Name: 可视化蛋白质激酶 在头部固定行为小鼠中使用 Vivo 双光子荧光寿命成像显微镜的活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学习利用双光子荧光寿命成像显微镜在头部固定行为小鼠中可视化蛋白质激酶A活性。该方法通过tAKARα报告基因实时监测皮层神经元信号动态，揭示运动过程中PKA活性变化机制。

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感谢Tess J. Lameyer女士、Ruth Frank女士和Michael A. Muniak博士提供的修改意见和建议，感谢Max Planck Florida研究所的Ryohei Yasuda博士提供2pFLIM采集软件。本研究由两项BRAIN计划资助项目U01NS094247（H.Z.和T.M.）和R01NS104944（H.Z.和T.M.）、R01基金R01NS081071（T.M.）以及R21基金R21NS097856（H.Z.）支持。所有资助均来自美国国家神经疾病和卒中研究所。

本文所述所有方法均已获得俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 双光子FLIM显微镜设置
<ol>
	<li>安装光子定时计数模块（PTCM，材料表），并根据制造商手册将其连接至计算机（图1）。 
	注意： PTCM通常是一块计算机板卡，接收来自激光脉冲的“同步”输入信号以及来自光电倍增管（PMT）的光子输入信号。它还接收来自双光子成像控制软件的像素、扫描线和帧的时钟信号。PTCM利用这些时钟信号将单个光子分配到不同的像素和帧中。</li>
	<li>添加一个带宽&#62;200 MHz的光电二极管以测量激光时序。在光路中放置标准玻璃盖玻片，将一小部分激光反射至垂直于光路放置的光电二极管中（图1）。将光电二极管输出连接至PTCM的“同步”输入端。 
	注意： 许多现代激光器本身即可输出激光时序信号。对于此类激光器，无需使用光电二极管，可直接将激光器的时序输出连接至PTCM的同步输入端。</li>
	<li>更换PMT，对于tAKARα，需将绿色通道的PMT更换为低噪声、快速响应的GaAsP PMT（图1）。将PMT输出连接至PTCM的信号输入端。
	<ol>
		<li>如需通过传统的双光子成像通道同时采集强度信号，可选配信号分路器（图1）。将PMT输出连接至信号分路器，并将分路器输出分别连接至PTCM和传统的双光子成像模块。 
		注意： GaAsP PMT产生的单光子信号比传统碱金属PMT更快，可更精确地确定光子到达时间。某些型号的GaAsP PMT可冷却至比环境温度低10−35 °C，从而将暗计数抑制到每秒几百次以下（通常≤200 计数/秒）。这种低噪声水平对于荧光寿命的精确测量至关重要，因为噪声光子计数难以从荧光寿命曲线中有效区分或扣除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如存在来自受体荧光团的光谱干扰，应添加带通荧光发射滤光片以最小化光谱污染。例如，对于tAKARα，绿色通道使用500 nm ± 20 nm的截止滤光片，以减少来自受体sREACh的干扰，sREACh是一种暗态（量子产率~0.07）黄色荧光蛋白（YFP）29,30。根据控制软件的要求及PTCM用户手册中的说明，连接适当的定时信号，如单个图像像素、扫描线和帧的时钟信号。安装相应的数据控制与采集软件。 
	注意： 某些PTCM制造商（材料表）提供用于双光子荧光寿命成像（2pFLIM）的专用软件。本实验中使用由Yasuda实验室（Max Planck Florida，通过个人通讯）开发的自定义软件FLIMimage。该软件作为某些双光子采集软件的附加用户功能运行（材料表），可在双光子成像过程中在适当时机控制并同步PTCM，以实现2pFLIM图像的采集。</li>
</ol>
2. 电动跑步机的构建
注意： 自制电动跑步机的设计如图2所示。
<ol>
	<li>切割泡沫轴（&#216; 使用细齿钢锯将长度为200毫米的物体切割至150毫米。或者，将泡沫球的两半粘合在一起，并在接缝处贴上胶带。可选地，在滚轮上粘贴带凸纹的橡胶垫以增加滚轮的摩擦力。</li>
	<li>钻孔 &#188; 在滚轮的平坦一侧中心钻一个直径为1英寸的孔，或钻一个 &#188; 如果使用泡沫球，则在球体每一半的中部打一个直径为1英寸的孔。</li>
	<li>安装一个 &#188; 通过孔洞穿入一根直径为1英寸的钢制轴。使用与泡沫材料兼容的胶水将泡沫滚轮/球固定在轴上。可选地，改装两个柔性轴联轴器（&#188; 英寸内径）以增强轴与泡沫滚筒/球的连接。 
	注意： 请注意，许多常见的胶水可能会溶解泡沫材料。
	<ol>
		<li>每个轴联接器均应平放在矩形金属板（0.7 mm × 15 mm × 76 mm）的中心位置，然后将金属板与轴联接器焊接固定。钻孔一个 &#188; 在平板中央开一个英寸孔，用于将改装后的轴联轴器安装到轴上，同时在金属板中央两侧开两个螺钉孔。</li>
		<li>将轴联轴器安装到泡沫滚筒/球体的轴上。若使用球体，可轻微弯曲平板以贴合球体的曲率。将螺钉插入侧孔，以固定滚筒/球体与轴。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在笼板中心钻孔并攻出3/8-32螺纹，安装旋转编码器。在直角电机支架底部钻一个螺钉孔，以便将电机固定到立柱支架上。使用柔性轴联轴器将旋转编码器和电机均连接至轴的末端。</li>
	<li>使用支架将组装好的跑步机安装在铝制实验板上，用于固定电机和旋转编码器&#160;(图2）。将电机输入端连接至速度控制器，并将旋转编码器&#160;输出至计算机数据采集（DAQ）板的模拟输入端。 
	注意： 旋转角速度由旋转编码器以电压形式编码，并通过使用MATLAB编写的自定义软件AnimalTracker进行数字化。</li>
	<li>安装与头板兼容的夹持器至直角位置&#160;支架。在跑台前方的面包板上安装一根固定的立柱，并将装有直角支架的头板固定器组件安装在立柱上（图2确保头板固定杆与轴对齐，使小鼠在跑步机上能够保持适当且舒适的行走姿势（图2C).</li>
</ol>
3. 小鼠皮层中 tAKARα 传感器的表达
<ol>
	<li>子宫内电穿孔
	<ol>
		<li>通过向质粒DNA（3−4 μg/μL）中加入终浓度为0.2%的快绿染料（用于注射过程中的可视化），制备用于宫内电转染（IUE）的DNA溶液。 &#181;克/&#181;L；含有CAG启动子、传感器序列和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）翻译增强子的传感器载体，溶解或稀释于水或Tris-EDTA中。</li>
		<li>准备一只定时妊娠的雌性小鼠（例如 C57BL/6）用于 E16 时期的宫内电转染（IUE）24用异氟烷麻醉小鼠（诱导浓度4%，维持浓度1.5%，载体为95% O2与5% CO2）2) 并皮下注射围手术期镇痛剂，其中包含 5 mg/kg 美洛昔康（Meloxicam）和 4 mg/kg 布比卡因（Bupivacaine）。使用手术刀和剪刀切开腹腔，小心暴露子宫角。</li>
		<li>注射1 &#181;每侧脑半球的侧脑室中，每个胚胎注射 L 体积的 DNA 溶液，具体操作如前所述24.</li>
		<li>进行常规IUE24 通过将电穿孔仪的正极电极足端置于皮层，并使用5次100毫秒方波脉冲（38 V）、频率1 Hz，对皮层神经元进行处理。 
		注意：通过调整电极末端足部相对于侧脑室的位置，可针对不同的皮层区域进行电穿孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立体定位注射 
	<ol>
		<li>准备一只出生后第30天的小鼠用于立体定位手术26.&#160;按照步骤3.1.2所述麻醉小鼠，并皮下注射含5 mg/kg卡洛芬的围手术期镇痛剂。</li>
		<li>稀释表达hSyn-tAKAR的AAV2/1型腺相关病毒（AAV2/1）&#945;-WPRE 至经验确定的滴度（约 1 x 109−1 × 1010 基因组/&#181;L）经注射器滤器（0.2 μm）过滤 &#181;m 醋酸纤维素膜）磷酸盐缓冲液</li>
		<li>钻一个约500 &#956;在体视显微镜下，使用手持钻头在运动皮层的以下坐标位置钻出一个直径为 m 的孔：前囟前 0.5 mm，中线外侧 1.2 mm。</li>
		<li>将注射装置（例如油压操纵器，配备自制的柱塞/玻璃微量移液器固定器）安装至电动操纵器上。将注射针置于15&#176; 相对于前囟-后囟平面的角度。在x轴和z轴上编程进行对角移动，相当于700 &#181;米和200 &#181;分别沿前后轴和背腹轴的运动进程。 
		&#8203;注意： 为避免损伤目标成像区域正上方的组织，腺相关病毒（AAV）颗粒被注射至相对于前囟-后囟平面呈一定角度的位置。</li>
		<li>将注射针尖置于钻孔中心的软脑膜处，并缓慢执行对角线移动（约25 &#181;m/s）如上所述。该操作将使注射中心位于前囟前1.2 mm、中线外侧1.2 mm、软脑膜下0.2 mm处。</li>
		<li>注射20 nL稀释的病毒颗粒（约10 nL/min）。等待至少10分钟，然后缓慢撤出注射针（约12.5） &#181;米/秒</li>
		<li>完成立体定位注射操作，并用胶水或缝线闭合皮肤26.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 颅窗的安装
<ol>
	<li>在出生后第30至60天之间，对通过子宫内电穿孔（IUE）（第3.1节）或立体定位注射病毒颗粒（第3.2节）表达tAKARα的小鼠进行颅窗植入。对于感染病毒颗粒的小鼠，应在病毒注射后至少两周再实施颅窗手术。颅窗的安装方法如前所述27,28，具体步骤如下。&#160;按照步骤3.1.2所述方法麻醉小鼠，并皮下注射围手术期镇痛剂Buprenex（0.075 mg/kg）和抗炎剂地塞米松（4 mg/kg）。</li>
	<li>去除骨膜并牵拉颈部肌肉。使用组织粘合剂将皮肤边缘粘附于颅骨上，以避免术后颈部肌肉暴露。</li>
	<li>用手术刀轻轻刮除颅骨表面残留的骨膜并使其干燥。将成像用头固定板（内径8 mm）放置于预定成像区域周围，先用氰基丙烯酸酯胶水将头固定板粘在颅骨上，再用牙科丙烯酸水泥加固。为确保最佳粘附效果，头固定板应紧贴暴露且干燥的颅骨表面。可使用胶水加速剂以加快固化过程。</li>
	<li>使用牙科钻头在预定成像区域（坐标见步骤3.2.3）上方绘制一个直径为5 mm的圆圈，并暴露硬脑膜。</li>
	<li>在硬脑膜表面涂覆一层薄薄的透明聚合物（亦称人工硬脑膜），以完全覆盖整个颅窗区域。该聚合物可保护并稳定硬脑膜。将无菌圆形盖玻片（直径5 mm）置于硬脑膜上，用氰基丙烯酸酯胶水沿颅窗边缘固定盖玻片，随后再用牙科丙烯酸水泥加固。</li>
</ol>
5. 体内双光子荧光寿命成像显微技术
<ol>
	<li>在颅窗植入后两周或更长时间开始进行双光子荧光寿命成像（2pFLIM）（见第4节）。为减少实验过程中因应激带来的干扰，在成像实验开始前应频繁抓握和固定小鼠，使其适应操作。</li>
	<li>使用控制双光子激光器的软件，将双光子激发激光波长设置为960 nm。</li>
	<li>使用4%异氟烷麻醉小鼠。通过夹尾测试和观察呼吸频率确认麻醉效果：夹尾时应无反应，且呼吸频率应降至约每秒1次。&#160;为尽量减少不必要的操作时间，并因该麻醉持续时间仅为两到三分钟，不使用眼部润滑剂。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠转移至电动跑步机（图2C），并将小鼠头板固定于跑步机装置的头板固定器上（详见 图2）。用70%乙醇清洁小鼠颅窗盖玻片表面。</li>
	<li>将固定好小鼠的电动跑步机置于2pFLIM物镜下方。在颅窗盖玻片与物镜之间滴加一滴蒸馏水。</li>
	<li>让固定后的小鼠从麻醉中苏醒，并在显微镜和跑步机环境中适应至少10分钟。&#160;在小鼠苏醒过程中持续监测其呼吸频率。</li>
	<li>在透射光照明下定位注射位置。在明场下记录参考特征（如血管），以便在后续成像过程中准确定位同一兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>屏蔽除脑组织发射光以外的所有入射光。关闭&#160;透射光照明光源，并封闭2pFLIM装置的外壳。通过开启硬件命令电压控制，激活2pFLIM的光电倍增管（PMT）。</li>
	<li>使用2pFLIM采集软件FLIMimage，按照以下推荐参数采集z轴层扫2pFLIM图像，用于清醒小鼠中tAKARα阳性胞体的成像：帧平均设为3帧，扫描速度设为2 ms/线，图像尺寸设为128 × 128像素，视场大小设为90−100 μm。根据样本制备情况和硬件配置调整成像参数。</li>
	<li>在FLIMview软件（自主开发的定制软件；见第6节）中检查所采集的图像。根据步骤5.9调整成像参数，以优化光子计数并最小化光漂白。 
	注意：在活体条件下对tAKARα阳性胞体进行荧光寿命成像时，一个兴趣区域（ROI）内可接受的总积分光子数约为1,000−10,000个，具体数值取决于特定刺激所引起的信号幅度（见讨论部分）。
	<ol>
		<li>如需提高积分光子数并降低寿命估计误差，可减小视场、降低扫描速度、增加激光功率或提高平均帧数。同时，务必使用最低必要的激光功率、帧平均数和扫描速度，以最小化光漂白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以固定时间间隔（例如每30−60秒）重复z轴层扫采集，使用步骤5.10确定的参数进行成像。在跑步机速度为零时，至少采集15分钟的基线2pFLIM图像。</li>
	<li>在持续采集2pFLIM图像的同时，将跑步机转速设为约15 cm/s，持续15分钟。关闭跑步机后继续成像不少于20分钟，以评估强制运动停止后蛋白激酶A（PKA）活性持续的时间。</li>
</ol>
6. 2pFLIM 图像分析
<ol>
	<li>在 FLIMview 中打开获取的图像，并设置 FLIMview 中的以下参数。 
	注意： 参数详情见讨论部分。
	<ol>
		<li>在 FLIMview 中点击单光子计数（SPC）最小值和最大值范围字段，输入适当的 SPC 范围最小值和最大值，通常分别在 1.2−2 和 10−12 ns 之间。</li>
		<li>在 FLIMview 中点击 t0 值字段，并输入 t0 值（通常约为 2 ns）。在 FLIMview 中点击荧光寿命光强最小阈值字段，并将所需阈值设为 5−30 个光子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击新建组按钮（N），并指定一个实验组名称。这将生成一个组合，包含所添加的每幅 FLIM 图像的数据。</li>
	<li>在 FLIMview 的 Roi Controls 模块中点击 ROI 按钮，并在 tAKARα 阳性胞体周围绘制感兴趣区域（ROI）。通过移动 FLIMview 中 z-stack Control 滑块的下限和上限，缩小 z 堆栈范围，以最大程度减少来自其他 z 深度背景光子的信号污染。</li>
	<li>点击 + 按钮，将 FLIM 图像添加到该组（步骤 6.2）。点击 Calc 按钮，计算 ROI 的平均寿命（LT，也称为平均光子发射时间 [MPET]）以及寿命估计误差（δτ）。</li>
	<li>打开时间序列 2pFLIM 成像系列中的下一个文件。重复步骤 6.4。务必调整 ROI 位置和 z 堆栈范围，以在不同时间点对同一 tAKARα 阳性胞体进行测量，因为组织可能随时间发生漂移。</li>
	<li>在 Group Controls 模块的下拉菜单中选择 deltaMPET/MPET0。点击 baseline# 字段，并输入索引（例如，对于步骤 6.3 中创建的组的前五幅图像，输入 1 2 3 4 5）。这将定义用于计算基线寿命（LT0）的图像。</li>
	<li>点击 Plot 以生成图表，显示实验过程中 tAKARα 在定义 ROI 内的 FLIM 响应（ΔLT/LT0）。通过将各个 ROI 的寿命归一化变化（ΔLT）除以其对应的基线寿命（LT0），可实现不同 ROI 之间运动期间 PKA 活性变化的比较。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案展示了使用FRET-FLIM传感器tAKARα在头部固定的行为小鼠中可视化神经调节触发的PKA活性。该应用基于对tAKARα在体外和体内进行的大量测试与表征，以证明所获得的FLIM信号与生理性的神经调节事件相关17。本文以运动诱导的运动皮层中PKA活性这一在体应用为例，详细描述了将传感器递送至脑组织、用于成像的动物手术、行为与成像数据采集所需的硬件和软件要求，以及成像数据分析所用的软件与算法。
通过子宫内电穿孔（IUE）导入DNA质粒或通过立体定位注射AAV颗粒，可将tAKARα传感器引入大脑皮层。根据电穿孔参数和DNA浓度的不同，IUE可在皮层相对较大的区域内实现不同程度的皮层神经元标记密度25。使用IUE所标记的皮层层级取决于手术时的胚胎发育阶段。当需要在特定脑亚区成像大量细胞时，通常采用立体定位注射AAV颗粒。该方法通常在注射中心处产生密集的神经元标记，而距离中心越远，标记密度逐渐降低。重要的是，AAV对脑内细胞的感染效率取决于所使用的AAV血清型。AAV2/1在皮层、丘脑和...

神经调节（也称为慢突触传递）在不同行为状态（如应激、觉醒、注意力和运动）下对大脑功能施加强有力的调控1,2,3,4。尽管其重要性已被广泛认识，但关于神经调节事件发生的时间和位置的研究仍处于初级阶段。神经调节物质包括乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺以及多种神经肽，它们通过激活G蛋白偶联受体（GPCRs），进而触发细胞内第二信使通路，其作用时间尺度广泛，从数秒到数小时不等。虽然每种神经调节物质会引发特定的信号传导事件，但cAMP/蛋白激酶A（PKA）通路是多种神经调节物质共有的下游通路1,5。cAMP/PKA通路调控神经元的兴奋性、突触传递和可塑性6,7,8,9，从而调节神经元网络的动力学特性。由于不同神经元或神经元类型表达不同类型或水平的神经调节物质受体10，相同细胞外神经调节物质在不同神经元中的细胞内效应可能具有异质性，因此必须在单细胞分辨率下进行研究。迄今为止，在动物行为过程中实时监测单个神经元内的神经调节事件仍然具有挑战性。
为了研究神经调节的时空动态，需要采用合适的记录方法。微透析和快速扫描循环伏安法常用于研究神经调节物质的释放，但这些方法缺乏监测细胞事件所需的空间分辨率11,12。类似于在群体成像中利用钙动力学作为神经元电活动的替代指标13，蛋白激酶A（PKA）成像可用于在细胞分辨率水平上读取神经元群体中的神经调节事件。本方案描述了使用一种改进的A激酶活性报告分子（AKAR）在动物行为过程中体内监测PKA活性的方法。该方法可实现对神经元群体的亚细胞分辨率成像，同时具备能够追踪生理状态下神经调节事件的时间分辨率。
AKAR由供体荧光蛋白和受体荧光蛋白组成，两者通过一个PKA磷酸化底物肽段以及一个可结合底物上磷酸化丝氨酸或苏氨酸的叉头相关（FHA）结构域连接14,15。当PKA信号通路被激活时，AKAR的底物肽段发生磷酸化。随后，FHA结构域与磷酸化的底物肽段结合，使两个荧光基团相互靠近，这一状态被称为AKAR的“闭合状态”。磷酸化的AKAR处于闭合状态时，供体与受体荧光基团之间的荧光共振能量转移（FRET）增强。由于磷酸化AKAR的比例与PKA活性水平相关16，因此可通过生物样本中FRET信号的强度来定量PKA的活性水平16,17,18,19,20。
早期的AKARs主要设计用于双色比率成像14。在对脑组织进行深层成像时，由于光散射具有波长依赖性，比率法会受到信号失真的影响17,18,21。如下文所述，荧光寿命成像显微技术（FLIM）能够消除这一问题，因为FLIM仅检测由供体荧光团发射的光子18,21。因此，利用FLIM对FRET进行定量分析不受组织深度的影响17。此外，还可以使用一种“暗态”（即量子产率[QY]较低）的受体荧光团变体，从而释放出一个颜色通道，便于通过同时成像第二个传感器或形态学标记物，实现对正交神经元特性的多重测量17,19,20。
荧光寿命成像（FLIM）通过量化荧光分子处于激发态的时间，即荧光寿命18，来实现检测。荧光分子回到基态，即激发态结束，通常伴随着一个光子的发射。尽管单个激发态分子发射光子的过程是随机的，但在群体水平上，平均荧光寿命是该特定荧光分子的特征参数。当一群纯的荧光分子被同时激发时，所产生的荧光信号将遵循单指数衰减规律。该指数衰减的时间常数即为平均荧光寿命，对于荧光蛋白而言，其典型范围为一到四纳秒。激发态的供体荧光分子回到基态的过程也可通过荧光共振能量转移（FRET）实现。当存在FRET时，供体荧光分子的荧光寿命会缩短。未磷酸化的AKAR传感器表现出相对较长的供体荧光寿命；而在蛋白激酶A（PKA）介导的磷酸化发生后，由于供体与受体荧光分子之间的距离拉近，FRET效应增强，传感器的荧光寿命变短。因此，对一群AKAR传感器中荧光寿命的定量分析，可反映PKA的活性水平。
早期版本的AKAR探针尚未成功用于单细胞分辨率的活体成像，这主要是由于AKAR传感器对生理激活产生的信号幅度较低17。最近，通过对现有的AKAR传感器在双光子荧光寿命成像显微技术（2pFLIM）中的表现进行系统比较，发现一种名为FLIM-AKAR的传感器性能优于其他同类传感器。此外，研究人员开发了一系列称为靶向AKAR（tAKARs）的FLIM-AKAR变体，用于在特定亚细胞区域可视化PKA活性：微管（tAKARα）、胞质溶胶（tAKARβ）、肌动蛋白（tAKARδ）、丝状肌动蛋白（tAKARε）、细胞膜（tAKARγ）以及突触后密度区（tAKARζ）。在这些tAKAR探针中，tAKARα使去甲肾上腺素诱导的信号幅度提高了2.7倍。这一结果与已知的神经元中大部分PKA在静息状态下锚定于微管上的认识一致22,23。tAKARα是目前用于2pFLIM的性能最优的AKAR探针。此外，tAKARα能够检测多种神经调节剂引发的具有生理相关性的PKA活性，且tAKARα的表达不会改变神经元功能17。
最近，tAKARα 已成功用于在固定头部并处于行为状态的小鼠中可视化 PKA 活性17。研究表明，强制运动可触发运动皮层、桶状皮层和视觉皮层中浅层神经元胞体（第1至第3层，从软脑膜起深度约300 μm范围内）的 PKA 活性。这种由运动触发的 PKA 活性部分依赖于β-肾上腺素能受体和 D1 多巴胺受体介导的信号通路，但不受 D2 多巴胺受体拮抗剂的影响。该研究展示了利用双光子荧光寿命成像（2pFLIM）在活体内追踪神经调节事件时 tAKARs 的应用能力。
本方案详细描述了在固定头部的清醒小鼠进行强制运动范式期间，开展PKA活性成像的完整方法，共分为六个步骤。第一步，为常规双光子显微镜增加双光子荧光寿命成像（2pFLIM）功能（图1）。第二步，构建电动跑步机（图2）。第三步，通过子宫内电穿孔（IUE）将DNA质粒导入小鼠胚胎，或通过立体定位注射腺相关病毒（AAV），在小鼠皮层表达tAKARα传感器。此前已有优秀的IUE手术24,25和病毒颗粒立体定位注射26方案发表。我们所使用的关键参数将在下文描述。第四步，安装颅窗。此前已有优秀的颅窗手术方案发表27,28，本文描述了对标准方案进行的若干修改步骤。第五步，进行活体2pFLIM成像。第六步，对2pFLIM图像进行分析（图3和图4）。该方法应可便捷地应用于多种其他固定头部行为范式及脑区研究。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;mu;m 醋酸纤维素注射器滤器</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td>步骤 3.2.2.</td></tr><tr><td>16倍 0.8 NA 水浸物镜</td><td>Nikon</td><td>MRP07220</td><td>步骤 5.5.</td></tr><tr><td>3针电缆</td><td>US digital</td><td>CA-MIC3-SH-NC</td><td>步骤 2.5. 用于连接旋转传感器与显微镜的DAQ输入端口</td></tr><tr><td>铝制光学平台板</td><td>Thorlabs</td><td>MB1012</td><td>步骤 2.5.</td></tr><tr><td>AnimalTracker MATLAB 软件</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>步骤 2.5 及第5–6节。可向通讯作者申请获取</td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET500-40m</td><td>步骤 1.4.</td></tr><tr><td>笼式安装板</td><td>Thorlabs</td><td>CP01</td><td>步骤 2.4. 用作旋转传感器的安装支架</td></tr><tr><td>微型钻头用碳钢钻头，尖端直径 0.5 mm</td><td>FST</td><td>19007-05</td><td>步骤 3.2.3. 和 4.4.</td></tr><tr><td>圆形盖玻片（直径 5 mm）</td><td>VWR</td><td>101413-528</td><td>步骤 4.5.</td></tr><tr><td>定制注射针固定装置</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>步骤 3.2.4. 技术细节可向通讯作者申请获取</td></tr><tr><td>牙科丙烯酸树脂</td><td>Yates Motloid</td><td>44114</td><td>步骤 4.3. 和 4.5.</td></tr><tr><td>牙科钻机；Microtorque ii</td><td>Ram products</td><td>66699</td><td>步骤 3.2.3. 和 4.4.</td></tr><tr><td>道康宁透明聚合物</td><td>The Dow Chemical Company</td><td>3-4680</td><td>步骤 4.5. 人工硬脑膜</td></tr><tr><td>电穿孔电极</td><td>Bex</td><td>LF650P5</td><td>步骤 3.1.4.</td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Bex</td><td>CUY21</td><td>步骤 3.1.4.</td></tr><tr><td>亮蓝FCF</td><td>Sigma-aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>步骤 3.1.1.</td></tr><tr><td>FLIMimage MATLAB 软件</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>第5节。由Max Planck Florida研究所Ryohei Yasuda博士惠赠</td></tr><tr><td>FLIMview MATLAB 软件</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>第5和第6节。可向通讯作者申请获取</td></tr><tr><td>泡沫兼容胶水（Gorilla 白胶）</td><td>Gorilla</td><td>5201204</td><td>步骤 2.3.</td></tr><tr><td>头固定板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>步骤 4.3. 技术细节可向通讯作者申请获取</td></tr><tr><td>头固定板支架</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>步骤 2.6. 技术细节可向通讯作者申请获取，需与安装柱支架和直角支架配合使用</td></tr><tr><td>液压显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td>步骤 3.2.4.</td></tr><tr><td>Krazy胶水</td><td>Krazy glue</td><td>KG82648R</td><td>步骤 4.3. 氰基丙烯酸酯类胶水</td></tr><tr><td>低噪声高速光电倍增管</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422PA-40 或 H10769PA-40</td><td>步骤 1.3.</td></tr><tr><td>MATLAB 2012b</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>步骤 2.6 及第5、6节。用于运行显微镜采集和数据分析软件</td></tr><tr><td>电机</td><td>Zhengke</td><td>ZGA37RG</td><td>步骤 2.4.</td></tr><tr><td>电机调速控制器</td><td>Elenker</td><td>EK-G00015A1-1</td><td>步骤 2.5.</td></tr><tr><td>电动显微操作器</td><td>Sutter</td><td>MP-285</td><td>步骤 3.2.4.</td></tr><tr><td>安装底座</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S</td><td>步骤 2.5. 与PH4和TR2配合使用，用于电机和传感器的安装柱</td></tr><tr><td>安装柱</td><td>Thorlabs</td><td>P14</td><td>步骤 2.6. 与PB2配合使用，用于头固定板支架的安装柱</td></tr><tr><td>安装柱底座</td><td>Thorlabs</td><td>PB2</td><td>步骤 2.6. 与P14配合使用，用于头固定板支架的安装柱</td></tr><tr><td>安装柱支架</td><td>Thorlabs</td><td>C1515</td><td>步骤 2.6. 与直角支架和头固定板支架配合使用</td></tr><tr><td>光学安装柱</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>步骤 2.5. 与BA1S和PH4配合使用，用于电机和传感器的安装柱</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>&amp;Nu;/&amp;Alpha;</td><td>&amp;Nu;/&amp;Alpha;</td><td>步骤 3.2.2. 方案来源：Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247</td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>Thorlabs</td><td>FDS010</td><td>步骤 1.2.</td></tr><tr><td>光子计时计数模块</td><td>Becker and Hickl</td><td>SPC-150</td><td>步骤 1.1.</td></tr><tr><td>质粒：tAKAR&amp;alpha; (CAG-tAKAR&amp;alpha;-WPRE)</td><td>Addgene</td><td>119913</td><td>步骤 3.1.3.</td></tr><tr><td>安装柱固定夹</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>步骤 2.5. 与BA1S和TR2配合使用，用于电机和传感器的安装柱</td></tr><tr><td>直角支架</td><td>Thorlabs</td><td>AB90</td><td>步骤 2.6 与安装柱支架和头固定板支架配合使用</td></tr><tr><td>旋转编码器</td><td>US digital</td><td>MA3-A10-250-N</td><td>步骤 2.4.</td></tr><tr><td>橡胶垫</td><td>Rubber-Cal</td><td>B01DCR5LUG</td><td>步骤 2.1.</td></tr><tr><td>轴套联轴器（1/4 英寸 × 1/4 英寸）</td><td>McMaster</td><td>6208K433</td><td>步骤 2.3. 和 2.4.</td></tr><tr><td>ScanImage 3.6</td><td>Svoboda Lab/Vidrio Technology</td><td>N/A</td><td>步骤 5.9. 和 6.1.</td></tr><tr><td>信号分路器</td><td>Becker and Hickl</td><td>HPM-CON-02</td><td>步骤 1.3.1.</td></tr><tr><td>不锈钢轴（直径 1/4 英寸，长度 L = 12 英寸）</td><td>McMaster</td><td>1327K66</td><td>步骤 2.3.</td></tr><tr><td>立体定位对准系统</td><td>David Kopf</td><td>1900</td><td>步骤 3.2. 和 4.1. 经过改装；包含Sutter显微操作器、定制注射针固定装置和液压显微操作器</td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>第5节。基于HHMI Janelia研究园区的模块化活体多光子显微系统（MIMMS）构建（https://www.janelia.org/open-science/mimms）</td></tr><tr><td>Vetbond 组织粘合剂</td><td>3M</td><td>14006</td><td>步骤 3.2.6.</td></tr><tr><td>病毒：tAKAR&amp;alpha; (AAV2/1 hSyn-tAKAR&amp;alpha;-WPRE)</td><td>Addgene</td><td>119921</td><td>步骤 3.2.2.</td></tr><tr><td>白色聚乙烯泡沫滚筒（8 英寸 × 12 英寸）</td><td>Fabrication Enterprises INC.</td><td>30-2261</td><td>步骤 2.1.1.</td></tr><tr><td>白色聚苯乙烯泡沫球半球（直径 200 mm，两个空心半球）</td><td>GrahamSweet</td><td>200mm diameter 2 hollow halves</td><td>步骤 2.1.1.</td></tr><tr><td>Zipkicker</td><td>PACER</td><td>PT29</td><td>步骤 4.3. 硬化加速剂</td></tr></tbody></table>

使用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶a活性

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

神经调节对大脑功能具有强大的调控作用。神经调节系统的功能障碍会导致神经性和精神性疾病。尽管神经调节系统至关重要，但能够以细胞分辨率追踪神经调节事件的技术才刚刚兴起。多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱和5-羟色胺等神经调质通过各自的G蛋白偶联受体触发细胞内信号传导事件，从而调节神经元的兴奋性、突触通讯及其他神经功能，进而调控神经网络中的信息处理过程。上述神经调质均汇聚于环磷酸腺苷/蛋白激酶A（PKA）信号通路。因此，开发了以单细胞分辨率为基准的活体PKA成像技术，作为检测神经调节事件的读出手段，其作用方式类似于利用钙成像来监测神经元的电活动。本文介绍了一种在固定头部的行为小鼠大脑皮层中，对单个神经元水平的PKA活性进行可视化的方法。该方法采用一种改进的蛋白激酶A活性报告分子（AKAR），称为tAKARα，其基于荧光共振能量转移（FRET）原理。这种基因编码的PKA传感器通过DNA质粒的子宫内电穿孔（IUE）或腺相关病毒（AAV）的立体定位注射导入运动皮层。利用双光子荧光寿命成像显微技术（2pFLIM）检测FRET的变化，该技术在量化光散射脑组织中的FRET信号方面优于比值型FRET测量方法。为研究强制运动过程中PKA的活性变化，通过小鼠清醒状态下皮层上方植入的慢性颅窗，对tAKARα进行成像，小鼠在速度可控的电动跑台上进行奔跑或静息。该成像方法可广泛适用于其他多种脑区，用于研究相应行为诱导的PKA活性变化，也可推广至其他基于荧光寿命成像（FLIM）的传感器，用于活体成像研究。

FRET-FLIM 传感器可用于可视化多种不同的信号通路，包括参与神经调节的 cAMP/PKA 通路。本实验方案采用近期开发的 tAKARα 传感器，并结合双光子荧光寿命成像技术（2pFLIM），以在固定头部的行为小鼠中可视化 PKA 活性。大多数现有的双光子显微镜可通过添加三到四个组件升级为具备 2pFLIM 功能，如图1所示（另见第1节）。为了在 2pFLIM 获取的图像中可视化 FRET，需对每个像素收集的光子到达时间直方图进行平均寿命的量化分析（图3A、B）。平均寿命通过伪彩色图像进行可视化展示，其中较高的平均寿命（冷色调）和较低的平均寿命（暖色调）分别代表较低和较高的 PKA 活性，因为 PKA 的激活会导致荧光寿命缩短。必须谨慎正确设置 SPC 范围；该范围应设定在激光脉冲间隔内（例如 80 MHz 脉冲频率对应的 12.5 ns），并尽量减少硬件边缘伪影（另见第6节及“讨论”部分）。对感兴趣区域（ROI）内...

本文介绍了一种在头部固定的活动小鼠中可视化蛋白激酶A活性的方法。通过颅窗将改良的A激酶活性报告基因tAKARα在皮层神经元中表达并实现成像。利用双光子荧光寿命成像显微技术，在强制运动过程中体内可视化PKA活性。

使用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶A活性

神经调节对大脑功能具有强大的调控作用。神经调节系统的功能障碍会导致神经性和精神类疾病。

我们的方法采用了一种新型的蛋白激酶A传感器，称为靶向A激酶活性报告蛋白α（target A kinase activity reporter alpha），简称tAKAR

visualizing-protein-kinase-activity-head-fixed-behaving-mice-using

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

可视化蛋白质激酶 在头部固定行为小鼠中使用 Vivo 双光子荧光寿命成像显微镜的活性

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。...

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

来源： Jongbloets, B. C., et al．利用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶A活性．J. Vis. Exp. (2019)...

利用双光子荧光寿命成像显微技术在小鼠体内可视化蛋白激酶A活性

来源： Pigazzini, M. L., 等 衰老过程中淀粉样结构的表征 秀丽隐杆线虫 使用荧光寿命成像 J. Vis. Exp. (2020).本视频展示了如何利用荧光寿命成像显微技术（FLIM）评估秀丽隐杆线虫（C.

多聚谷氨酰胺蛋白聚集的荧光寿命成像在 秀丽隐杆线虫 神经元

神经元中依赖于经验的分子变化对于大脑应对行为挑战时的适应能力至关重要。 体内...

体内 双光子成像技术观察皮层神经元中由经验引起的相关分子变化

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利用荧光寿命成像显微镜观察细胞内SNARE的运输

免疫反应性成纤维细胞在活化后会发生形态学改变，并促进细胞募集的变化。通过结合双光子成像技术与基因工程改造的成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）-cre；tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB)...

活体双色双光子成像技术用于皮肤中遗传标记报告细胞的观察

我们描述了荧光光激活方法，用于分析来自表达光激活神经丝蛋白的转基因小鼠的外周神经有髓轴突中单根轴突内神经丝的轴突运输。...

离体小鼠胫神经中神经丝运输的成像与分析

多功能丝氨酸/苏氨酸激酶AURKA的活化以其在Thr288位点的自磷酸化为特征。依赖FRET的荧光探针能够区分其非活性与活性状态。本文介绍了一些探针设计策略，并结合一种快速FRET方案，用于追踪有丝分裂过程中激酶的活化动态。...

利用构象型FRET生物传感器在活细胞中实时监测Aurora激酶A的激活

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

本文介绍了一种用于定量活体HepG2细胞中Akt激活及其磷酸化时空动态的实验方案。荧光共振能量转移（FRET）成像是一种强大的工具，可为癌细胞中胰岛素信号通路及代谢调控提供重要见解。...

活细胞中代谢调控的Akt活化动态的Förster共振能量转移成像研究

学习利用双光子荧光寿命成像显微镜在头部固定行为小鼠中可视化蛋白质激酶A活性。该方法通过tAKARα报告基因实时监测皮层神经元信号动态，揭示运动过程中PKA活性变化机制。

使用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶A活性

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