斑马鱼晶状体核定位及缝合完整性的评估

我们的实验方案为晶状体发育与生理功能研究以及斑马鱼晶状体表型的反向遗传学筛选提供了起点。这些方案整合了斑马鱼晶状体膜形态的体外与体内分析，并提供了一种新颖且简便的方法，用于量化斑马鱼晶状体光学特性的发育过程。对斑马鱼晶状体形态学和光学特性的分析有助于深入理解调控晶状体发育、正常生理功能及病理生理机制。

这些发现反过来可能有助于延缓或预防白内障。除斑马鱼外，尚未有关于晶状体细胞核不对称定位的其他物种报道。准确识别晶状体缝合线对于正确确定晶状体方向以测量细胞核定位至关重要。

在确认使用Tricaine达到充分麻醉后，立即用显微解剖剪从成年或幼年斑马鱼中摘除双眼，并将两眼置于盛有PBS的35毫米定制培养皿中，培养皿底部含硅胶解剖模具。若要从成年斑马鱼中分离晶状体，将眼球后极朝上放置，以小于45度的角度用镊子从视盘处插入。使用解剖剪在固定的眼球上从视盘向睫状区在视网膜和巩膜上做两到三个放射状切口，然后像剥开花瓣一样掀开视网膜和巩膜。

将眼球翻转，角膜朝上，用剪刀的平边通过镊子牵拉视网膜及附着组织，间接固定晶状体，同时操作巩膜和角膜，然后小心修剪掉晶状体周围的多余组织。对于幼年斑马鱼晶状体的采集，将幼鱼眼球后极朝上置于含PBS的硅胶培养皿的平面上，用 sharpened 钨针在另一根针或镊子固定眼球的同时，对视网膜和巩膜进行放射状切割，然后用自制钨丝针的钝端轻轻将晶状体从解离的眼球中舀出，并小心剥离附着的组织。为测量晶状体前后轴核的定位，将新鲜摘除的晶状体置于底部为盖玻片的35毫米培养皿中的PBS内，使其轴向排列，两极和缝合线与焦平面平行。

为了识别晶状体核，需观察折射率的差异，这种差异通常出现在晶状体皮质与晶状体核的交界处。如果晶状体缝合线不明显，可用镊子轻轻触碰晶状体囊膜，以显露缝合线和晶状体核，从而帮助确定晶状体的方向以便测量。将培养皿置于配备相机的解剖显微镜载物台上，在明场照明或微分干涉对比光学条件下对晶状体成像，并确保晶状体核处于焦点清晰的位置。

在相同放大倍数下对显微测微尺成像以进行校准，并点击“实时预览”。点击“快照”获取图像，并将图像保存为 TIFF 文件。为校准所获得的镜头图像，在合适的图像处理软件程序中，选择直线工具并在显微测微尺图像上绘制一条已知长度的直线。

单击“分析”菜单中的“设置比例尺”，输入已知距离及单位，然后选择“全局校准”并单击“确定”。要测量晶状体核中心到前极之间的距离，首先确定晶状体缝合线的位置，使用直线工具在晶状体核成像中心沿轴向绘制一条直线，该直线的中点即为晶状体核的中心。从该点再绘制另一条直线至晶状体的前极，然后在“分析”菜单中选择“测量”，以获取该距离的数值。

从晶状体前极画另一条线至后极，并测量此距离作为晶状体直径，然后将这些长度从结果窗口复制到电子表格中，计算晶状体核相对于晶状体半径的归一化定位。受精后三天，前缝在晶状体前极形成，通过鬼笔环肽对固定胚胎中狭窄的晶状体纤维细胞膜进行染色，可清晰观察到细胞的显著汇聚现象。在晶状体膜定位的mApple转基因中，宽纤维细胞的标记更强，可实现膜亚区域的活体可视化，但缺乏缝合处的汇聚特征。

在受精后三天，可在体外和体内观察到后部缝合线。在赤道平面上，鬼笔环肽强烈标记外层皮质纤维细胞，显示出扁平的六边形形态。鬼笔环肽不标记致密的晶状体核，野生型与突变型晶状体看起来无明显差异。

在晶状体膜定位的 mApple 镶嵌转基因小鼠中，宽大纤维细胞的强标记揭示了突变晶状体内部细胞体积的紊乱。由于转基因表达不受通透性限制，部分镶嵌体显示出晶状体核的标记。在野生型动物中，晶状体核在发育早期更靠近晶状体前极，随后在成年期逐渐居中。

在细胞膜发红色荧光的转基因宿主中表达绿色标记蛋白，可同时实现蛋白定位以及活体状态下晶状体纤维细胞形态的评估。斑马鱼特别适合进行活体研究。利用本文所述工具，我们能够在活体系统中探究主要在体外研究过的晶状体相关机制。