在Vivo脑内立体注射中，用于小鼠脑切片中远距离输入的光遗传学刺激

该协议描述了一组方法，利用外体脑切片中的光遗传学刺激，确定来自遥远大脑区域的远程输入的细胞类型特定功能连接。

这种方法的目的是利用大脑切片中的光刺激，识别来自遥远大脑区域的远距离输入的功能连接。特定大脑区域的立体轴对准，用于各种光敏感离子通道的中位表达，允许选择性地刺激来自该区域与光的轴子。演示这个程序的将是路易斯·里奇沃，一个博士生，从我小组。

手术前，验证动物是否用手趾捏麻醉良好。轻轻地拉出舌头，以方便呼吸。然后，剃颅毛。

将20微升盐酸利多基在头部皮肤下进行局部麻醉，等待5分钟。要暴露头骨，在头皮上做一个切口。然后，将动物放在立体的帧中。

插入耳条，并把它们放在骨头上稍微到耳朵的左上，并拉下皮肤，创造良好的访问头骨。拧紧耳条并安装鼻片。使用高度调整支撑，水平保持动物的身体和头部水平。

在动物下面放置一个加热垫，以保持其在生理温度。然后用棉签涂抹0.9%氯化钠去除软组织，以清洁头骨。调整头骨，使布雷格玛羔羊访问被调平。

然后，根据后部和中焦定位头骨上的注射部位，并在上面放置注射针。用一次性针头标记头骨。随后，将注射针向上移动四厘米。

使用 0.5 毫米毛刺，以最大速度的一半在标记上创建一毫米直径的颅骨切除术。如果发生出血，用纸巾擦拭。接下来，用泵将其完全弹出，将汉密尔顿注射器中所含的水排空以储存。

只有针头里装满了水。将病毒溶液解冻，然后从冰上短暂去除，然后用微管获得700纳米升溶液。接下来，在一块石蜡薄膜上存一滴。

将石蜡膜放在颅骨切除术的顶部。将针头插入病毒溶液的滴中，而不改变前柱和侧向位置。之后，使用泵的提取功能在石蜡膜上用约500纳米的病毒溶液填充注射器。

在立体镜下执行此过程，观察跌落消失，并确保不吸入任何空气。确保注射器已正确填充。通过向下驾驶柱塞测试喷射系统，以测试喷射一小滴液体。

随后，将针头插入大脑到所选深度。按下用于喷射的运行按钮。然后，慢慢取针三到五分钟。

立即用干净的蒸馏水清洗针头，将针头灌装数次，以避免堵塞。之后，将动物从立体轴框架中取下。缝合皮肤，使三或四针绑与2-1-1标准手术结。

要提取大脑，从颈部到鼻子的皮肤进行切割，然后用剪刀从头骨上切开最后一根椎骨。缩回皮肤，沿着中线切开头骨，从骨道向旋转方向。小心地取出前骨的肠骨和骨质部分。

通过插入大脑和颅地板之间，切入嗅觉球、视神经和其他颅神经和小脑，用小圆铲提取大脑。轻轻地将大脑淹没在冰冷的切割溶液中。随后，将大脑转移到滤纸上，轻轻干燥皮质表面。

将大脑皮层粘附到振动器的标本支架上，将角侧朝向刀片，以切割水平脑切片。接下来，用冰冷氧切割溶液填充切割室，使大脑完全融合。节300微米厚片与振动组的速度为07毫米/秒，在一毫米振幅。

在此阶段，建议使用荧光手电筒和相应的滤镜，简要检查三元色中的 Chronos-GFP 表达。要执行全细胞贴片夹记录，请轻轻地将包含海马复合物的大脑切片传输到记录室。连续在记录室中用 34 摄氏度 ACSF 冒泡，每分钟 2 到 3 毫升。

简要检查感兴趣区域轴端子中的 Chronos-GFP 表达式，蓝色 LED 照明的放大倍率为 4 倍。更改为 63 倍沉浸式目标并调整焦点。检查表示 Chronos-GFP 的轴星，并选择一个金字塔神经元进行修补记录。

接下来，用葡萄糖酸钾内部溶液填充移液器。将它安装在头台的移液器支架上。在电压夹配置中修补电池。

接近识别的神经元，并巧妙地按移液器尖端到索马。正压应在膜表面产生酒窝。然后，释放压力以创建一个千兆密封。

密封后，将保持电压设置为负 65 毫伏。用负压的极脉冲打破膜。记录神经元在全细胞电流夹紧模式下对超极化和去极化电流步数的反应。

记录电流或电压夹紧后对表达 Chronos 的 475 纳米 LED 全场刺激的射流光纤的射电反应。以20赫兹的10次刺激刺激，持续两毫秒。在全细胞贴片夹配置中记录了第三层中超极化和去极化电流步骤的舱前神经元的活性。

刺激 ADN 轴突终端表达 Chronos-GFP 在电流夹紧模式下在上子三主要细胞的上子层中产生兴奋性后突触电位。根据光强，EPSP 可能达到行动潜在阈值。在电压夹紧模式下也观察到突触后反应，因为引起兴奋性突触后电流。

这里展示的是一个层三金字塔神经元包围的丘脑轴子表示Chronos-GFP在超小表面层与DAPI染色图像与荧光显微镜。这张照片是在一个更高的放大倍率下用共和显微镜拍摄的。在用荧光示踪剂进行试验实验时，小心地沿轴水平水平定位，对于提高立体喷射的精度至关重要。

此过程还可用于通过注射对两种不同波长敏感的两个生成场景来研究不同区域的收敛投影。这项技术的发展使得远程大脑区域之间能够以细胞类型特定的方式进行精确的解剖和功能回路分析。