原子吸纳光谱测量哺乳动物细胞细胞内锌池

过渡金属在哺乳动物发育中的作用在很大程度上被低估了。新的证据表明，金属平衡继续根据细胞和组织发育阶段的变化。此外，金属的特定细胞目的地在开发中也是品种，当然，要确定它们的位置也具有挑战性。

迄今为止，已经开发了不同的分析技术来量化金属，但大多数是昂贵的或无法访问的。深入的研究的重点是以更方便和更有效率的方式改进金属测定。石墨炉原子吸收光谱，GF-AAS，有两个主要优点。

它提供了低锌检测限值，允许精确的微量锌分析。它也是一种不需要大量样品的技术，溶液的微升往往足以进行分析。这两个优势的结合使GF-AAS成为分析低体积样品中微量元素的理想之选。

几种人类病理状况与金属失衡有关。一些例子是贫血，杂技炎肠病，威尔逊和门克斯的疾病。因此，必须开发高效可靠的方法，以高灵敏度和准确性测量生物样品中过渡金属的水平。

GF-AAS 是一项技术上的一个极好示例，该技术有助于在正常生理条件下和致病情况下确定任何给定金属。这种方法用途广泛。它可以应用于许多系统，许多元素可以使用GF-AAS进行分析。

面临的挑战是建立实际检测的方法限制，确保样本在此限制内。鉴于样品数量很少，因此没有很多检测空间，因此从一开始就需要仔细检查数据。在对样品进行第一次分析后，我们需要确定将样品带到定量所需的限值所需的稀释因子。

在进入 AAS 之前，请确保能够正确分馏核。在光谱分析之前，西方的印迹总是很好的验证。虽然 GF-AAS 需要低容量，但细胞内池的容量已经很低。

这几乎没有测试的余地。第一次测量需要仔细完成和检查，因此样品处理可以最小化为只有一个稀释因子。首先，在55平方厘米的板块中培养感兴趣的细胞。

使用真空陷阱吸气文化介质。请务必删除所有介质痕迹。使用不含钙和镁的冰冷PBS从所需时间点或培养条件冲洗细胞三次。

然后向板中加入一毫升冰冷PBS，然后刮掉板上的细胞。将细胞悬浮液转移到1.5毫升微离心管中，并放在冰上。在10，000倍G下离心10秒，通过吸气去除上一代。

如果需要对细胞质和核馏分进行金属分析，将细胞颗粒重新暂停在含有0.1%NP-40（非离子洗涤剂）的400微升冰冷PBS中。将100微升转移到一个新的微离心管作为整个细胞样品，并储存在零下20摄氏度。要分离核，请使用 P1000 微移液器尖端移液 400 微升细胞悬浮液上下 5 到 10 次冰上。

然后，提取细胞悬浮液的五微升，将其转移到显微镜玻璃幻灯片上。使用 40 倍的镜片将五个微升置于光学显微镜下，以验证核的完整性。将剩余的395微升细胞在10，000倍G下分离10秒，将含有细胞酸分的上流液转移到一个新的微离心管中。

接下来，加入500微升含有0.1%NP-40的PBS，用核馏分冲洗颗粒，并在10000倍G.下离心10秒，然后在同一溶液的100微升中重新暂停含有核的颗粒。要对细胞进行解塞，使用生物破坏器对整个细胞和含有溶液的核进行三次声波化，每次五分钟。继续使用针对核或细胞细胞酸分的抗体，由西方印迹对分数的纯度进行质量控制。

首先，在1.5毫升微离心管中，向含有100、500和100微升细胞悬浮液的细胞悬浮液的整个细胞、细胞质和核成分中加入同等体积的微金属品位的浓缩硝酸，并将其放在80摄氏度的热块中，使细胞培养体分矿化一小时。之后，从热块中拿出管子，放在机架中，在20摄氏度下持续一夜的酸消化。加入过氧化氢样品体积的30%来停止反应。

将样品体积与 18 兆欧姆纯化水一起带到 500 微升。接下来，在15毫升猎鹰管稀释分析级标准一氧化氮在纯净水18兆欧姆，以准备两体积百分之一硝酸溶液作为空白溶液在校准期间。然后，使用两体积百分之一的硝酸溶液稀释一个市售的1000ppm锌库存溶液，浓度为每十亿分之1000。

从每百万锌标准溶液1000份、每1000份每十亿个锌标准溶液中准备工作标准解决方案，然后直接用2体积硝酸溶液稀释至5、8、10、15、20和25ppb。将一毫升0.1%硝酸镁基质改性剂放入聚丙烯样品杯中，然后将杯装入自动取样器旋转木马中。编程原子吸收光谱仪自动将基体改性剂的五微升添加到锌标准和空白。

为标准溶液和样品在原子吸收光谱仪上设置相同的优化条件，引入流量为每分钟250毫升，喷射温度为20摄氏度，石墨炉温在四步法中达到1800摄氏度。应同时测量单个实验的所有标准和样本，以避免因校准差异或蒸发而出错。将灯 C-HCL 优化为 20 安培，波长为 213.9 纳米，狭缝为 0.7 纳米。

将样品放入聚丙烯样品杯中，并放入自动取样器旋转木马中。锌检测的下限为十亿分之0.01。通过提高标准的浓度，锌检测的上限确定为十亿分之20。

获得锌标准曲线后，测量矿化样品以确定金属含量。如果获得的数据超过检测限值，用18兆欧姆纯净水稀释样品，用0.1%的分析级硝酸处理。在这种核协议的快速分离中，从区分原核细胞的代表性西方斑点显示了亚细胞分数的纯度。

染色质重塑酶Brg1用于识别核分数，而多布蛋白用于识别细胞酸分。此图显示了每种细胞类型的增殖、分化或汇合单层具有代表性的光显微图，以及全细胞提取物、细胞和核分数中相应的锌含量。本研究中分析的所有细胞系都显示锌浓度在纳米摩尔范围内。

分化的原发性 myotube 的锌含量高于增殖细胞。在神经母细胞瘤衍生细胞系N2A中检测到类似的锌亚细胞分布。另一方面，在脂肪细胞前增殖时，已建立的3T3-L1细胞系表现出比诱导或分化时更高的锌含量。

MCF10A细胞在增殖细胞中细胞和核分数之间的锌含量相等。一旦MCF10A细胞达到汇合，全细胞锌含量下降40%，金属最集中在细胞细胞分块中。石墨炉原子吸收光谱仪是测量生物和环境样品中过渡和重金属的一种高度灵敏的技术。

在制备亚细胞分馏时应特别小心和清洁，因为由于设备的敏感性，最小的污染可能会干扰分析。鉴于每个实验中金属的体积和微量含量较低，很难想到比 GF-AAS 更好、更准确的锌测量技术。目前没有任何技术可以提供检测限制和低容量所需的低容量，在相对较低的GF-AAS成本。

石墨炉原子吸收光谱法准确、灵敏、经济高效且易于访问。随着元素检测技术的不断发展，这种分析技术将继续改进。GF-AAS未来用于检测锌和其他金属的应用将包括器官、从动物模型中获得的组织，以及来自与全身金属失衡相关的疾病患者的活检。

硝酸是一种极腐蚀性的酸，能够迅速引起严重的化学灼伤。这种化学物质也会与某些化合物（如金属粉末）发生剧烈反应。由于硝酸带来的危险，在处理硝酸时，必须采取严格的安全措施。

处理硝酸时，我们强烈建议您佩戴安全化学眼镜、防溅面罩、手套和经批准的蒸汽呼吸（如果通风不足）。