Name: 斑马鱼镜头核定位与功能完整性的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 了解斑马鱼晶状体核定位与功能完整性的评价方法，通过显微解剖和成像技术定量分析晶状体形态与核定位。该方案为研究晶状体发育机制及预防白内障提供了重要基础。

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我们感谢以下资助来源：J.E.H. 获得的 NIH R01 EY05661 项目资助；Ines Gehring 在构建 aqp0a/b 双重突变体及斑马鱼养殖方面提供的协助；Daniel Dranow 博士在转基因品系构建过程中的有益讨论；Bruce Blumberg 博士和 Ken Cho 博士实验室提供体视显微镜的使用；以及 Megan Smith 博士在统计分析方面提供的帮助。

本研究中使用的动物实验方案遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用的规定，并已获得加州大学欧文分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 斑马鱼饲养与安乐死
<ol>
	<li>在标准实验室条件下饲养和维持斑马鱼（AB品系）12。将胚胎置于胚胎培养基（EM）中培养12。从受精后20-24小时（在prim-5阶段之前）开始，在EM中添加0.003% PTU，以防止用于胚胎期成像的胚胎形成色素129。在受精后6至30天期间，以活体轮虫喂养幼鱼直至14 dpf，之后改用活体卤虫喂养12。 
	注意：PTU具有高毒性</li>
	<li>使用三卡因麻醉鱼类直至其对触碰无反应。
	<ol>
		<li>通过将400 mg 3-氨基苯甲酸乙酯与2.1 mL 1 M Tris（pH 9）溶于100 mL ddH2O中配制三卡因储备液。调节pH至7.0，并于-20 °C保存。 
		注意：三卡因具有毒性。</li>
		<li>将4.2 mL三卡因储备液加入100 mL养殖用水中以麻醉幼鱼或成鱼，或加入胚胎培养基（EM）中以麻醉胚胎（终浓度为0.0165% w/v）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胚胎和幼虫的固定
注意：免疫组织化学实验方案改编自先前发表的材料7。
<ol>
	<li>将去壳的胚胎或受精后最多两周的幼体在4% (v/v) 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于4 °C在摇床上固定过夜。 
	注意：PFA易燃且具有致癌性。</li>
	<li>用PBS洗涤胚胎三次，每次10分钟，然后在含10% Triton和1% DMSO的PBS（PBS-T）中于4 °C透化过夜。 
	注意：DMSO有毒，经口摄入或皮肤吸收有害，可携带危险物质穿透皮肤，且易燃。Triton有毒、具有腐蚀性，并对水生环境有害。</li>
</ol>
3. 斑马鱼幼体及成体晶状体的解剖
<ol>
	<li>用三卡因将6 dpf幼鱼至成年鱼麻醉至对触碰无反应但仍有强烈心跳。按照Schilling（2002）的方法测量鱼的标准体长以确定发育阶段13.</li>
	<li>立即使用显微解剖剪切除眼球，并置于含 PBS 的解剖皿中（图2 （成年眼睛的示意图）。
	<ol>
		<li>制作一个装有硅胶的定制35 mm培养皿，用于晶状体解剖。待硅胶凝固后，挖出一个直径约2-3 mm、深度约0.5 mm的凹坑，用于在解剖过程中固定成年眼球/晶状体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年斑马鱼晶状体的解剖
	<ol>
		<li>将一只成年眼球置于盛有 PBS 的培养皿凹槽中，眼球后侧朝上。用镊子插入眼球以固定 &lt;45° 通过视盘切开角度。注意不要划伤或压迫晶状体。使用解剖剪从视盘向睫状区在视网膜和巩膜上做两到三个放射状切口。</li>
		<li>像展开花瓣一样掀开视网膜和巩膜，并将眼球翻转，使角膜朝上。用剪刀的钝面操作巩膜和角膜，间接固定晶状体，同时用镊子将视网膜及附着组织轻轻拉离。仔细修剪晶状体周围多余的组织。 
		注意： 仔细解剖以获得始终健康的晶状体至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>斑马鱼幼虫晶状体的解剖
	<ol>
		<li>将幼虫的眼置于盛有PBS的硅胶培养皿的平坦处，使眼的后侧朝上，用锋利的钨针在另一根钨针或镊子固定眼球的同时，穿过视网膜和巩膜做放射状切割。 
		注意： 注意不要损坏镜头。
		<ol>
			<li>将一段2 cm长、直径0.1 mm的钨丝尖端通过电解法进行 sharpening：将钨丝尖端悬于10%（w/v）NaOH溶液中，并施加低电压交流电14将针头插入巴斯德吸管中，并用本生灯熔化玻璃末端以固定针头。 
			注意： 也可使用其他精细解剖工具。 
			警告： NaOH 具有腐蚀性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用针的钝端轻轻将晶状体从解离的眼球中挖出，并小心移除附着的组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 离体晶状体的固定
<ol>
	<li>立即将解剖得到的晶状体用含1.5% (v/v) PFA的PBS溶液在室温（RT）下固定24小时。用PBS洗涤晶状体三次，每次10分钟。</li>
	<li>对晶状体进行整体染色分析时需进行通透处理，或为冷冻切片做冷冻保护处理（参见第8节）。
	<ol>
		<li>在4 °C下，用PBS-T对晶状体过夜通透处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 晶状体免疫组织化学
<ol>
	<li>通过在鬼笔环肽- Alexa Fluor 546（1:200）中孵育，对固定后的胚胎/幼虫或成体晶状体的膜进行标记 细胞核用 PBS-T 稀释的 DAPI（1:1,000，5 mg/mL 原液）避光孵育过夜 4 °C. 
	注意： DAPI 对皮肤和眼睛具有刺激性。</li>
	<li>用 PBS-T 洗涤三次，每次 10 分钟。在 PBS-T 中依次加入 30%、50% 和 70% 的甘油（v/v），于室温下每步孵育至少 1 小时，或每步过夜，以进行组织透明化处理。 4 °C.</li>
	<li>将鱼置于含70%甘油（v/v）的PBS-T中，固定于35 mm玻璃底培养皿内，尽量使眼睛平直紧贴盖玻片。对于较年轻的鱼，可略微倾斜至前侧方，以帮助调整晶状体缝合线与盖玻片平行。</li>
</ol>
6. 利用转基因品系分析斑马鱼晶状体前部缝合线 体内
<ol>
	<li>生成 Tg(βB1cry:mAppleCAAX) 使用 Tol2 试剂盒的实验步骤15Tol2 转座子系统15 实现由人源300 bp启动子驱动mApple表达的构建体的稳定整合 βB1-晶状体蛋白启动子16 通过CAAX序列锚定在膜上，从而特异性地在晶状体纤维细胞膜中表达。 
	注意： 该载体（货号：122451）可进行购买。
	<ol>
		<li>注射当天早晨，配制注射混合液，并置于冰上保存。为达到最终体积 10 µL 含有无RNase和无DNase的H2O，添加： 1.5 µL 的人类βB1cry:mAppleCAAX DNA 质粒，50 ng/μLµL - [0.375–0.75 pg/终末注射] 1.5 µL Tol2 转座酶 mRNA 的 300 ng/µL （Tol2 试剂盒）15 [15–30 pg/末次注射]，以及 1 µL 1% w/v 的酚红指示剂 [1 x10-5%（w/v）/终浓度注射]</li>
		<li>向单细胞期胚胎注射50-100 pL注射混合物12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过检测3 dpf时mApple阳性晶状体胚胎的频率，测定F0注射胚胎的转基因效率。 
	注意： 预计将会 &gt;使用该方法可实现80%的转基因效率。F0代嵌合体可用于对单个细胞的膜形态进行详细分析。不同程度的嵌合性使得研究者能够对单个细胞或少量细胞群体的形态进行成像，而更广泛的晶状体表达则可用于分析多细胞结构，如晶状体缝合线。 体内.</li>
	<li>将F0代嵌合鱼进行杂交以建立稳定品系，用于标记所有纤维细胞膜。F0代 founder 鱼若将转基因整合至生殖系，其后代将获得稳定的转基因整合，可由此建立并维持转基因品系。</li>
</ol>
7. 利用转基因品系分析斑马鱼晶状体前部缝合线 体内
<ol>
	<li>将 3 dpf 或成年嵌合体或稳定转基因斑马鱼用三卡因麻醉后，置于含三卡因的 1% 低熔点琼脂糖（LMA）中，并使眼睛紧贴玻璃底微型培养皿的盖玻片进行固定。
	<ol>
		<li>将 1 g LMA 溶于 100 mL EM（不含亚甲蓝）中，配制 1% LMA。长期储存时分装为每管 15 mL，置于 4 °C 保存。使用前微波加热溶解，随后置于 42 °C 保温待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LMA 凝固后，用含三卡因的 EM 覆盖 6 dpf 及以下的幼鱼，或用含三卡因的养殖用水覆盖成鱼。
	<ol>
		<li>若对经 PTU 处理的斑马鱼进行成像，取 5 mL 不含亚甲蓝的 EM 或养殖用水，加入 250 µL 三卡因母液及 7 µL PTU。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 晶状体冷冻切片与免疫组织化学
<ol>
	<li>将冷冻保护的固定胚胎或成体晶状体置于10%蔗糖PBS溶液（w/v）中，随后分别在20%蔗糖溶液中室温孵育1小时（或4 °C过夜），最后在30%蔗糖溶液中4 °C过夜。</li>
	<li>将组织包埋于OCT包埋剂中的底模内，再用OCT将其冷冻固定到样品夹上。以12–14 µm厚度进行冷冻切片，并将切片收集至Superfrost/Plus载玻片上。将切片在预热至约35 °C的载片加热器上温育10分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤切片三次，每次10分钟。加入Phalloidin-Alexa Fluor 546（1:200）与DAPI（1:1,000）或WGA-Alexa Fluor 594（1:200）对切片进行标记，随后再进行三次PBS洗涤。用抗荧光淬灭封片剂封片，并用指甲油封固盖玻片。</li>
</ol>
9. 成像
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜获取图像。采用60倍、数值孔径1.2的水浸物镜或类似物镜，从晶状体前极至后极的特定区域获取z轴层扫图像或光学切片。使用以下采集参数：1.2 airy单位，561 nm激光配合Texas red滤光片用于phalloidin-Alexa Fluor 546或mApple，或405 nm激光配合紫外滤光片用于DAPI。</li>
	<li>校正z轴方向的激光功率强度，以补偿随晶状体深度增加导致的信号衰减。该方法可在固定或活体3 dpf胚胎的晶状体后极获得强信号，并在成年鱼晶状体的赤道部光学切片中获得强信号。</li>
	<li>使用图像处理软件对图像进行整合与观察。</li>
</ol>
10. 晶状体核在前后轴方向定位的测量
<ol>
	<li>在35 mm培养皿中，将新切除的晶状体在PBS中以载玻片为底进行轴向定位，使极部和缝合线与焦平面平行。观察折射率的差异，该差异通常出现在晶状体皮质与晶状体核的界面处，以此识别晶状体核。 
	注意： 健康的野生型成年晶状体具有极高的透明度，难以观察晶状体缝合线和晶状体核，也无法确定晶状体的方向。在此情况下，使用镊子在晶状体囊上造成轻微切口，可引起轻微损伤，约10分钟后晶状体缝合线和晶状体核即变得清晰可见，有助于确定晶状体的方位以进行测量。然而，由于晶状体已受损，将无法用于后续实验应用。</li>
	<li>使用带有相机的解剖显微镜，在明场照明下（有或无微分干涉相差光学器件）对晶状体核清晰对焦后拍摄晶状体图像。在相同放大倍数下拍摄显微测微尺的图像，用于校准。
	<ol>
		<li>单击实时查看按钮，调整曝光设置以观察晶状体核及晶状体周边，然后单击拍摄按钮获取图像。保存为 tif 文件。</li>
		<li>使用图像处理软件校准所获取的镜头图像。选择直线工具，在微米尺图像上绘制一段已知长度的直线，点击分析 | 设定比例尺。输入已知距离、单位，并选择“全局”校准，然后点击确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量晶状体核中心至前极的距离（a - r).
	<ol>
		<li>在图像处理软件中，使用直线工具沿轴向穿过晶状体核成像的中心绘制一条直线。将该直线的中点作为晶状体核的中心。</li>
		<li>从该点向晶状体前极画另一条线，在“分析”菜单中选择“测量”，以测定距离a - r），其中 a 是透镜的半径，且 r 是从透镜中心到晶状体核中心的距离。</li>
		<li>从晶状体前极到后极画另一条线，并测量此距离作为晶状体直径（2a）。从“结果”窗口复制这些长度，并转移至电子表格或统计软件中。 
		注意： 从晶状体核中心到晶状体前极的距离比从晶状体核中心到晶状体中心的距离更容易精确测量。该测量值通过步骤10.3.5中的公式转换，以报告晶状体核中心到晶状体中心的距离。测量时应始终使用成体核，即使胚胎核清晰可见。</li>
		<li>将直径除以2，以计算透镜半径。 a.</li>
		<li>计算 r/a，作为 <img alt="数学表达式：几何序列项；序列差异分析方程。" src="/files/ftp_upload/59528/59528eq1.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1">即晶状体核相对于晶状体半径的归一化定位。 
		注意：对于更靠近前极的细胞核， r/a 将是 &gt;0.0，而细胞核位于中央时将具有 r/a 0.0</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将归一化轴向晶状体核测量值的对数作为标准长度的函数作图，以确定斑马鱼发育过程中晶状体核定位的变化。</li>
</ol>

<ol><li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li>
<li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aquaporin+Zero+Puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li>
<li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li>
<li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li>
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<li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
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<li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+%28NKCC1%29+and+sodium+chloride+cotransporter+%28NCC%29+and+their+effects+on+rat+lens+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li>
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<li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li>
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斑马鱼晶状体形态分析是理解突变体表型或研究药理干预对眼晶状体生物学影响的首要步骤。本文概述了分析晶状体缝合线、皮质纤维细胞形态以及晶状体核特征的方法。这些方法结合了 体外 和 体内 （比较于 表格 1）. 该 体外 方法能够更详细地观察外层皮质细胞的形态，并可获取成年晶状体的后部缝合线。
体内分析可通过使用转基因标记实现。我们在此介绍的转基因具有晶状体膜特异性，与现有的Q01斑马鱼品系相比，后者在标记晶状体膜的同时还会标记眼部其他细胞类型（包括无长突细胞），从而增加了解读难度11。由于眼色素上皮在胚胎发育第二天即形成，会限制体内信号的观察，因此在此阶段及后续阶段进行分析时需对胚胎进行PTU处理。在成体中，虹膜会遮挡晶状体皮质的清晰观察，但允许对晶状体前部皮质进行&#160;体内分析。对活体鱼类晶状体的成像可实现对同一动物晶状体形态的纵向研究。该技术对于研究动态过程（如渗透压或药...

斑马鱼是研究晶状体发育和生理学的优良模型，因其晶状体在解剖结构上与哺乳动物相似，且易于进行遗传学和药理学操作，胚胎期眼部发育迅速，早期阶段个体小且通体透明，便于观察 体内 成像。本文所述方法旨在分析斑马鱼在胚胎期和成体期的晶状体形态，重点关注缝合完整性及皮质膜形态 体外 和 体内以及晶状体核沿前-后轴的位置 离体这些方法可作为研究晶状体发育与生理功能的起点，也可用于斑马鱼晶状体表型的反向遗传学筛选。
斑马鱼晶状体形态成像
水通道蛋白0（AQP0）是晶状体膜中最丰富的蛋白质，在哺乳动物中对晶状体的发育和透明性具有关键作用，因其具备多种重要功能。斑马鱼具有两种Aqp0（Aqp0a和Aqp0b），我们已建立了在胚胎期和成体晶状体中分析其功能缺失的方法。我们的研究表明 aqp0a-/- 突变体由于前极缝合线不稳定而出现前极混浊， aqp0a/b 双突变体出现核不透明现象1AQP0 已被证明在水运输中发挥作用2黏附3,4细胞骨架锚定5 以及折射率梯度的生成6，但这些研究在很大程度上是进行的 体外斑马鱼为研究Aqp0a或Aqp0b功能缺失或功能紊乱如何影响活体晶状体的形态与功能提供了独特的机会。为评估发育过程中晶状体细胞的形态及缝合结构的完整性，我们对现有方法进行了改进 体外 免疫组织化学方法7 用于胚胎和成年晶状体，并构建转基因模型以监测该过程 体内.
对固定后的完整胚胎和成年晶状体进行了血浆膜结构和缝合完整性的免疫组织化学分析。与哺乳动物相比，斑马鱼晶状体极小（胚胎期晶状体直径约为100 µm，成年期可达1 mm），具有点状缝合8，这在冷冻切片中很少能观察到。因此，完整晶状体对于分析缝合完整性至关重要。对于 体内 通过分析前部缝合线的形成以及精确的晶状体细胞结构成像，我们构建了转基因品系，特异性表达标记晶状体膜的 mApple。
活体成像晶状体膜转基因模型的优势包括：1）避免固定所导致的人工假象；2）通过延时录像研究动态形态变化；3）实现纵向研究，将早期事件与后期表型相关联。虹膜的色素沉着通常会阻碍对晶状体周边区域的清晰成像。在原始-5（prim-5）阶段之前添加1-苯基-2-硫脲（PTU）9 可抑制黑色素生成及眼睛色素沉着，直至受精后约4天（dpf）。然而，4 dpf后，晶状体周边区域变得模糊 体内尤其是发育较晚阶段。此外，晶状体本身的密度会阻碍对其后极部的成像。因此，若要在4 dpf后研究晶状体周边部或后部缝合结构的形态，需要将晶状体切除并固定。
转基因斑马鱼品系已被用于在活体中分析晶状体膜结构in vivo10。 转基因品系Q01在晶状体纤维细胞中广泛表达一种与膜靶向序列Gap43融合的青色荧光蛋白，该表达由EF1α启动子及DF4 pax6增强子元件的六聚体驱动11。Q01在晶状体外也有表达，包括视网膜中的无长突细胞，这会在研究重点为晶状体时引入背景信号。我们开发了一种新型转基因品系，可在晶状体中特异性表达膜锚定型mApple，旨在避免任何晶状体外信号的干扰。
晶状体核定位
我们发现，在斑马鱼幼体中，晶状体核最初位于前部位置，而在成体晶状体的前后轴上则移至中心位置。这种高折射率晶状体核位置的改变被认为对斑马鱼晶状体光学特性的正常发育至关重要1。我们的方法可实现对晶状体核中心化程度相对于晶状体半径的量化分析。利用该方法，我们证明了Aqp0a在晶状体核中心化过程中是必需的1，且这一简单方法可广泛应用于斑马鱼模型中晶状体发育、生理及其光学特性相关研究。

<table><tbody><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>警告 &amp;ndash; 剧毒</td></tr><tr><td>4% 甲醛水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 157-4</td><td>警告 &amp;ndash; 有害健康，可燃</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>物镜和腔室温度设定为 -21 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>警告 &amp;ndash; 对眼睛和皮肤有刺激性</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>警告 &amp;ndash; 可燃，可穿透皮肤&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>一次性底模</td><td>VWR Scientific</td><td>15154-631</td><td></td></tr><tr><td>一次性巴斯德玻璃移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Dumont &amp;amp; Fils</td><td></td><td>保持镊子锋利</td></tr><tr><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>警告 - 有毒</td></tr><tr><td>玻璃底微孔培养皿（35 mm 培养皿，14 mm 微孔，#1.5 盖玻片）</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>hu&amp;beta;B1cry:mAppleCAAX DNA 构建体</td><td>Addgene</td><td>ID:122451</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Wayne Rasband, NIH</td><td>v1.51n</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖（LMA）</td><td>Apex</td><td>902-36-6</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td>V 4.5</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus&amp;nbsp; 配备型号为 2.1.1.183 的控制器</td><td>Olympus Corp</td><td>DP70</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus Corp</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-Alexa Flour 546</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22283</td><td></td></tr><tr><td>酚红指示剂（1% w/v）</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>5725-16</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS5 v12.0</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop 软件</td><td>Adobe</td><td>CS5 v12.0</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 60x/1.2 WD 物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>MTr 22</td><td>或同等电源&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>载片加热器型号 No. 26020FS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-594</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>Fisher Scientific</td><td>S612-3</td><td>警告 - 具腐蚀性/对眼睛和皮肤有刺激性，靶器官 - 呼吸系统，对金属具腐蚀性</td></tr><tr><td>Superfrost/Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅胶（Dow Corning）</td><td>World Prevision Instruments</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>警告 &amp;ndash; 有毒，对水生环境有害，具腐蚀性</td></tr><tr><td>Vannas 显微解剖剪</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1346</td><td>尖端锋利/直头</td></tr><tr><td>Vectashield 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>麦胚凝集素（WGA）-Alexa Flour-594</td><td>Life Technologies</td><td>W11262</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼晶状体核定位及缝合完整性的评估

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

斑马鱼特别适合进行遗传操作 体内 成像，使其成为反向遗传学研究和转基因品系构建中日益流行的模型 体内 成像。这些独特优势使斑马鱼成为研究眼晶状体发育与生理学的理想平台。我们近期发现，水通道蛋白-0（Aqp0a）对于维持晶状体前缝的稳定性以及随着年龄增长晶状体核向中心迁移具有重要作用，这一发现促使我们开发出专门适用于分析斑马鱼晶状体特性的工具。本文概述了适用于幼体和成体晶状体的详细解剖方法，以制备用于组织学分析、免疫组织化学和成像的样本。我们重点分析晶状体缝合完整性及皮质细胞形态，并将解剖所得晶状体的数据与通过其他方法获取的数据进行比较 体内 利用一种携带基因编码荧光标记的新型转基因斑马鱼品系实现晶状体形态的成像。通过沿晶状体光轴垂直方向对分离的晶状体进行分析，可量化晶状体核沿前后轴的相对位置。在成年斑马鱼中，晶状体核需从初始的前部位置移至中心，以实现正常的晶状体光学功能。因此，对晶状体核位置的定量测量可直接反映其光学特性。

成年斑马鱼的眼睛解剖结构与哺乳动物高度相似（图1A）。尽管斑马鱼与哺乳动物的眼睛存在一些差异，例如具有睫状区而非睫状体17、光学特性不同18以及胚胎发育过程中形态发生方式的差异19，斑马鱼眼仍是研究眼部发育和理解眼病的优秀模型20,21,22。一层简单的上皮组织覆盖晶状体的前极，在赤道处该上皮终生经历增殖、伸长并分化为晶状体纤维细胞，构成晶状体的主体部分。成熟的纤维细胞（图1B，浅蓝色）最早在胚胎期分化形成，无细胞器且终生不再更新。正在分化的纤维细胞尖端在晶状体两极相遇，形成前极和后极缝线。随后，新分化的纤维细胞将这些细胞向内包...

这些实验方案旨在分析斑马鱼晶状体的皮质形态、固定和活体晶状体缝合结构的完整性，并测量斑马鱼晶状体核沿前-后轴的位置。

斑马鱼特别适合进行遗传操作和活体成像，因此作为反向遗传学研究的模型正变得越来越受欢迎，并用于……

我们的实验方案为晶状体发育与生理功能研究以及斑马鱼晶状体表型的反向遗传学筛选提供了起点。这些方案整合了斑马鱼晶状体膜形态的体外与体内分析，并提供了一种新颖且简便的方法，用于量化斑马鱼晶状体光学特性的发育过程。对斑马鱼晶状体形态学和光学特性的分析有助于深入理解调控晶状体发育、正常生理功能及病理生理机制。这些发现反过来可能有助于延缓或预防白内障。除斑马鱼外，尚未有关于晶状体细胞核不对称定位的其他物种报道。准确识别晶状体缝合线对于正确确定晶状体方向以测量细胞核定位至关重要。在确认使用Tricaine达到充分麻醉后，立即用显微解剖剪从成年或幼年斑马鱼中摘除双眼，并将两眼置于盛有PBS的35毫米定制培养皿中，培养皿底部含硅胶解剖模具。若要从成年斑马鱼中分离晶状体，将眼球后极朝上放置，以小于45度的角度用镊子从视盘处插入。使用解剖剪在固定的眼球上从视盘向睫状区在视网膜和巩膜上做两到三个放射状切口，然后像剥开花瓣一样掀开视网膜和巩膜。将眼球翻转，角膜朝上，用剪刀的平边通过镊子牵拉视网膜及附着组织，间接固定晶状体，同时操作巩膜和角膜，然后小心修剪掉晶状体周围的多余组织。对于幼年斑马鱼晶状体的采集，将幼鱼眼球后极朝上置于含PBS的硅胶培养皿的平面上，用 sharpened 钨针在另一根针或镊子固定眼球的同时，对视网膜和巩膜进行放射状切割，然后用自制钨丝针的钝端轻轻将晶状体从解离的眼球中舀出，并小心剥离附着的组织。为测量晶状体前后轴核的定位，将新鲜摘除的晶状体置于底部为盖玻片的35毫米培养皿中的PBS内，使其轴向排列，两极和缝合线与焦平面平行。为了识别晶状体核，需观察折射率的差异，这种差异通常出现在晶状体皮质与晶状体核的交界处。如果晶状体缝合线不明显，可用镊子轻轻触碰晶状体囊膜，以显露缝合线和晶状体核，从而帮助确定晶状体的方向以便测量。将培养皿置于配备相机的解剖显微镜载物台上，在明场照明或微分干涉对比光学条件下对晶状体成像，并确保晶状体核处于焦点清晰的位置。在相同放大倍数下对显微测微尺成像以进行校准，并点击“实时预览”。点击“快照”获取图像，并将图像保存为 TIFF 文件。为校准所获得的镜头图像，在合适的图像处理软件程序中，选择直线工具并在显微测微尺图像上绘制一条已知长度的直线。单击“分析”菜单中的“设置比例尺”，输入已知距离及单位，然后选择“全局校准”并单击“确定”。要测量晶状体核中心到前极之间的距离，首先确定晶状体缝合线的位置，使用直线工具在晶状体核成像中心沿轴向绘制一条直线，该直线的中点即为晶状体核的中心。从该点再绘制另一条直线至晶状体的前极，然后在“分析”菜单中选择“测量”，以获取该距离的数值。从晶状体前极画另一条线至后极，并测量此距离作为晶状体直径，然后将这些长度从结果窗口复制到电子表格中，计算晶状体核相对于晶状体半径的归一化定位。受精后三天，前缝在晶状体前极形成，通过鬼笔环肽对固定胚胎中狭窄的晶状体纤维细胞膜进行染色，可清晰观察到细胞的显著汇聚现象。在晶状体膜定位的mApple转基因中，宽纤维细胞的标记更强，可实现膜亚区域的活体可视化，但缺乏缝合处的汇聚特征。在受精后三天，可在体外和体内观察到后部缝合线。在赤道平面上，鬼笔环肽强烈标记外层皮质纤维细胞，显示出扁平的六边形形态。鬼笔环肽不标记致密的晶状体核，野生型与突变型晶状体看起来无明显差异。在晶状体膜定位的 mApple 镶嵌转基因小鼠中，宽大纤维细胞的强标记揭示了突变晶状体内部细胞体积的紊乱。由于转基因表达不受通透性限制，部分镶嵌体显示出晶状体核的标记。在野生型动物中，晶状体核在发育早期更靠近晶状体前极，随后在成年期逐渐居中。在细胞膜发红色荧光的转基因宿主中表达绿色标记蛋白，可同时实现蛋白定位以及活体状态下晶状体纤维细胞形态的评估。斑马鱼特别适合进行活体研究。利用本文所述工具，我们能够在活体系统中探究主要在体外研究过的晶状体相关机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

斑马鱼镜头核定位与功能完整性的评价

晶状体发育涉及与其他组织的相互作用。一些斑马鱼眼部突变体表现为晶状体尺寸异常偏小。本文中，我们展示了一项晶状体移植实验，以确定该表型是源于晶状体自身的内在因素，还是由于晶状体与周围组织之间相互作用缺陷所致。...

斑马鱼晶状体移植及其在眼突变体分析中的应用

理解塑造早期胚胎的形态发生过程的关键在于能够以高分辨率对细胞进行成像。本文介绍一种在完整斑马鱼胚胎中利用膜定位的绿色荧光蛋白对单个细胞或少量细胞簇进行标记的技术。...

斑马鱼后脑中细胞的标记与成像

本视频介绍了一种用于解剖成年及幼年斑马鱼晶状体的实验方案，旨在分析晶状体皮质的形态特征及其缝合结构的完整性。...

眼球晶状体解剖：一种观察斑马鱼晶状体形态的技术

斑马鱼脊髓中的增殖、模式形成、分化和轴突导向等发育过程可被便捷地建模。本文介绍一种优化斑马鱼胚胎固定的方法，以实现对这些事件的清晰可视化。...

斑马鱼胚胎的解剖与侧向封片：脊髓发育分析

斑马鱼现已成为研究肌营养不良症、先天性肌病及相关神经肌肉疾病的重要且强大的模型工具。双折射和触觉诱发逃逸行为是两种常用的非侵入性检测方法，用于评估斑马鱼胚胎在早期发育过程中肌肉结构紊乱和运动功能障碍的程度。...

通过双折射和触诱发逃逸反应检测分析斑马鱼幼虫骨骼肌缺陷

斑马鱼胚胎是发育生物学研究的理想模型。在胚胎发育过程中，斑马鱼胚胎带有卵黄团，给样本的观察与分析带来了三维结构上的挑战。本实验方案描述了如何制备整体样本的二维平面封片 原位 经 (WISH)...

用于整体染色斑马鱼胚胎标本观察与分析的平铺制备 原位 杂交

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

光片荧光显微镜是成像胚胎发育的优秀工具，能够在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间的延时成像。我们展示了其在跨越广泛时空尺度下斑马鱼眼部发育成像中的应用，并提供了一套多视角数据集融合与去卷积的处理流程。...

利用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼睛发育过程

本文介绍了一系列标准化的实验方案，用于观察新近发现的脊椎动物眼球中一种在进化上保守的结构——眼上沟。利用斑马鱼幼体，我们展示了识别参与眼上沟形成与闭合因素所必需的技术方法。...

上眼眶沟的可视化 斑马鱼 胚胎发生

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。...

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

了解斑马鱼晶状体核定位与功能完整性的评价方法，通过显微解剖和成像技术定量分析晶状体形态与核定位。该方案为研究晶状体发育机制及预防白内障提供了重要基础。

斑马鱼晶状体核定位及缝合完整性的评估

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