Name: 细胞培养和果蝇黑色素的氧化锌纳米颗粒的毒性研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习使用流式细胞术和高内涵成像技术评估氧化锌纳米颗粒对人肺成纤维细胞和果蝇的毒性。该方法可检测细胞死亡类型并定量活性氧水平，为纳米毒理学研究提供可靠方案。

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本研究由资助号 R706-000-043-490 支持。本研究不代表资助方的观点。

1. 活细胞/固定细胞的荧光激活细胞分选（FACS）分析
<ol>
	<li>将悬浮液中的氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）超声处理15分钟。</li>
	<li>使用1 mg/mL的氧化锌纳米颗粒（ZnO NP）储备液，配制不同浓度的氧化锌纳米颗粒溶液（例如，0、10、25、50、100和200 µg/mL），用于处理培养的细胞。</li>
	<li>提前一天将MRC5人肺成纤维细胞（1 × 105 个细胞/孔）接种于6孔培养板中，随后分别用2 mL氧化锌纳米颗粒溶液（设三个重复）处理细胞，处理时间分别为8 h、16 h和24 h。</li>
	<li>在每个时间点，以300 × g 离心5分钟收集细胞。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞沉淀洗涤两次。</li>
	<li>用1×结合缓冲液重悬细胞，该缓冲液包含0.1 M HEPES/氢氧化钠（NaOH）、1.4 M氯化钠（NaCl）和25 mM氯化钙（CaCl2），细胞浓度为每100 µL含1 × 105 个细胞。</li>
	<li>加入5 µL异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Annexin V染料和5 µL碘化丙啶（PI）DNA染料，在室温（RT；25 °C）避光孵育15分钟。</li>
	<li>在进行流式细胞术分选前，向样品中额外加入400 µL的1×结合缓冲液。每个样品至少分析10,000个细胞。</li>
	<li>根据获得的中位荧光强度绘制柱状图。</li>
</ol>
2. ZnO 纳米颗粒对Drosophila的暴露处理
<ol>
	<li>将不同浓度的纳米颗粒各1 mL加入小瓶中，随后加入9 mL果蝇食物，配制成终浓度为0.1 mg/mL、0.25 mg/mL或0.5 mg/mL的ZnO NPs果蝇食物。</li>
	<li>使用移液器在小瓶中将纳米颗粒与食物充分混匀。</li>
	<li>让含有ZnO NPs的果蝇食物冷却至少2–3小时后再使用。</li>
	<li>将成年雄性和雌性果蝇放入小瓶中培养5天，使其交配并在食物表面产卵（卵表现为白色斑点）。</li>
	<li>移除亲代果蝇，使卵继续发育，发育过程包括4个不同的发育阶段（胚胎期、幼虫期、蛹期和成虫期）。</li>
</ol>
3. 果蝇解剖
<ol>
	<li>收集晚期 3rd 从瓶壁上取下龄期幼虫用于分析。新产的卵通常会发育至3龄晚期rd 室温下72-120小时后的龄期幼虫。</li>
	<li>清洗解剖皿，并向其中加入解剖液/PBS。</li>
	<li>解剖幼虫（晚期3rd 使用镊子在体视显微镜下进行龄期鉴定。</li>
	<li>用镊子尖端刺破幼虫的角质层，形成微小孔洞并将其打开。小心取出肠道，放入含有 Schneider 培养基的 1.5 mL 微量离心管中 果蝇 4%多聚甲醛（PF）固定步骤之前，使用1 mL培养基。</li>
	<li>3.5 在室温下用PF固定肠道10分钟，用于后续实验（如免疫染色）。</li>
</ol>
4. 使用二氢乙啶（DHE）染色法检测活性氧
<ol>
	<li>按照步骤2.1所述，用不同浓度的ZnO NPs处理幼虫。</li>
	<li>按照第3节所述方法解剖3rd龄幼虫的肠道，将肠道置于Schneider's Drosophila培养基中，在室温下孵育，再进行组织染色。将1 µL DHE染料（来自30 mM储备液）溶解于1 mL Schneider's培养基中，配制成终浓度为10–30 µM的DHE工作液。</li>
	<li>在室温避光条件下孵育肠道5分钟，然后用Schneider's培养基洗涤三次，每次5分钟。</li>
	<li>用4%多聚甲醛（PF）固定肠道（可选步骤），并将肠道置于载玻片上，使用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂封片。在共聚焦显微镜下采集图像。</li>
</ol>
5. 使用 ImageJ 软件测量荧光
<ol>
	<li>将使用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜获取的荧光图像导入 ImageJ 软件中。</li>
	<li>点击 分析 菜单，然后选择 设置测量。</li>
	<li>选择输出测量参数，如面积积分光密度和平均灰度值。</li>
	<li>点击 测量。</li>
	<li>选择无荧光区域以设定背景。</li>
	<li>将数据导出至 Excel 电子表格，并根据以下计算公式确定校正后的细胞总荧光强度（CTCF）： 
	CTCF = 积分密度 - （所选细胞面积 × 背景荧光读数的平均值）</li>
	<li>绘制柱状图并进行统计分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

为了评估氧化锌纳米颗粒（ZnO NP）是否可诱导MRC5成纤维细胞发生凋亡，我们采用流式细胞术来区分细胞的坏死性死亡与凋亡性死亡。在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）定位于细胞膜内侧。当细胞发生凋亡时，PS会转位至质膜的胞外小叶，从而允许与荧光素标记的Annexin V（FITC Annexin V）29结合。另一方面，红色荧光的碘化丙啶（PI）是一种核酸结合染料，不能穿透活细胞和凋亡细胞，但可对死亡细胞进行染色30。因此，我们可利用流式细胞仪，通过氩离子激光的488 nm谱线激发，识别出死亡细胞（红色和绿色荧光）、凋亡细胞（绿色荧光）以及活细胞（无或仅有微弱荧光）。
对于黑腹果蝇（Drosophila）肠道的DHE染色，建议在实验开始前用DMSO重新配制染料，因为长期储存可能导致染料发生自氧化，使其颜色变为深色或紫红色31,32。此外，配制好的染料储备...

纳米技术是指将纳米级材料应用于所有科学领域，包括医学、材料科学和生物化学。例如，氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）因其具有紫外线散射、化学传感和抗菌特性以及高电导率，被广泛用于多种消费品的生产，如食品包装、化妆品、纺织品、橡胶、电池、汽车尾气处理催化剂以及与生物医学相关的应用1,2,3。
然而，基于氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的产品应用日益广泛，导致人类接触ZnO NPs的程度增加，这引发了对其可能对人类健康产生不良影响的担忧。大量体外细胞研究表明，ZnO NPs可诱导氧化应激、自噬相关细胞毒性、炎症反应以及基因毒性4,5,6,7,8。值得注意的是，ZnO NPs的毒性被认为主要源于Zn溶解为游离的Zn2+离子，以及ZnO表面的反应活性，从而导致细胞内离子和代谢失衡，进而引发离子稳态受损和离子转运受抑制4,7,9,10。重要的是，研究显示活性氧（ROS）的生成是ZnO NPs相关毒性的主要机制之一。ROS攻击后抗氧化活性不足已被证实可引发细胞毒性和DNA损伤9。ZnO NPs的毒性效应也在动物模型中被报道，包括啮齿类动物1、斑马鱼11,12，以及无脊椎动物Drosophila13。
Drosophila 是一种成熟的替代性动物模型，可用于化学物质和纳米材料（NMs）的毒性筛选14,15。重要的是，人类与Drosophila之间存在高度的遗传和生理相似性，这为将Drosophila用作评估环境污染物（如纳米材料）生物学反应的体内模型提供了依据16。此外，Drosophila具有个体小、生命周期短、遗传操作便利以及易于且低成本维护等诸多优势。自2000年Drosophila全基因组测序完成以来，它已被广泛应用于遗传学、分子生物学和发育生物学的研究，因此适用于多种高通量筛选以及解决尚未明确的生物学问题17,18,19,20,21。近年来，已有大量关于利用不同类型纳米颗粒（NPs）在Drosophila中开展免疫毒性研究的报道15,22,23,24。这些基于Drosophila模型获得的基础性新知识，有助于加深我们对纳米毒理学的理解。
活性氧（ROS）是纳米颗粒（NPs）引起细胞毒性和基因毒性的已知主要原因，尤其是金属基纳米颗粒25。ROS 是指含氧且比分子氧更具反应活性的化学物质。自由基如超氧阴离子自由基（O2-）以及非自由基分子如过氧化氢（H2O2）均可作为 ROS 发挥作用。在正常生理条件下，ROS 对维持细胞稳态是必需的26；然而，当 ROS 因过度生成或抗氧化防御系统失调而过量积累时，可引发氧化应激，导致蛋白质、脂质和脱氧核糖核酸（DNA）受损27。例如，随着 ROS 水平升高，谷胱甘肽（GSH）水平同时下降，三磷酸腺苷（ATP）合成受阻，培养基中乳酸脱氢酶（LDH）水平上升，最终导致细胞死亡27。
本文提供了利用培养的哺乳动物细胞和果蝇（Drosophila）进行细胞和遗传学分析的实验方案，以评估氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）可能产生的不良效应。氧化锌纳米颗粒毒性研究方法的总体流程如图1所示。

<table><tbody><tr><td>15% 对羟基苯甲酸甲酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;cncCK6/TM3, Sb&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>由 Dr. Kerppola T 惠赠</td></tr><tr><td>玉米粉、葡萄糖、酿酒酵母</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyAn ADP 流式细胞仪（配备 Summit 软件）</td><td>DAKO</td><td></td><td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td></tr><tr><td>二氢乙啶（氢化乙啶）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒 I</td><td>BD biosciences</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucolin</td><td>超市</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC5 人肺成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>野生型 &lt;em&gt;Canton-S; Sod2N308/CyO&lt;/em&gt;</td><td>NIG-FLY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧化锌纳米颗粒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>721077</td><td>参见表 2</td></tr></tbody></table>

氧化锌纳米颗粒在细胞培养及体内的毒性研究 黑腹果蝇

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）具有广泛的应用，但近年来关于ZnO NPs相关毒性的报道数量迅速增加。然而，阐明ZnO NPs诱导毒性的潜在机制的研究仍十分有限。我们利用体外和体内实验模型确定了ZnO NPs的毒性特征。在暴露于ZnO NPs的人胚肺成纤维细胞MRC5中观察到细胞活力显著下降，表明ZnO NPs具有细胞毒性作用。同样，有趣的是，在果蝇Drosophila中，肠道暴露于ZnO NPs后活性氧（ROS）水平显著升高。针对消费者日益增加的ZnO NPs使用情况，尚需更深入的研究以建立相应的风险评估体系。

经纳米颗粒暴露的细胞使用细胞染色试剂盒进行处理，随后通过流式细胞术进行细胞分选。ZnO 纳米颗粒处理的细胞（下方右图）中早期（R3）和晚期凋亡细胞（R6）的比例高于对照细胞（R5，下方左图）。坏死性细胞死亡由 R4 区域表示（上方右图）（图 2）。ZnO 纳米颗粒处理的 MRC-5 成纤维细胞的 FITC/Annexin V 检测结果如 图 2 所示。
在 Drosophila 实验中，将经超声处理的不同浓度的ZnO纳米颗粒加入10 mL试管的果蝇食物中，并使用移液器控制器充分混匀（图3）。从培养瓶中收集晚期三龄幼虫，在体视显微镜下进行解剖。首先将幼虫清洗以去除残留的食物（图4）。撕开外层角质层以暴...

我们描述了一种详细的实验方案，用于评估氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的毒理学特征，特别是其对人MRC5肺成纤维细胞死亡类型的影响以及在果蝇Drosophila中活性氧（ROS）的形成情况。

氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）具有广泛的应用，但近年来关于ZnO NPs相关毒性的研究报告数量迅速增加。

我们的方法概述了一种简单且可重复的纳米毒性研究方式，例如检测细胞死亡类型以及检测活性氧的产生。荧光激活细胞分选是一种严谨的技术，可使我们研究细胞亚群及不同类型细胞死亡的动态变化。DHE探针检测方法使我们能够通过流式细胞术、高内涵显微成像以及基于微孔板的荧光分析，对活性氧进行检测与定量。首先，将装有氧化锌纳米颗粒的离心管放入氧化锌纳米颗粒储备液中，并置于超声仪中处理15分钟。使用1毫克/毫升的氧化锌纳米颗粒储备液配制不同浓度的氧化锌纳米颗粒。然后，在生物安全柜中，将MRC5人肺成纤维细胞以每孔1×10⁵个细胞的浓度接种至三个六孔细胞培养板中。将细胞在37摄氏度下孵育。一天后，用两毫升氧化锌纳米颗粒处理细胞，处理时间分别为8小时、16小时或24小时。在每个时间点，将细胞收集至15毫升离心管中，在300 × g下离心5分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀两次，然后用1×结合缓冲液重悬细胞。接着，加入5 µL FITC Annexin V染色剂和5 µL碘化丙啶DNA染色剂。将染色后的细胞在室温下避光孵育15分钟。在通过流式细胞术分选细胞之前，向样品中额外加入 400 微升 1× 结合缓冲液。使用获得的中位强度数据绘制柱状图。现在使用移液器将不同浓度的纳米颗粒各一毫升加入小瓶中，随后加入九毫升果蝇食物，配制成终浓度为 0.1 毫克/毫升、0.25 毫克/毫升或 0.5 毫克/毫升的氧化锌纳米颗粒。用移液器反复吹打以充分混匀。将含有氧化锌纳米颗粒的果蝇食物放置至少两到三小时，待其冷却后再使用。随后用二氧化碳麻醉成年雄性和雌性果蝇，每管接入5只雄蝇和5只雌蝇，持续培养五天。让果蝇在食物表面交配并产卵。麻醉后，移除亲代果蝇，将卵置于室温下继续发育，该过程包括四个不同的发育阶段：胚胎期、幼虫期、蛹期和成虫期。72 至 120 小时后，新产的卵发育为三龄晚期幼虫。使用镊子从培养瓶壁上收集幼虫用于分析。在含有解剖液或磷酸盐缓冲液（PBS）的解剖皿孔中，将幼虫放入溶液内。在体视显微镜下，用镊子尖端刺出一个小孔，打开幼虫的表皮层。小心取出肠道，并将肠道放入含有 Schneider 果蝇培养基的 1.5 毫升微量离心管中。加入1 µL DHE探针，在室温避光条件下孵育10分钟。每5分钟使用Schneider培养基洗涤肠道3次。将肠道组织置于载玻片上，并加入10 µL含DAPI的抗荧光淬灭封片剂。在共聚焦显微镜下采集图像。为测量荧光，将使用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜获得的荧光图像导入 ImageJ 软件中。点击分析菜单，选择“设置测量”。选择输出测量值，例如面积积分强度和平均灰度值。选择一个无荧光的区域以设定背景。点击“测量”。将数据导出至电子表格，计算校正后的总细胞荧光强度。绘制柱状图并进行统计分析。本研究中，经氧化锌纳米颗粒处理的细胞比对照组细胞表现出更高比例的早期凋亡R3或晚期

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

细胞培养和果蝇黑色素的氧化锌纳米颗粒的毒性研究

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小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

学习使用流式细胞术和高内涵成像技术评估氧化锌纳米颗粒对人肺成纤维细胞和果蝇的毒性。该方法可检测细胞死亡类型并定量活性氧水平，为纳米毒理学研究提供可靠方案。

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