL 管中的 PFA 进行固定。 
	警告：PFA 具有毒性，被列为可能的人类致癌物。避免吸入多聚甲醛粉末及蒸气。EdU 和 BrdU 为胸苷类似物，具有毒性及致突变性。</li>
	<li>在室温下短暂固定 10 分钟后，将骨骼转移至 PBS 中用于最终时间点的图像采集，随后将骨骼重新放回 PFA 中，在 4 °C 下过夜固定。</li>
	<li>固定完成后，可对骨骼进行后续所需的实验处理。</li>
</ol>
3. 骨全长及矿化区域的测量与分析
<ol>
	<li>使用图像编辑软件测量骨骼长度，需考虑图像的比例尺。测量骨骼的总长度以及矿化区域的长度。测量时从一端第一个深色细胞开始，到另一端最后一个深色细胞结束。 
	注意：矿化区域呈现较深颜色，可轻易与软骨组织区分。</li>
	<li>为计算生长速率（定义为每天平均增加的长度），将骨骼在培养结束时的长度与初始长度之差除以培养天数即可。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

体外骨培养方法已被用于评估骨生长生物学特性一段时间28，但较少应用于小鼠长骨。随着成像技术的发展，体外骨培养提供了一种有吸引力的方法，可在接近体内环境的条件下实时研究骨生长。在此情况下，明确长骨生长与体内生长具有可比性的条件显得尤为重要。
在本研究中，我们介绍了一种简单且经济的长骨培养方案，并探讨了其局限性及可能的应用。该方法最关键的步骤是骨骼的分离，必须保持骨骼完整，并尽可能减少骨两端之间的软组织。若在骨两端之间残留软组织，将阻碍骨骼的正常生长并导致弯曲，如图1E所示。骨骼末端的软组织可以保留，因其最终会自然消失。另一个需要格外小心的步骤是将骨骼转移至培养板，因为骨骼容易粘附在塑料移液管上。一种可行的解决方法是用含有血液和组织碎片的解剖液反复吹打，形成一层包被，有助于防止骨骼粘附在移液管上。
提取后，骨骼在培养长达48小时的条件下可达到与相应体内发育阶段相当的大小。除了测量骨骼长度外，在这些条件下还可方便地估算生长速率...

器官的生长必须受到严密调控，以防止生长紊乱的发生，这一过程涉及多种细胞类型、分子通路以及身体不同部位之间的相互作用。成像技术对于研究胚胎在正常条件下以及系统受到干扰后随时间发生的动态变化至关重要。具有宫内发育特征的胚胎（例如广泛使用的啮齿类动物模型）为活体成像和药物处理带来了额外挑战，而离体培养技术可在一定程度上克服这些困难。为了成功重现体内过程并获得有意义的结果，为每种器官或组织找到合适的培养条件变得尤为关键。
哺乳动物骨骼的大多数骨骼通过软骨内成骨过程生长，其中胚胎期的软骨（由称为软骨细胞的细胞构成）驱动纵向生长，并逐渐被骨组织取代。这一过程发生在长骨末端的生长板处，生长板可分为三个区域：静止区、增殖区和肥大区1,2。首先，静止区中圆形的前体软骨细胞转变为增殖区中呈柱状排列并持续分裂的软骨细胞。在接下来的分化阶段，这些软骨细胞体积增大成为肥大软骨细胞，并开始分泌X型胶原蛋白。肥大软骨细胞协调后续的成骨过程：它们分泌关键的信号分子，如结缔组织生长因子、骨形态发生蛋白和印度刺猬因子，引导基质矿化，招募血管进入骨的中央区域，并在发生凋亡后，允许成骨细胞（成骨细胞）侵入基质，形成初级骨化中心3,4。矿化的基质有助于血管的穿透，成骨细胞借此迁移进入并以骨基质替代降解的软骨5。大多数成骨细胞从软骨周围包裹软骨的纤维层——软骨膜侵入软骨基质6。此外，一部分肥大软骨细胞能够存活并转分化为成骨细胞7,8,9。骨的最终长度取决于短暂存在的软骨所累积的生长量，而其生长速率又取决于肥大软骨细胞的数量、大小及其基质合成能力10。此外，最近研究表明，最后一个肥大阶段的持续时间与骨的最终长度相关11。因此，必须对这些细胞的增殖和分化进行严密调控，以确保骨骼大小正常。
尽管多年来在生长板的结构与发育方面已获得大量知识，但这些结论大多基于对固定组织切片的观察。组织切片能为此过程提供有价值的信息，但可能伴随技术性假象，因此并不总能可靠地用于评估不同阶段之间的形态或大小变化。此外，由于骨生长是一个动态过程，静态的二维（2D）图像对生长板中细胞运动的揭示有限，而对活体组织进行延时成像则可为软骨细胞在生长板中的行为提供重要信息。
使用离体骨培养技术有望解决上述所有局限性。尽管骨培养方案已发展了一段时间，但其应用主要局限于小鼠的长骨。大多数研究采用鸡胚骨骼，因为鸡模型在技术上具有优势12,13。已有研究将器官型培养（气液界面法）应用于鸡胚股骨，并在体外维持培养达10天14。小鼠模型拥有先进的遗传操作工具，使其在离体骨培养中极具吸引力。使用小鼠研究骨生长的相关工作大多集中于跖骨15，可能因其体积小且每枚胚胎可获取的数量较多16。然而，尽管跖骨传统上被视为长骨，但在体内其较其他长骨更早进入衰老状态（特征为细胞增殖减少及生长板退化17），因此其在离体条件下的持续生长并不能真实再现体内的自然过程。在本文中，我们将“长骨”定义为来自肢体近端和中段区域的骨骼。此前多项研究曾使用小鼠长骨（如胫骨）进行离体培养，观察到软骨显著生长，但骨化程度较低18。我们近期也主要利用胫骨培养来研究软骨细胞动态19。另有研究采用幼鼠的股骨头20，或仅取股骨远端部分进行培养21。一些较新的研究成功将完整骨骼的离体培养与延时成像技术结合，获得了活体小鼠组织中软骨细胞的三维（3D）动态影像22,23。研究人员得以观察到此前未被发现的软骨细胞向增殖区重排的过程23，充分展示了离体骨培养的潜在应用价值。相比之下，分析静态图像的方法则需依赖间接且复杂的技术。最近一项研究即为此例证，该研究评估了横向排列克隆在软骨生长中的作用，采用了多色报告基因小鼠品系进行遗传谱系追踪，并结合数学建模分析24。因此，离体骨培养可能为研究动态生物学过程提供更快速、更直接的途径。
本文介绍了一种小鼠长骨培养的方法，该方法可与不同的分子处理和/或活细胞延时成像技术相结合。本方案借鉴了以往研究报告中使用的方法15,18,25，但解决了一些额外的技术问题，并专注于胫骨等长骨，而非跖骨。最后，本方法探讨了通过将左侧和右侧长骨分别在不同物质存在下进行培养，从而实现具有较强统计效力的配对比较的可能性。

<table><tbody><tr><td>5-乙炔基-2'-脱氧尿苷</td><td>Santa Cruz</td><td>CAS 61135-33-9</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-2&amp;prime;-脱氧尿苷</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 组织培养处理中心井培养皿，20 个/包，500 个/箱，无菌</td><td>Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS4</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>显微镜主机单元</td><td>Zeiss</td><td>435425-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>β-甘油磷酸钠</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>双目显微镜</td><td>Zeiss</td><td>STEMI-2000</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）第五组分</td><td>Roche/Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DigiRetina 500 相机</td><td>Aunet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖工具包</td><td>Cumper Robbins</td><td>PFS00034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 2 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>96% 乙醇</td><td>Merk</td><td>159010</td><td></td></tr><tr><td>杜蒙特 #5 镊子 Inox08</td><td>精细科学工具</td><td>T05811</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Fisher</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>伊格尔最低必需培养基</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>24 孔多孔板</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液器，1 mL，无菌，单独包装</td><td>Thermo</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>0.2 µm 注射器滤器</td><td>Life Sciences</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 20 mL 注射器</td><td>Terumo</td><td>DVR-5174</td><td></td></tr><tr><td>维甲酸（全反式维甲酸）</td><td>Sigma</td><td>PHR1187-3X</td><td></td></tr><tr><td>三目显微镜</td><td>Aunet</td><td>AZS400T</td><td></td></tr></tbody></table>

培养与测量胎鼠及新生小鼠长骨

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

长骨是复杂且动态的结构，通过软骨内成骨经由软骨中间阶段发育而来。由于难以获取健康的人类骨骼，使用哺乳动物模型（如小鼠和大鼠）来研究骨骼生长和稳态的各个方面显得尤为重要。此外，小鼠中日益成熟的遗传工具的发展使得对长骨生长进行更复杂的研究成为可能，同时也要求扩展用于研究骨骼生长的技术手段。本文介绍了一种详细的离体小鼠骨骼培养方案，可在严格控制的条件下研究骨和软骨，同时重现体内过程的大部分特征。该方法适用于多种骨骼的培养，包括胫骨、股骨和跖骨，但本文主要聚焦于胫骨的培养。此外，该方法还可与其他技术联合使用，例如延时活体成像或药物处理。

骨培养可从不同发育阶段开始。在图1A-D中，展示了相同发育阶段下培养后的胫骨与新鲜提取胫骨的比较。首先观察到的是，在培养不超过两天的情况下，无论软骨还是矿化骨，其生长尺寸均与体内骨生长相当（图1A、B、D）。随着培养时间延长，培养骨与新鲜提取骨之间的差异逐渐增大（图1C）。此外，如实验方案中所述，彻底清除连接骨两端的软组织至关重要，否则骨骼会发生弯曲。图1E展示了一例因软组织未完全清除而导致生长异常的胫骨，与另一例完全去除软组织的胫骨的对比情况。
接下来，将胫骨培养2天并测量其长度。如图2A...

本文介绍一种适用于胎儿期和新生儿期小鼠长骨的离体培养方法，可在模拟体内过程的受控条件下，用于分析骨骼和软骨的发育及稳态。

长骨是复杂的动态结构，通过软骨内成骨经由软骨中间阶段发育而来。对健康...的获取受限

该方法将跖骨培养方案改进用于较大的骨骼，使得直接的骨骼操作能够与复杂的遗传模型相结合，以研究与骨骼发育相关的过程。此技术可实现对骨骼生长的操控和分析，而这些操作在体内无法完成，例如活体成像或直接的物理与药理学干预。这种离体培养方法能够特异性地研究基因插入对骨骼的局部效应，从而将其与治疗对机体产生的全身性效应区分开来。首先用 80% 乙醇对妊娠 14.5 至 18.5 天的小鼠腹部区域进行消毒，然后使用小剪刀切开皮肤和腹肌以暴露子宫角。为将子宫从腹腔中取出，需去除子宫系膜并剪断子宫角的基部。随后，将子宫转移至含有冰上预冷的解剖液的 60 毫米培养皿中。在生物安全柜中，用剪刀剪开胎囊之间的连接，分离出单个胎鼠，然后将单个胎囊转移至含有新鲜解剖液的新60毫米培养皿中，在解剖体视显微镜下操作。使用镊子将胎鼠与胎盘分离，并清除胎鼠周围的膜组织。用剪切过的塑料移液管将胎鼠躯体转移至另一个新的60毫米培养皿中，在进一步解剖前将胚胎断头。然后用镊子从背部开始去除皮肤，并向外剥离至脚趾。用镊子沿靠近脊柱的位置剪开，将后肢与身体分离。将后肢转移至一个盛有冰冻解剖液的洁净培养皿中，并将镊子插入股骨远端的表面软骨与胫骨近端之间，以分离胫骨与股骨。去除股骨近端的髋骨，以及胫骨的跟骨和腓骨。仔细剪除并拉除股骨和胫骨上的软组织，使用无菌的1毫升移液器将四根腿骨全部转移至含有新鲜解剖培养基的24孔板的第一个孔中。重要的是要确保去除连接骨脉的软组织。否则，骨骼会发生弯曲，无法实现正常生长。从适当数量的胎鼠中分离出骨骼后，在明场显微镜下以良好对比度对每个孔中的骨骼在0时间点进行成像，并将每孔中的解剖液更换为1毫升培养基，注意避免吸走骨骼。为观察培养条件下生长抑制的效果，用500纳摩尔的视黄酸处理左侧胫骨，右侧胫骨则加入等体积的溶剂作为对照，进行孵育。随后，将培养板置于细胞培养箱中，在标准细胞培养条件下孵育。两天后，加入适当的胸腺嘧啶类似物处理骨组织1至2小时，以评估骨细胞的增殖情况，然后将骨组织转移至含有2毫升4%多聚甲醛的离心管中，固定10分钟。接着，将骨组织转移至磷酸盐缓冲液（PBS）中，于最终时间点进行成像观察，之后再将样品重新放回多聚甲醛中，在4°C条件下过夜固定。为了测量骨骼的长度和矿化区域，打开合适的成像软件程序，根据图像的比例尺，测量骨骼的总长度以及矿化区域的长度。测量时从一端第一个深色细胞开始，至另一端最后一个深色细胞结束。为了计算生长速率（定义为每天平均长度增加量），将骨骼最终长度与初始长度之差除以培养的天数即可。此处展示了培养的胫骨与相同发育阶段新鲜提取的胫骨之间的比较。培养最多两天后，软骨和矿化骨的大小均与体内骨生长情况相当。更长时间的培养会导致培养骨与新鲜提取骨之间出现更大的差异。需要注意的是，若软组织未完全去除即进行培养，可能导致胫骨弯曲。使用视黄酸处理对胫骨生长具有

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

胎儿和新生儿小鼠长骨的培养与测量

本方案描述了一种无需处死小鼠即可进行股骨骨髓（BM）连续取样的操作流程。该方法可支持对小鼠骨髓组成进行长期的纵向研究，并能够连续获取骨髓内的细胞，用于离体（ex...

活体小鼠股骨骨髓穿刺

本文介绍了一种从小鼠后肢长骨（股骨和胫骨）中进行解剖的实验方案。此外，我们还描述了一种快速分离这些骨骼中骨髓的技术，该技术利用离心法将骨髓从骨髓腔中分离出来。...

小鼠后肢长骨解剖与骨髓分离

我们介绍一种分离和培养小鼠胚胎第15天（E15）跖骨的实验方案。该方法具有高度的生理相关性 离体 软骨内成骨模型提供了更接近的条件 体内 比单层或三维培养中的细胞更接近真实生理环境，是研究骨骼生长与发育的关键工具。...

小鼠胚胎跖骨培养：一种生理性软骨内成骨模型

本文描述了一种分离和培养破骨细胞的实验方案 体外...

基于RANKL的小鼠骨髓破骨细胞培养实验，用于研究mTORC1在破骨细胞形成中的作用

本文介绍了从小鼠长骨中分离和分化骨髓基质细胞及造血干细胞的方法。提供了两种不同的实验方案，可获得适用于扩增并分化为成骨细胞、脂肪细胞和破骨细胞的不同细胞群体。...

小鼠骨髓基质细胞与破骨细胞前体的分离、培养及分化

利用颅骨共培养与组织形态计量学测量骨重塑并重建肿瘤-骨微环境

本方案描述了一种用于小鼠股骨颈在悬臂弯曲装置中进行可重复测试的实验平台的建立方法。采用定制的3D打印导板，以实现股骨在最佳对齐状态下的稳定且一致的固定。...

小鼠股骨颈悬臂弯曲测试

本方案描述了一种非酶解且简便的方法，用于分离7至9日龄新生小鼠的骨髓细胞，并利用L929细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，诱导生成分化的巨噬细胞。进一步对骨髓来源的巨噬细胞进行了表面抗原F4/80、CD206、CD11b以及功能活性的分析。...

新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

本方案描述了一种改进的小鼠青春期骨生长板损伤模型。利用携带I型、II型和X型胶原三系谱荧光报告基因的转基因小鼠，这些胶原分别对应生长板三种不同基质层的主要细胞外基质成分，通过显微镜下观察内源性荧光来引导损伤位置的定位。...

三色转基因小鼠模型用于生长板损伤研究

小鼠骨髓损伤模型是研究出生后通过膜内成骨进行骨形成的有效工具。该简化的手术方案描述了骨髓消融操作，可用于后续评估损伤后新骨形成及细胞反应。...

通过小鼠骨髓损伤模型研究出生后膜内成骨的改进方法

学习胎儿和新生儿小鼠长骨离体培养与测量技术，用于研究骨骼发育和软骨稳态。该方法支持活体成像和药物处理，可分离局部遗传效应与全身影响，为骨生物学研究提供精确可控的实验平台。

培养与测量胎鼠及新生小鼠长骨

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