使用直线加速器进行体外放射生物学实验

放射治疗最常使用直线加速器进行。本方案使研究人员能够利用直线加速器评估辐射对细胞的生物学效应。该技术的优势在于，通过使用直线加速器，研究人员可以研究一系列具有临床相关性的剂量和剂量率。

此外，该方案可适用于所有类型的癌细胞。本方法可使用与本文所示类似的设备进行，例如其他厂商生产的直线加速器。

对于未具备使用直线加速器进行剂量学计算经验的人员，可能难以准确计算出将所需剂量传递至样本所需的监测单位数。此类人员应寻求有经验的医学物理师或剂量师的指导。使用直线加速器精确地向样本施加剂量需要仔细的定位与放置。

在预定照射前两天，于超净工作台内，使用无菌的5毫升移液管将胶质瘤干细胞样细胞从培养板中收集至15毫升离心管中。在台式离心机中以200 × g离心3分钟。弃去上清液，并用1毫升胰蛋白酶-EDTA重新悬浮细胞沉淀。

在室温下孵育五分钟，以消化沉淀物，并用胰蛋白酶-EDTA 制备单细胞悬液。消化过程中每两分钟轻轻振荡离心管底部，确保细胞充分消化。然后加入三毫升干细胞培养基以终止胰蛋白酶反应，轻轻混匀，再在台式离心机中以 200 × g 离心三分钟。

弃去上清液后，用五毫升细胞培养基重悬细胞沉淀，并用血细胞计数板对细胞进行计数。将五百万个细胞分种至两个含有十毫升细胞培养基的十厘米培养皿中，在37摄氏度条件下培养48小时。在预定照射前，收集细胞并按前述方法进行离心。

弃去上清液，并用五毫升细胞培养基重悬细胞沉淀。取一毫升细胞悬液加入含有两毫升细胞培养基的35毫米培养皿中，确保培养基高度达到一厘米。将接种了细胞的培养皿转移至次级容器中以降低污染风险，并将装有细胞的容器放在实验推车上，运送至辐照设施对细胞进行辐照处理。

照射前一天，在细胞培养罩内操作，使用连接真空泵的巴斯德吸管将细胞培养板中贴壁细胞系的DMEM培养基吸除。随后用5 mL无菌PBS洗涤细胞，以去除残留的培养基。向培养皿中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，并轻轻倾斜培养板，确保溶液完全覆盖整个皿面。

室温孵育五分钟后，加入三毫升 DMEM 培养基以终止胰蛋白酶-EDTA 反应。使用五毫升移液器将细胞收集至 15 毫升离心管中，离心后，按照文中所述方法培养细胞。为使用 LINAC 控制台软件照射上述预先制备的细胞，需将加速器机架和准直器设为零度，将 X 和 Y 准直器开口调至对称的 5 厘米 × 5 厘米方野，并收回多叶准直器。

在治疗床上添加至少五厘米的等水材料，并将待照射的细胞培养皿置于直线加速器（LINAC）十字准线的中心位置。将细胞置于六兆伏X射线束中最大剂量深度处，约为1.5厘米，并在培养皿上方再添加一厘米的等水材料。将前部指针固定到直线加速器头部，并将其延伸至接触建成区材料的表面。

调节桌面高度，直至辐射源到建成表面的距离为 100 厘米。离开治疗室，确保所有人员均已撤离。确认房间内无其他细胞存在，然后关闭治疗室门。

在控制台确认照射野大小、监测单位及每分钟监测单位，然后开启辐射束照射细胞。采用本方案制备了三份胶质瘤干细胞样细胞样本，并在照射后24小时收集。计算了这些细胞的细胞周期分布，并显示处于细胞周期不同阶段的细胞百分比。

与未照射的对照细胞相比，在以标准剂量率或超高剂量率照射胶质瘤干细胞后，观察到G2细胞周期阻滞。为了确保准确的剂量递送，最重要的是测量培养皿中培养基的高度，以确保其达到1厘米。在此步骤之后，可进行其他生物学检测，如免疫染色、蛋白质印迹和细胞周期分析。

由于该方案为研究人员提供了具有临床相关性的剂量和剂量率设置，因此可用于评估辐射对多种基于细胞培养模型的影响。