Name: 使用线性加速器进行体外放射生物学实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 了解如何使用线性加速器评估辐射对癌细胞的生物学效应，包括肿瘤球体和贴壁细胞培养实验。该方法适用于各类癌细胞，可研究临床相关剂量和剂量率。

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感谢克利夫兰诊所放射肿瘤科提供直线加速器的使用。感谢Jeremy Rich博士慷慨赠送胶质瘤干细胞样细胞。本研究由克利夫兰诊所资助。

1. 悬浮细胞培养的细胞准备
<ol>
	<li>在细胞培养箱中，于含5% CO2、95%相对湿度、37 °C条件下，将胶质瘤干细胞样细胞以约5 × 106 个细胞/10 cm培养皿接种于干细胞培养基中进行培养。 
	注：所有实验步骤中细胞培养条件保持一致。本方案所用培养基均为完全培养基。</li>
	<li>在预定照射前两天，于生物安全柜中使用无菌5 mL移液管将胶质瘤干细胞样细胞从培养皿中收集至15 mL离心管中。</li>
	<li>将收集的细胞在台式离心机中以200 × g 离心3分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在室温下消化细胞沉淀（约1 × 107 个细胞）5分钟，以获得单细胞悬液。消化过程中每2分钟轻轻摇动离心管底部一次，确保细胞充分消化。</li>
	<li>加入3 mL干细胞培养基（见材料表）以终止胰蛋白酶消化反应。将细胞在台式离心机中以200 × g 离心3分钟。弃去上清液，保留细胞沉淀。</li>
	<li>用5 mL细胞培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将5 × 106 个细胞接种至两个含有10 mL细胞培养基的10 cm培养皿中。</li>
	<li>在预定照射前立即按照步骤1.3所述方法收集细胞，离心后弃去上清液，用5 mL细胞培养基重悬细胞沉淀。取1 mL细胞悬液转移至含有2 mL细胞培养基的35 mm培养皿中。 
	注：35 mm培养皿中培养基总体积为3 mL，以确保液体高度为1 cm。</li>
	<li>将接种好的细胞置于次级容器（如塑料盒或泡沫箱）中，以降低污染风险，并将装有细胞的容器放置于运输推车上送至辐照设施。</li>
	<li>按照步骤4所述方法对细胞进行辐照处理。</li>
</ol>
2. 贴壁细胞培养的细胞准备
<ol>
	<li>照射前一天，在细胞培养罩内，从贴壁细胞系（如 HEK-293 细胞）的细胞培养板中移除 DMEM 培养基。可使用连接真空泵的巴斯德移液管吸取培养基。</li>
	<li>向培养皿中加入 5 mL 无菌 PBS 洗涤细胞，以去除残留的培养基。</li>
	<li>用移液管向培养皿中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并轻轻倾斜培养板，确保整个皿底均被胰蛋白酶-EDTA 覆盖。</li>
	<li>室温下消化细胞 5 分钟，加入 3 mL DMEM 培养基终止胰蛋白酶-EDTA 反应，并在细胞培养罩内用 5 mL 移液管将细胞收集至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>在台式离心机中以 200 × g 离心 3 分钟，弃去上清液，保留细胞沉淀。</li>
	<li>用 5 mL DMEM 培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>在 35 mm 培养皿中加入 3 mL 细胞培养基，接种 2 × 105 个细胞，使培养基高度达到 1 cm。</li>
	<li>将细胞在 37 °C 培养箱中培养 24 小时后，将培养皿转移至次级容器（例如隔热泡沫箱）中，通过运输车送至辐照设施。</li>
	<li>按照步骤 4 所述条件对细胞进行辐照。</li>
</ol>
3. 照射后免疫染色的细胞准备
<ol>
	<li>将市售细胞外蛋白基质在冰上于 4 °C 过夜解冻。将 200 µL 吸头和 1.5 mL 离心管于 4 °C 预冷过夜。</li>
	<li>使用预冷的吸头和 1.5 mL 离心管，将细胞外蛋白基质以每管 200 µL 分装。</li>
	<li>将 200 µL 细胞外蛋白基质加入预冷的 20 mL 细胞培养基中，配制成含 1% 细胞外蛋白基质的培养基。</li>
	<li>将一片灭菌盖玻片（22 mm × 22 mm）放入 35 mm 培养皿中，并在盖玻片上加入 400 µL 的 1% 细胞外蛋白基质培养基。</li>
	<li>将 35 mm 培养皿置于 37 °C 细胞培养箱中孵育 1 小时，使细胞外蛋白基质在盖玻片表面聚合。</li>
	<li>当使用悬浮细胞培养时，按照步骤 1.1 至 1.5 所述方法制备单细胞悬液。</li>
	<li>将 5 × 104 个细胞接种至放置于 35 mm 培养皿中的细胞外蛋白基质包被的盖玻片上。将接种后的细胞放回细胞培养箱中过夜，以确保细胞被蛋白基质充分支持。培养皿中培养基的总体积应为 3 mL，使培养基液面高度达到 1 cm。</li>
	<li>在 10 倍物镜下使用明场显微镜观察细胞。细胞应贴附并铺展在盖玻片上，而非漂浮。将接种细胞的培养皿放入次级容器（如泡沫箱）中，通过运输车转移至辐照设施，并按照步骤 4 所述进行辐照。</li>
	<li>当使用贴壁细胞培养（例如 HEK-293 细胞）时，按照步骤 2.1 至 2.6 所述消化细胞。在辐照前一天，将 5 × 104 个细胞接种于 35 mm 培养皿中的无菌盖玻片上，确保细胞已完全贴附于盖玻片表面，可通过显微镜观察确认（如步骤 3.9 所述）。使用 3 mL DMEM 培养基，使液体高度达到 1 cm。</li>
	<li>细胞在盖玻片上培养过夜或最长一天后，将接种细胞的培养皿置于次级容器中转移至辐照设施。可使用运输车以降低洒漏风险。按照步骤 4 所述对细胞进行辐照。</li>
</ol>
4. 使用直线加速器（LINAC）进行照射
<ol>
	<li>使用直线加速器（LINAC）控制台软件，将加速器机架和准直器设置为 0°，将 X 和 Y 准直器叶片打开至对称的 20 x 20 cm2 射野大小，并在存在多叶准直器（MLC）时将其收回。 
	注：某些直线加速器具有无展平滤过器（FFF）模式，可实现非常高的剂量率。顾名思义，这种辐射束并非均匀（平坦），高剂量率仅在射束中心区域实现。在此情况下，使用 7 x 7 cm2 的射野。</li>
	<li>在治疗床上放置至少 5 cm 厚的等效水材料。将待照射的细胞培养皿置于等效水材料上，设定剂量率为 400 MU/min（标准剂量率），并使其中心对准直线加速器的十字交叉点。</li>
	<li>将待照射细胞置于 6 MV X 射线束的最大剂量深度处，约为 1.5 cm。在培养皿上方再覆盖 1 cm 厚的等效水材料。结合细胞悬浮所处的 1 cm 培养基厚度，可使细胞平均处于 1.5 cm 的深度。</li>
	<li>将前指针安装至直线加速器头部。伸出前指针直至其接触建成区材料表面，并记录该距离。调节治疗床高度，使放射源至建成区表面的距离为 100 cm。 
	注：可使用光距指示器确认该距离。或者，也可直接使用光距指示器代替前指针，将源至建成区表面的距离设为 100 cm。</li>
	<li>计算为细胞提供所需辐射剂量所需的适当监测单元（MU）数，并将加速器程序设定为以 400 MU/min 的速率出束。 
	注：对于校准为在最大剂量深度处输出 1 cGy/MU 的直线加速器，在源皮距（SSD）布野条件下，所需监测单元数的计算公式为 MU = 剂量(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20)，其中 OF 表示输出因子。若直线加速器采用其他校准设置，则需相应调整此计算方法。</li>
	<li>离开治疗室，并确认所有其他人员均已撤离。确认室内无其他细胞样本，否则它们将受到低剂量辐射照射。关闭治疗室门。</li>
	<li>在控制台确认射野大小、MU 及 MU/min 参数，然后启动射束。</li>
	<li>对需要在更高或更低剂量率下照射的细胞，重复步骤 4.3–4.8。
	<ol>
		<li>为使用加速器实现更高剂量率（例如 2100 MU/min 或更高），需减小源皮距（SSD），以根据平方反比定律提高对细胞的有效剂量率：有效剂量率 = 剂量率 × (100 cm / SSD_新)2。</li>
		<li>对于低剂量率（例如 20 MU/min），应增加源至表面距离（SSD_新）以降低剂量率。例如，可将细胞培养皿放置于治疗室地面。</li>
		<li>若采用此设置，需重新计算加速器上的监测单元（MU）设定值，公式为 MU = 剂量(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20) / (100 cm / SSD_新)2。有关 MU 计算的更多资料，请参见 McDermott 和 Orton18 的参考文献。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过公式 DoseRate(Gy/Min) = Dose(Gy) × (MU/min) / MU 计算剂量率（Gy/分钟）。例如，以 400 MU/min 递送 4 Gy 剂量需要 380 MU，则剂量率为 4 × 400 / 380 = 4.2 Gy/min。详见 表 1。</li>
</ol>
<img alt="使用直线加速器进行放射治疗的设置、剂量测量设备、精确定位网格。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59514/59514fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：细胞培养皿在直线加速器上的设置。（A）显示一台临床用直线加速器。（B）在治疗床面上放置5 cm的等效水材料。（C）将细胞培养皿置于该材料表面。（D）利用加速器的十字准直线，将培养皿置于由方形光野所示治疗区域的中心位置。（E）在细胞培养皿上方再覆盖1 cm的等效水材料。使用光学距离指示器（F, G）或前指针（H, I）检查源皮距（SSD）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59514/59514fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 辐照后的生物学检测
<ol>
	<li>照射后，以与上述相同的方式将细胞放回细胞培养孵育箱中（参见步骤 1.9、2.8 和 3.10）。</li>
	<li>根据需要，可调整多种生物学检测方法以适应研究项目。 
	注意：此处以细胞周期分析16为例，展示照射后可采用的一种典型生物学检测方法。</li>
</ol>

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+radiotherapy+with+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+versus+radiotherapy+alone+on+survival+in+glioblastoma+in+a+randomised+phase+III+study%3A+5-year+analysis+of+the+EORTC-NCIC+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial.</a> The Lancet Oncology. 10 (5), 459-466 (2009).</li>
<li>Tao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+imaging+in+upper+gastrointestinal+tumors+and+application+to+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+Oncology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia imaging in upper gastrointestinal tumors and application to radiation therapy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1044-1053 (2018).</li>
<li>Gajiwala, S., Torgeson, A., Garrido-Laguna, I., Kinsey, C., Lloyd, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+immunotherapy+and+radiation+therapy+strategies+for+pancreatic+cancer-targeting+multiple+steps+in+the+cancer+immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+Oncology%22%5BJournal%5D)">Combination immunotherapy and radiation therapy strategies for pancreatic cancer-targeting multiple steps in the cancer immunity cycle.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1014-1026 (2018).</li>
<li>Liney, G. P., Whelan, B., Oborn, B., Barton, M., Keall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-Linear+accelerator+raiotherapy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Oncology+Journal+%7C+The+Royal+College+of+Radiologists%22%5BJournal%5D)">MRI-Linear accelerator raiotherapy systems.</a> Clinical Oncology Journal | The Royal College of Radiologists. 30 (11), 686-691 (2018).</li>
<li>Hall, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+dose-rate%3A+a+factor+of+importance+in+radiobiology+and+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Radiation dose-rate: a factor of importance in radiobiology and radiotherapy.</a> The British Journal of Radiology. 45 (530), 81-97 (1972).</li>
<li>Steel, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dose-rate+effect+in+human+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">The dose-rate effect in human tumour cells.</a> Radiotherapy & Oncology. 9 (4), 299-310 (1987).</li>
<li>Ling, C. C., Gerweck, L. E., Zaider, M., Yorke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-rate+effects+in+external+beam+radiotherapy+redux%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Dose-rate effects in external beam radiotherapy redux.</a> Radiotherapy & Oncology. 95 (3), 261-268 (2010).</li>
<li>Castro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amotosalen%2FUVA+treatment+inactivates+T+cells+more+effectively+than+the+recommended+gammadose+for+prevention+of+transfusion-associated+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gammadose for prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 58 (6), 1506-1515 (2018).</li>
<li>Gaddini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposing+primary+rat+retina+cell+cultures+to+%CE%B3-rays%3A+An+in+vitro+model+for+evaluating+radiation+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Exposing primary rat retina cell cultures to γ-rays: An in vitro model for evaluating radiation responses.</a> Experimental Eye Research. 166, 21-28 (2018).</li>
<li>Simara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+breaks+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+reprogramming+and+long-term+in+vitro+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand breaks in human induced pluripotent stem cell reprogramming and long-term in vitro culturing.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 73(2017).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+biological+effects+of+125I+seeds+continuous+low-dose-rate+radiation+and+60Co+high-dose-rate+gamma+radiation+on+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparison of the biological effects of 125I seeds continuous low-dose-rate radiation and 60Co high-dose-rate gamma radiation on non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0133728(2015).</li>
<li>Lasio, G., Guerrero, M., Goetz, W., Lima, F., Baulch, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+varying+dose-per-pulse+and+average+dose+rate+in+X-ray+beam+irradiation+on+cultured+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+and+Environmental+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Effect of varying dose-per-pulse and average dose rate in X-ray beam irradiation on cultured cell survival.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 53 (4), 671-676 (2014).</li>
<li>Karan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+effects+of+altering+dose+rate+in+filter-free+photon+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiobiological effects of altering dose rate in filter-free photon beams.</a> Physics in Medicine and Biology. 58 (4), 1075-1082 (2013).</li>
<li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination+of+high+dose+rate+%2810X+FFF%2F2400+MU%2Fmin%2F10+MV+X-rays%29+and+total+low+dose+%280.5+Gy%29+induces+a+higher+rate+of+apoptosis+in+melanoma+cells+in+vitro+and+superior+preservation+of+normal+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">A combination of high dose rate (10X FFF/2400 MU/min/10 MV X-rays) and total low dose (0.5 Gy) induces a higher rate of apoptosis in melanoma cells in vitro and superior preservation of normal melanocytes.</a> Melanoma Research. 25 (5), 376-389 (2015).</li>
<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+extra+high+on+glioma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effects of extra high on glioma stem-like cells.</a> PLoS One. 13 (8), 0202533(2018).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+G2%2FM+arrest+rarely+occurred+in+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced G2/M arrest rarely occurred in glioblastoma stem-like cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (4), 394-402 (2018).</li>
<li>Mcdermott, P., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcdermott%2C+P+%22The+Physics+and+Technology+of+Radiation+Therapy%22">The Physics and Technology of Radiation Therapy</a>. , Medical Physics Pub Corp. Madison WI. (2010).</li>
<li>Lohse, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+high+dose+per+pulse+flattening+filter-free+beams+on+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Effect of high dose per pulse flattening filter-free beams on cancer cell survival.</a> Radiotherapy & Oncology. 101 (1), 226-232 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

放射治疗是癌症管理的重要组成部分。目前的研究工作致力于提高放射治疗的效果和效率。直线加速器技术的进步使得能够以空前的精确性和安全性对患者进行治疗。由于大多数患者接受的是来自直线加速器的高能X射线治疗，因此在直线加速器上开展的、针对广泛剂量率范围内生物学效应的研究结果可直接应用于临床患者。已有若干研究报告将直线加速器应用于辐射生物学研究，但结果尚不一致，仍需进一步研究13,14,15,16,19。
直线加速器在一定程度上是安全的，因为当完成规定剂量的照射后，将不再产生X射线。这与放射性同位素持续释放辐射的情况不同。此外，使用直线加速器进行放射治疗可采用复杂的射线束布置方式，从而精确控制靶区形状，并实现广泛可调的剂量和剂量率。该方法的缺点是，由于患者治疗的占用，直...

放射治疗是多种癌症的有效治疗方法1,2,3,4。超高剂量率照射在放射治疗中相对较新，得益于直线加速器技术的最新进展才得以实现5。与标准剂量率照射相比，超高剂量率照射的临床优势包括缩短治疗时间并改善患者的治疗体验。直线加速器还为基于细胞培养的辐射生物学研究提供了临床环境。辐射剂量和剂量率的生物学及治疗学意义数十年来一直是放射肿瘤学家和生物学家关注的重点6,7,8。然而，超高剂量率照射以及闪射照射——一种极高剂量率的辐射形式——的放射生物学特性仍有待深入研究。
伽马射线辐照广泛应用于基于细胞培养的辐射生物学研究9,10,11。辐射通过放射性同位素衰变源（通常为铯-137）释放的伽马射线实现。放射源的使用受到严格监管，且常受限制。基于放射源的辐照难以测试大范围的剂量率，从而限制了其在分析临床可实现剂量率的生物学效应方面的应用12。
已有若干研究阐明了辐射剂量和剂量率的效应12,13,14,15,16,17。在这些研究中，采用了放射性同位素产生的γ射线或直线加速器产生的X射线。使用的细胞系包括代表肺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤的多种细胞系。通过检测细胞存活率、细胞周期阻滞、细胞凋亡和DNA损伤等指标评估辐射效应12,13,14,15,16,17。本文描述了一种利用直线加速器产生X射线辐射，以确定临床相关剂量和剂量率生物学效应的方法。此类研究应由生物学家、放射肿瘤学家和医学物理师密切合作完成。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶质瘤干细胞样细胞 387</td><td></td><td></td><td>由 Jeremy Rich 博士惠赠</td></tr><tr><td>293 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>神经干细胞培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103049</td><td>Neurobasal&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 培养基</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>236-EG-01M</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性 FGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>4114-TC-01M</td><td></td></tr><tr><td>B-27&amp;trade; 添加剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030164</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>赛默飞世尔</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>细胞外蛋白基质</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>Denville</td><td>T1110</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 细胞培养皿</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>CC7682-3340</td><td></td></tr><tr><td>22×22 mm 玻璃盖玻片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72210-10</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M36</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158R10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-233</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-06</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>直线加速器</td><td>Varian</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>水等效材料</td><td>Sun Nuclear Corporation</td><td>557</td><td>Solid Water&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂配制&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>在 500 ml DMEM 培养基中加入 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素 G、100 &amp;micro;g/mL 链霉素</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干细胞培养基</td><td>在 500 ml Neurobasal 培养基中加入 10 ml B27 添加剂、20 &amp;micro;g hFGF、20 &amp;micro;g hEGF、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素 G、100 &amp;micro;g/mL 链霉素</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用直线加速器进行体外放射生物学实验

Use of a Linear Accelerator for Conducting In Vitro Radiobiology Experiments

放射治疗仍然是癌症治疗的主要手段之一。对于大多数癌症而言，它是减小肿瘤体积最有效的非手术疗法。本文介绍了一种使用直线加速器对癌细胞进行照射的方法。直线加速器技术的进步显著提高了放射治疗的精确性和效率。不同辐射剂量和剂量率所产生的生物学效应，仍是当前研究的热点领域。利用直线加速器可实现临床相关剂量和剂量率下的实验研究，从而推动该领域的深入探索。

为研究直线加速器产生的标准剂量率与超高剂量率照射对细胞周期的影响，采用本方案制备三份胶质瘤干细胞样细胞样本，并在照射后24小时收集细胞17：一个未受辐照的对照样本（图2A），一个样本以400 MU/min（监测单位，4.2 Gy/min标准剂量率）照射， 图2B）至4 Gy，另一份样品以2100 MU/min（21.2 Gy/min超高剂量率， 图2C) 至 4 Gy。细胞周期分布图显示了处于细胞周期不同阶段的细胞百分比。
<img alt="不同辐射剂量和剂量率下的细胞周期分析流式细胞术直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59514/59...

临床直线加速器可用于确定多种剂量率对癌细胞产生的生物学效应。我们将讨论如何设置直线加速器，以开展基于细胞的实验，包括悬浮培养的肿瘤球形式生长的癌干细胞样细胞实验，以及贴壁培养的细胞系实验。

放射治疗仍然是癌症治疗的基石之一。对于大多数癌症而言，它是减小肿瘤体积最有效的非手术疗法。

放射治疗最常使用直线加速器进行。本方案使研究人员能够利用直线加速器评估辐射对细胞的生物学效应。该技术的优势在于，通过使用直线加速器，研究人员可以研究一系列具有临床相关性的剂量和剂量率。此外，该方案可适用于所有类型的癌细胞。本方法可使用与本文所示类似的设备进行，例如其他厂商生产的直线加速器。对于未具备使用直线加速器进行剂量学计算经验的人员，可能难以准确计算出将所需剂量传递至样本所需的监测单位数。此类人员应寻求有经验的医学物理师或剂量师的指导。使用直线加速器精确地向样本施加剂量需要仔细的定位与放置。在预定照射前两天，于超净工作台内，使用无菌的5毫升移液管将胶质瘤干细胞样细胞从培养板中收集至15毫升离心管中。在台式离心机中以200 × g离心3分钟。弃去上清液，并用1毫升胰蛋白酶-EDTA重新悬浮细胞沉淀。在室温下孵育五分钟，以消化沉淀物，并用胰蛋白酶-EDTA 制备单细胞悬液。消化过程中每两分钟轻轻振荡离心管底部，确保细胞充分消化。然后加入三毫升干细胞培养基以终止胰蛋白酶反应，轻轻混匀，再在台式离心机中以 200 × g 离心三分钟。弃去上清液后，用五毫升细胞培养基重悬细胞沉淀，并用血细胞计数板对细胞进行计数。将五百万个细胞分种至两个含有十毫升细胞培养基的十厘米培养皿中，在37摄氏度条件下培养48小时。在预定照射前，收集细胞并按前述方法进行离心。弃去上清液，并用五毫升细胞培养基重悬细胞沉淀。取一毫升细胞悬液加入含有两毫升细胞培养基的35毫米培养皿中，确保培养基高度达到一厘米。将接种了细胞的培养皿转移至次级容器中以降低污染风险，并将装有细胞的容器放在实验推车上，运送至辐照设施对细胞进行辐照处理。照射前一天，在细胞培养罩内操作，使用连接真空泵的巴斯德吸管将细胞培养板中贴壁细胞系的DMEM培养基吸除。随后用5 mL无菌PBS洗涤细胞，以去除残留的培养基。向培养皿中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，并轻轻倾斜培养板，确保溶液完全覆盖整个皿面。室温孵育五分钟后，加入三毫升 DMEM 培养基以终止胰蛋白酶-EDTA 反应。使用五毫升移液器将细胞收集至 15 毫升离心管中，离心后，按照文中所述方法培养细胞。为使用 LINAC 控制台软件照射上述预先制备的细胞，需将加速器机架和准直器设为零度，将 X 和 Y 准直器开口调至对称的 5 厘米 × 5 厘米方野，并收回多叶准直器。在治疗床上添加至少五厘米的等水材料，并将待照射的细胞培养皿置于直线加速器（LINAC）十字准线的中心位置。将细胞置于六兆伏X射线束中最大剂量深度处，约为1.5厘米，并在培养皿上方再添加一厘米的等水材料。将前部指针固定到直线加速器头部，并将其延伸至接触建成区材料的表面。调节桌面高度，直至辐射源到建成表面的距离为 100 厘米。离开治疗室，确保所有人员均已撤离。确认房间内无其他细胞存在，然后关闭治疗室门。在控制台确认照射野大小、监测单位及每分钟监测单位，然后开启辐射束照射细胞。采用本方案制备了三份胶质瘤干细胞样细胞样本，并在照射后24小时收集。计算了这些细胞的细胞周期分布，并显示处于细胞周期不同阶段的细胞百分比。与未照射的对照细胞相比，在以标准剂量率或超高剂量率照射胶质瘤干细胞后，观察到G2细胞周期阻滞。为了确保准确的剂量递送，最重要的是测量培养皿中培养基的高度，以确保其达到1厘米。在此步骤之后，可进行其他生物学检测，如免疫染色、蛋白质印迹和细胞周期分析。由于该方案为研究人员提供了具有临床相关性的剂量和剂量率设置，因此可用于评估辐射对多种基于细胞培养模型的影响。

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