实现干扰反射显微镜,实现无标签、高速微管成像

该协议的意义是，它引入了一种无标签成像技术，能够以高帧速率获取高对比度图像，这种技术比 DIC 和暗场等其他技术更简单、更便宜。此技术的主要优点是易于实现和使用。它价格低廉，可以方便地与荧光显微镜结合使用。

该方法用于可视化单个微管。它有可能用于可视化大型蛋白质复合物和纳米粒子。主要困难是修补滤波立方体添加半银镜所需的激活能量。

我给第一次尝试这种技术的人的建议是去做。首先，使用适当的滤波块将 50/50 镜插入荧光显微镜的滤轮中。小心处理镜子，因为它们经常有一个反反射编码。

转向具有高数值孔径的高放大倍率目标。此处显示的是 100 倍油目标，数值孔径为 1.3。接下来，使用剃须刀刀片和显微镜幻灯片作为直边切割三毫米宽的塑料石蜡薄膜条。

将两个塑料石蜡薄膜条分开三毫米，放在干净的 22 微 22 毫米盖滑上，然后在条片顶部放置 18 到 18 毫米的盖条，形成通道。将盖滑到 100 摄氏度的热块 10 到 30 秒，使石蜡薄膜形成密封通道。使用移液器，通过灌注每毫升50微克的抗罗丹胺抗体，并孵育10分钟。

孵育后，使用过滤的BRBR80洗涤通道五次，然后在过滤的BRBR80中以1%Poloxamer 407流动，以阻止表面对非特异性结合，并孵育幻灯片10分钟。同样，使用过滤的 BRB80 清洗通道五次。为防止样品干燥，在通道末端添加两滴过滤的BRR80，并根据需要添加更多缓冲液。

将样品放在显微镜舞台上，然后打开光照光源。聚焦石蜡薄膜边缘以查找样品表面，然后移动字段将视图设置为腔室的中心。当目标在光学路径内光学光的背反射下上下移动时，您将观察多个表面。

接下来，将字段隔膜居中，将视点中区域的隔膜关闭一半并使用调整螺钉。正确对齐隔膜后，重新打开。然后，在贝特朗镜头中滑动以查看后焦平面，也称为目标的退出瞳孔。

关闭出口瞳孔边缘以外的孔径隔膜，并使用调整螺钉将孔径隔膜与出口瞳孔居中。通过打开光圈隔膜并匹配其边缘与出口瞳孔的边缘进行双检查。然后，将孔径隔膜设置为目标数值孔径的三分之二。

首先，将摄像机的曝光时间设置为 10 毫秒，并调整照明以使摄像机动态范围几乎饱和。接下来，使用移液器在0.22微米过滤BRP80的10微升GMPCPP稳定微管中流动。监控表面成像上的微管结合。

一旦视野内绑住 10 到 20 个微管，用过滤的 BRB80 清洗样品两次。通过设置 10 毫秒曝光的时间推移和 1 秒延迟周期，总共 10 秒，获取 10 张微管图像。然后，使用舞台控制器沿通道的长轴移动舞台，同时毫不拖延地获取 100 个图像，获取背景图像。

要使用脑管图成像微管动力学，请首先将样品加热器温度设置为 37 摄氏度。使用移液器，在10微升的GMPCPP稳定微管种子中流动，通过成像表面活化来监测它们与表面的结合。一旦10至20个种子被束缚在视野内，使用预加热和过滤BRBR80的通道体积的两倍清洗样品。

接下来，在10微升的聚合混合物中流动。要测量微管生长，请使用采集软件设置时间推移，每 5 秒获取一张图像，每次 15 分钟。通过在每个时间点获取平均图像 10 来增强对比度。

获取背景图像，如上一节所示。通过去图像，选择堆栈，然后 Z 项目，然后中位数来计算中位数。通过去处理、去图像计算器和从下拉菜单中选择减法来减去相应的背景。

确保选中 32 位浮点结果选项。对于微管收缩，通过将时间延迟设置为零并保持曝光时间为 10 毫秒，以每秒 100 帧的速度获取图像。使用干扰感应显微镜获取高对比度图像的一个重要因素是正确设置照明的数值孔径。

这可以通过引导目标出口瞳孔处的照明光束大小来完成，该信号器由孔径隔膜大小控制。使用荧光标记的稳定微管样本，使用显微镜的聚焦旋钮对焦，同时对微管进行荧光成像。将摄像机曝光设置为 10 毫秒，并关闭光圈隔膜到其最小开口。

此外，调整照明以接近饱和摄像机的动态范围或直到达到最大值。通过流式传输包含 10 个或更多微图的视场获取 10 张图像。然后获取背景图像。

更改隔膜的大小并调整照明强度以匹配之前确定的大小。获取 10 个新图像和新背景。重复此过程，直到隔膜的整个范围完成。

对于获取的每个视场，减去相应的背景并平均生成的背景减去的图像，如前所述。然后，计算每个开口尺寸的微管的平均信号与背景噪声比。将隔膜大小设置为产生最高信号与背景噪声比的隔膜大小。

有可能有一系列尺寸产生可比较的对比度，如下所示。使用对齐良好的显微镜时，微管应可见，无需背景减法。然而，减去背景确实增强了微管的对比度。

为了进一步增强对比度，可以使用平均、4a 滤波或两者的组合。此处显示的线扫描描述了图像质量的增量改进。这些描述每个处理步骤的背景噪声明显降低。

微管动力学可以在时动图中报告，这些动力学是由时间推移电影生成的。此处显示了以每秒 0.2 帧的帧速率获取的画仪示例。虚线标记种子。

执行此过程时，使用高数值孔径目标非常重要。正确对齐和设置孔径帧的大小也很重要。将 IRM 与荧光成像相结合很容易，例如，微管结合蛋白及其如何改变微管动力学。

该技术可显著减少照片损伤，并允许更高的帧速率采集，从而更容易以高时分辨率和良好的跟踪精度长期研究标有生物聚合物（如微管）的标签。