Name: 在Vivo脑内立体注射中，用于小鼠脑切片中远距离输入的光遗传学刺激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习光遗传学刺激技术，用于研究小鼠脑切片中远距离神经输入的功能连接。该方法结合立体定位注射与全细胞膜片钳记录，帮助神经科学家精确解析神经元间的突触传递机制。

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感谢 Bertrand Mathon、Mérie Nassar、Li-Wen Huang 和 Jean Simonnet 在先前版本立体定位注射方案开发过程中提供的帮助，感谢 Marin Manuel 和 Patrice Jegouzo 提供的技术支持。本研究得到了法国教育与研究部（L. R.，L. S.）、法国国家空间研究中心（M. B.）以及法国国家科研署基金项目&#160;<span lang="FR" style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ANR-18-CE92-0051-01&#160;（D. F.）的资助。

所有操作均按照欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）进行，并已获得巴黎笛卡尔大学伦理委员会的批准。实验人员必须获得相应许可，以符合当地法规要求。
1. 实验设计
<ol>
	<li>确定需要靶向的脑区。借助小鼠脑图谱15确定注射位点的立体定位坐标。对于右侧前背侧丘脑核（ADN），其坐标为：相对于前囟，后向 -0.82 mm，外侧 0.75 mm，深度 -3.2 mm。对于不同年龄、性别或品系的动物，坐标可能需要相应调整。</li>
	<li>通过在预实验中注射荧光示踪剂（150 至 300 nL），并在落射荧光显微镜下观察，验证并记录坐标准确性（图1A,B）。</li>
	<li>确定拟注射的病毒类型。按照生产商建议，将病毒以每份 6 µL 分装后保存于 -80 °C。在当天手术时，取一份置于冰上带入手术室，用于一只至六只动物的注射。腺相关病毒（AAV）的生物安全使用规范可能因国家或机构而异，可能需要在 PSM 2 级生物安全柜中操作。 
	注：本实验中使用的是 AAV2/5 血清型病毒，其在突触素（Synapsin）启动子控制下表达 Chronos——一种快速通道视紫红质-2 变体，并与绿色荧光蛋白融合：AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH。</li>
</ol>
2. 立体定位手术
<ol>
	<li>在稳定的标准实验台上安装配备泵架的立体定位仪。调整体视显微镜，以便清晰观察动物头部放置区域。使用LED光源照明。将体视显微镜旋离，以接触泵架，但手术初始步骤无需使用泵架。</li>
	<li>在泵架上安装一支带有33 G斜面金属针头的10 µL Hamilton注射器。用水测试喷出系统。</li>
	<li>通过腹腔注射盐酸氯胺酮和赛拉嗪混合物（分别为100 mg/kg和10 mg/kg）麻醉4至5周龄的C57BL6小鼠。在8.5 mL的0.9% NaCl中配制1 mL氯胺酮和0.5 mL赛拉嗪的混合液，最终浓度为混合液中含氯胺酮10 mg/mL和赛拉嗪1 mg/mL。根据动物体重，按每克体重10 µL的剂量进行腹腔注射。麻醉持续时间约为1小时。</li>
	<li>通过脚趾夹捏测试确认动物已充分麻醉。随后拉出舌头以促进呼吸，并剃除颅部毛发。</li>
	<li>在头部皮肤下注射20 µL盐酸利多卡因（4 mg/mL；2 mg/kg）以实现局部麻醉，等待5分钟起效。为防止因干燥造成眼部损伤，用眼用软膏覆盖眼睛。</li>
	<li>使用小型手术剪在头皮上做一直线切口以暴露颅骨。将动物置于立体定位仪中，将耳杆略微置于耳前位置，使其抵住骨骼并向下牵拉皮肤，从而充分暴露颅骨。固定牢固后安装鼻夹。</li>
	<li>使用高度可调的支撑物使动物身体保持与头部水平。在小鼠下方放置加热垫，以维持其生理温度。</li>
	<li>用棉签蘸取0.9% NaCl清洁颅骨，去除骨表面的软组织。后续手术步骤均在体视显微镜下进行。</li>
	<li>调整颅骨位置，使前囟-后囟轴线水平，通过上下调节鼻齿夹实现。此过程需反复测量前囟和后囟位置，因为鼻夹水平调整后两者位置均会发生变化。</li>
	<li>确定颅骨上的注射位点位置。根据前后和内外坐标将注射针调整至注射位点正上方，并用一次性针头在颅骨上做标记。然后将注射针向上移动4 cm。</li>
	<li>使用0.5 mm钻头以最大转速的一半在标记处钻出直径1 mm的颅骨开孔。如有出血，用纸巾轻轻擦拭。</li>
	<li>通过泵完全排出Hamilton注射器中用于储存的水，仅针头内仍保留少量水。&#160;每次使用后均需用纯去离子水清洗针头。无需灭菌。</li>
	<li>取出当天使用的病毒分装液。&#160;确保病毒溶液已解冻但仍保持低温（接近0 °C，置于冰上）。仅短暂从冰上取出，用微量移液器吸取700 nL小体积液体。将液滴滴加至一块5 cm × 5 cm的石蜡膜上。避免产生气泡。将剩余病毒溶液立即放回冰上。 
	注意：液滴体积应大于目标注射量（注射200 nL时取700 nL）。这可提供安全余量，以防转移过程中液体损失，并可在正式操作前进行小量测试喷出（步骤2.16）。</li>
	<li>将石蜡膜覆盖于颅骨开孔上方。将针头插入石蜡膜上的病毒溶液液滴中，保持前后和左右位置不变。</li>
	<li>使用泵的&#34;回吸"功能，在体视显微镜下从石蜡膜上的病毒溶液中吸取约500 nL至注射器内。&#160;操作时需在视觉监控下进行，观察液滴消失过程，并确保不吸入空气。</li>
	<li>确认注射器已正确填充。在视觉监控下推动推杆，测试喷出50 nL小液滴，以验证喷出系统功能正常。随后擦去液滴。</li>
	<li>通过顺时针旋转立体定位仪背腹轴控制旋钮，将针头插入脑内至预定深度。按下&#34;运行"按钮（流速15 nL/min，注射体积150 nL）。通过自动泵在10分钟内缓慢注射少量液体（50–300 nL，具体体积取决于所用病毒）。</li>
	<li>注射完成后等待10分钟，以防止注射部位液体渗漏。随后逆时针旋转背腹轴控制旋钮，在3–5分钟内缓慢拔出针头。&#160;</li>
	<li>将立体定位仪的垂直部分连同注射器一起从动物上方旋开。立即用洁净的蒸馏水反复抽吸清洗针头数次，以防堵塞。将注射器注满水后储存。</li>
	<li>将小鼠从立体定位仪中取出。使用4-0聚酰胺缝合线缝合皮肤，打三到四个结，每个结采用2-1-1标准外科结。</li>
	<li>将小鼠置于加热笼中直至完全从麻醉中苏醒，并在平放于地面的培养皿中提供水和泡软的食物。若热源位于笼子下方，应使用隔栅避免过热。&#160; 
	注意：根据当地指南，可皮下注射单次剂量的酮洛芬（2–5 mg/kg）或丁丙诺啡（0.05–0.1 mg/kg）以预防疼痛。</li>
	<li>当动物完全清醒后，将其放回原饲养笼，并监测其健康状况，尤其关注注射后次日的表现。检查是否存在疼痛迹象。若观察到任何行为改变，应对动物称重以监测体重变化。</li>
	<li>根据所用病毒的不同，完全表达所需时间可能有所差异。本实验中，AAV5.Syn.Chronos-GFP的表达时间设定为3周。</li>
</ol>
3. 急性脑片记录和固定的溶液配制
<ol>
	<li>在电生理实验前，使用纯去离子水配制10倍浓缩的切割溶液（125 mM NaCl、25 mM 蔗糖、2.5 mM KCl、25 mM NaHCO3、1.25 mM NaH2PO4 和 2.5 mM D-葡萄糖）和人工脑脊液（ACSF）溶液（124 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、1 mM NaH2PO4 和 11 mM D-葡萄糖）。将这些溶液储存在不含 CaCl2 和 MgCl2 的1 L瓶中，置于4 °C保存。</li>
	<li>实验当天，将切割溶液和ACSF的储备液分别按10倍稀释至终体积各0.5 L。使用磁力搅拌器搅拌，并通过通入95%/5% O2/CO2进行氧合。加入二价离子，使切割溶液中CaCl2终浓度为0.1 mM、MgCl2终浓度为7 mM，ACSF中CaCl2和MgCl2终浓度均为2 mM。</li>
	<li>配制基于葡糖酸钾的移液管溶液，成分如下：135 mM K-葡糖酸盐、1.2 mM KCl、10 mM HEPES、0.2 mM EGTA、2 mM MgCl2、4 mM MgATP、0.4 mM Tris-GTP、10 mM Na2-磷酸肌酸，以及用于事后细胞形态学鉴定的2.7–7.1 mM 生物胞素。调节溶液pH至7.3，渗透压至290 mOsm。分装成1 mL等份，于-20 °C保存。</li>
	<li>将BupH PBS干粉袋溶于500 mL蒸馏水中，配制成0.1 M PBS溶液，终浓度为0.1 M磷酸钠、0.15 M NaCl，pH 7.2。</li>
	<li>配制1 L 4% PFA溶液时，将111 mL 36%液态PFA和90 mL 10x PBS溶液加入蒸馏水中稀释至1 L。</li>
	<li>在500 mL 0.1 M PBS中加入150 g蔗糖，配制成30%蔗糖溶液。</li>
</ol>
4. 脑切片的制备
<ol>
	<li>灌流前，在实验台面上铺好吸水纸以准备操作区域。</li>
	<li>安装一个距离实验台约1米高的滴注装置，用于重力驱动的灌流，并连接一个24 G的蝶形针头。</li>
	<li>将振动切片机的切削室周围放置冰块，并将其存放在冰箱中冷却。</li>
	<li>使用与手术时相同的氯胺酮-赛拉嗪混合物，通过腹腔注射麻醉小鼠。用镊子夹捏脚趾以评估麻醉程度。当小鼠完全失去知觉后，腹腔注射100 µL肝素（5000 U.I./mL）。</li>
	<li>用胶带将动物固定在吸水纸上，使其仰卧。用小剪刀从膈肌向上剪开左右两侧肋骨，打开胸腔。借助胶带保持胸腔处于开放状态。</li>
	<li>用止血钳夹闭降主动脉，并通过左心室进行灌流，灌流液为4 °C预冷并通氧（95%/5% O2/CO2）的切片液，通过24 G蝶形针头注入。灌流5秒后，用小剪刀剪开右心房。</li>
	<li>持续灌流5分钟后，当器官已无血液残留时，停止灌流。用大剪刀剪下动物头部，并将头浸入盛有4 °C预冷且通氧切片液的培养皿中。</li>
	<li>为取出大脑，从颈部向鼻部剪开皮肤，然后用剪刀切断颅骨与最后几节颈椎的连接。手动向后剥离皮肤，使用小剪刀沿中线从尾侧向头侧剪开颅骨，直至两眼之间上方。</li>
	<li>使用弯头镊或骨钳小心移除顶骨及额骨的尾侧部分。用小型圆头刮匙插入脑组织与颅底之间，分离嗅球、视神经及其他脑神经和小脑，从而完整取出大脑。</li>
	<li>将大脑轻轻浸入盛有冰冻切片液（4 °C）的烧杯中。将大脑置于滤纸上，轻柔吸干皮层表面。将大脑皮层朝下粘附于振动切片机的样品托上，尾侧朝向刀片，以便切割水平脑片。</li>
	<li>向切削室中加入冰冻且通氧的切片液，确保大脑完全浸没。在左侧半球（与注射侧对侧）进行一次初步切割，以避免切片时出现左右混淆。 
	注意：切片液必须持续通氧，并避免切片暴露于光照下。</li>
	<li>使用振动切片机以0.07 mm/s的速度、1 mm振幅切割300 µm厚的脑片。在此阶段，建议使用荧光手电筒（440–460 nm）配合相应滤光眼镜（500 nm长通滤光片），快速检查丘脑中Chronos-GFP的表达情况。</li>
	<li>用手术刀分离海马区，并将其转移至置于烧杯中的孵育 chamber 内，烧杯中盛有预热至34 °C、并持续通氧（95%/5% O2/CO2）的人工脑脊液（ACSF）。</li>
	<li>15分钟后，将 chamber 从加热水浴中取出，让脑片在室温下继续通氧静置至少45分钟，之后即可用于实验。</li>
</ol>
5. 全细胞膜片钳记录
<ol>
	<li>使用自制的玻璃转移移液管，将含有海马复合体的脑切片轻轻转移至直立显微镜上的记录室。转移移液管由截短的巴斯德移液管（内径 6.5 mm）连接橡胶吸头制成。持续用 34 °C（预热）的 ACSF 灌流记录室（3 mL），ACSF 以 95%/5% O2/CO2 气体饱和。将蠕动泵流速设定为 2–3 mL/min。</li>
	<li>使用蓝光 LED（470 nm）照射，短暂观察目标区域轴突末梢中 Chronos-GFP 的表达情况，并用 4 倍物镜进行观察。通过合适的发射滤光片观察 GFP 荧光信号，并由 CCD 相机将图像显示在计算机屏幕上。</li>
	<li>将由 U 形铂丝制成、带有紧密排列尼龙丝线的切片固定器（&#34;harp&#34;）放置在切片上，以固定切片位置。</li>
	<li>切换至 63 倍浸液物镜并调节焦距。检查表达 Chronos-GFP 的轴突，并选择一个锥体神经元进行膜片钳记录。</li>
	<li>将物镜向上移动。</li>
	<li>使用布朗-弗莱明电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管拉制移液管。拉制仪设定为制备尖端直径约 1 μm 的移液管。用基于 K-葡萄糖酸的内液填充移液管。</li>
	<li>将移液管安装在显微操纵器的移液管夹持器上。将移液管下放至记录室中，并在物镜下找到其尖端。移液管电阻应在 3–8 MΩ 之间。使用注射器施加轻微正压，使溶液从移液管尖端形成锥形流出，随后逐步降低移液管和物镜至切片表面。</li>
	<li>在电压钳模式下进行细胞封接：接近已识别的神经元，并轻柔地将移液管尖端压在胞体上。正压应在膜表面形成凹陷。释放压力以形成吉欧姆封接（&#62;1 GΩ 电阻）。封接成功后，将钳制电压设为 -65 mV。通过施加短暂的负压脉冲击穿膜：可通过向连接移液管夹持器的管道施加强力抽吸实现。</li>
	<li>在全细胞电流钳模式下记录神经元对超极化和去极化电流阶跃的反应（图 2A）。 
	注：本方案用于测定细胞的主动与被动内在电生理特性。离线分析使用自行编写的 MATLAB 程序进行10,16。</li>
	<li>记录传入纤维表达 Chronos 时，在全视野 475 nm LED 刺激下产生的电流钳或电压钳突触后反应。以 20 Hz 频率施加 10 次、每次持续 2 ms 的刺激脉冲（图 2B,C）。光强可在 0.1–2 mW 范围内调整。 
	注：光强使用配备光电二极管传感器的数字手持式光功率计测量，传感器置于物镜下方。2–4 ms 的反应潜伏期是单突触连接的典型特征。</li>
	<li>为探究长程传入纤维与记录神经元之间突触传递的性质，可使用不同的药理学试剂。为在药理学上区分直接的单突触反应与通过网络激活产生的间接反应，可在 ACSF 中加入 1 µM TTX 和 100 µM 4-AP。 
	注：浴式施加谷氨酸受体阻断剂可确定所释放神经递质的性质及突触后受体的类型。例如，AMPA 型谷氨酸受体可被 NBQX（10 µM）阻断，NMDA 受体可被 APV（100 µM）阻断。根据研究目的，可设计实验方案以探究突触反应的电压依赖性或随时间变化的反应动力学。</li>
	<li>用原始 ACSF 溶液冲洗后用于封接另一个细胞，或将含有生物胞素标记神经元的切片转移至装有 4% PFA 的小瓶中。</li>
	<li>在 4% PFA 中固定过夜后，用 0.1 M PBS 洗涤切片（2 次，每次 5 分钟；1 次，20 分钟）。</li>
	<li>在 30% 蔗糖溶液中 4 °C 保存。</li>
</ol>
6. 生物胞素显影
<ol>
	<li>将含有生物胞素标记神经元的固定脑片转移至玻璃刀片上的一滴30%蔗糖溶液中，并进行三次冻融循环：将刀片置于装有干冰的泡沫盒中1分钟，直至蔗糖液滴完全冻结，然后将刀片紧贴手掌加热以融化。</li>
	<li>用0.1 M PBS轻轻振荡清洗脑片3次（前两次各5分钟，第三次1小时50分钟）。最后一次清洗不得超过2小时。</li>
	<li>在室温下，将脑片置于含2%脱脂奶粉（20 mL中加入0.4 g）以封闭非特异性结合位点，以及0.5% Triton X-100（20 mL中加入0.1 mL）以通透细胞膜的0.1 M PBS缓冲液中，振荡预孵育2小时。</li>
	<li>在4 °C下，于含2%脱脂奶粉、1% Triton X-100、链霉亲和素-Cy5偶联物（1:500）和DAPI（1:1000）的0.1 M PBS溶液中避光振荡孵育过夜。</li>
	<li>用0.1 M PBS清洗脑片三次（前两次各5分钟，第三次2小时）。最后一次清洗可延长至4小时，以降低背景染色。</li>
	<li>在封片前，使用落射荧光显微镜在10倍物镜下，设置为观察Cy5荧光标记，通过盛有PBS的载片腔室确定脑片中标记细胞所在的一面。</li>
	<li>将脑片转移至刀片上，确保细胞面朝上，用滤纸轻轻吸干，然后使用高抗性封片介质进行封片。</li>
	<li>使用落射荧光显微镜在10倍物镜下，分别设置为Cy5和DAPI通道观察细胞体位置，设置为GFP通道观察标记的传入纤维；或使用20倍物镜的高分辨率共聚焦显微镜观察细胞体、轴突和树突的精细形态（图2D,E）。滤光片设置详见材料表。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

在活体动物中通过病毒注射在特定脑区表达光敏感视蛋白，是研究长距离功能连接性的常用光遗传学方法10,11,17,18。立体定位注射可实现对脑内特定区域的精确定位。将视蛋白与荧光报告基因共表达，可方便地评估表达是否成功，并确认注射位点的准确性。使用AAV血清型2/5通常可将表达限制在目标脑区内。通过该方法，可使特定神经元群体被转染，使其胞体和轴突末梢表达光敏感离子通道。在后续的离体脑片实验中，可在其投射靶区直接用光脉冲刺激这些轴突末梢，同时通过膜片钳记录突触后连接神经元的电活动，以检测突触传递是否成功。上述方案稳定且便捷，以下补充说明有助于实验的顺利实施。
可使用不同类型的麻醉方法。本文描述的是腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪混合物，这是一种易于使用、持续时间较短且具有便捷镇痛效果的麻醉方式19...

确定脑区之间的连接性对于理解神经回路至关重要。经典的解剖示踪方法可用于建立脑区间连接，而损毁研究有助于理解信息传递的层级结构。例如，空间定向和头方向信号的脑回路涉及信息从丘脑向压后皮层的定向传递。这一结论已通过前背侧丘脑核团（ADN）的损毁研究得到证实：损毁ADN会导致下游的背侧压后皮层中的头方向信号以及旁海马区网格细胞信号减弱1,2。
在细胞和亚细胞水平上确定脑区之间的功能连接更为困难。在海马中，由于其高度有序的解剖结构，可通过脑片制备中的电刺激来研究特定通路的突触连接。将刺激电极放置在CA1区的辐射层（stratum radiatum）可特异性地刺激来自CA3的Schaffer侧支输入3。将刺激电极放置在CA1区的 lacunosum moleculare 层则可激活投射至CA1的穿通通路输入4,5。电刺激可引发轴突末梢的神经递质释放；然而，它同时也会激活刺激位点附近的胞体以及途经的轴突。因此，当不同起源脑区的纤维在靶区结构中相互混杂时（如新皮层中通常所见），电刺激在研究特定脑区传入纤维方面具有局限性。
神经元也可以通过光进行刺激。光学方法包括笼锁型谷氨酸的光解激活，该方法可与单光子或双光子激光扫描结合使用。可在组织上依次刺激多个相邻位点，且不会对组织造成机械损伤6。该技术已成功用于突触受体的定位以及单个神经元的激活7。尽管谷氨酸光解技术可用于局部环路分析，但它无法特异性地激活长程输入通路。
研究神经回路中长程连接性的首选方法之一是利用病毒介导的通道视紫红质表达。通过体内立体定位注射（如本文所述），可将光敏离子通道的表达靶向并空间限制于特定脑区。通过这种方法，通道视紫红质可用于绘制从某一脑区到其靶区的兴奋性或抑制性连接图谱。在脑切片标本中，可利用光刺激转染的轴突末梢，通过膜片钳记录作为读出手段，从而检测脑内特定回路组分的功能与连接强度8。光遗传学方法结合病毒的立体定位注射，提供了前所未有的特异性和遗传控制能力9。光刺激还兼具高时间与高空间精度10,11。
内嗅下区是位于海马体与旁海马结构交界处的一个六层皮质结构12,13。它接收来自前背侧核（ADN）的重要突触输入11，同时也接收来自多个其他皮质及皮质下区域的输入14。因此，在内嗅下区脑片中，无法通过电刺激或谷氨酸解笼技术实现对丘脑轴突末梢的选择性刺激。本实验方案描述了利用表达光敏通道的病毒载体进行精确立体定位注射，以研究脑区之间（ADN 与内嗅下区）功能性连接的方法。同时，还描述了在脑片标本中，对投射神经元在其靶区的轴突末梢进行光刺激，并结合对突触后神经元进行全细胞膜片钳记录的技术。

<table><tbody><tr><td>0.5 mm 钻头&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>724962</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>1701 RN - 7653-01</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS 溶液</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9624</td><td>&amp;nbsp;文本</td></tr><tr><td>36% PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>470 nm LED&amp;nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>P1105/470/LED&amp;nbsp; DC/59022m</td><td>需配合匹配的激发滤光片 470/40x&amp;nbsp; 和 GFP 发射滤光片&amp;nbsp; 使用</td></tr><tr><td>AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-5-PV3446</td><td>批次 V6026R，qTiter GC/ml 4.912e12，ddTiter GC/ml 2.456e13&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>所有化学品</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浴槽温度控制器</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>SM7</td><td>设定为 34&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>斜面金属针头</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 号规格，13 mm，尖端类型 4-20&amp;deg;</td></tr><tr><td>大剪刀</td><td>Dahle Allround</td><td>50038</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td>终浓度 1–3 mg/ml</td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150-10</td><td>外径 1.5 mm，内径 0.86 mm</td></tr><tr><td>Brown-Flaming 电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>BupH 磷酸盐缓冲液粉剂</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td>灌注用蝶形针</td><td>Braun&amp;nbsp;</td><td>Venofix A</td><td>24G</td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Andor&amp;nbsp;</td><td>DL-604M</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td>20X</td></tr><tr><td>弯镊</td><td>FST&amp;nbsp;</td><td>11011-17</td><td></td></tr><tr><td>CY5 配置（共聚焦）</td><td></td><td></td><td>氦氖 633 nm（5.0 mW）激光器；镜片：MBS 488/561/633&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CY5 配置（落射荧光）</td><td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>荧光光源（Intensilight）；激发滤光片：BP645/30；二向色镜：89100 BS；发射滤光片：BP705/72</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 配置（落射荧光）</td><td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>荧光光源（Intensilight）；滤光立方体：Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO（激发：BP 377/50；镜片：BS 409；发射：BP 447/60）</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字手持式光度计</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>设定于 475 nm</td></tr><tr><td>双刃不锈钢剃刀刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td>在切片机中使用刀片的一半</td></tr><tr><td>双荧光蛋白手电筒</td><td>Nightsea</td><td>DFP-1</td><td>激发波长 440–460 nm；眼镜上的发射滤光片为 500 nm 长通滤光片</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4368</td><td>终浓度 0.2 mM</td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE-2000E</td><td>10 或 20X</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Ruby 10%</td><td>Millipore</td><td>AG335</td><td>将 10 mg 溶于 100 &amp;micro;L 蒸馏水中；注射 150 至 300 nl</td></tr><tr><td>GFP 配置（落射荧光）</td><td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>荧光光源（Intensilight）；滤光立方体：Nikon B-2E/C FITC 滤光片组（激发：BP 465–495；镜片：BS 505；发射：BP 515–555）</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Physitemp</td><td>HP4M</td><td></td></tr><tr><td>肝素 Choay 5000 U.I./ml</td><td>Sanofi</td><td></td><td>5 ml 小瓶</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>终浓度 10 mM</td></tr><tr><td>高速旋转微型电机套件</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>最大钻速 38,000 rpm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞内液成分：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>隔离式脉冲刺激器</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>终浓度 1.2 mM</td></tr><tr><td>氯胺酮 1000</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凯托芬 10%</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml：将 1 &amp;micro;L 稀释至总体积 1 ml（0.1%）</td></tr><tr><td>利多卡因（Lidocaine）</td><td>MSD</td><td></td><td>16.22 mg/ml：将 1 ml 稀释至总体积 4 ml（约 4%）</td></tr><tr><td>手术用高功率 LED 聚光灯</td><td>Photonic（通过 Phymep）</td><td>10044</td><td></td></tr><tr><td>LED 电源</td><td>Cairn Research</td><td>OptoLED Light Source</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>SM-7</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP 2H2O</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>终浓度 4 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>63069</td><td>终浓度 2 mM</td></tr><tr><td>微型温度控制器</td><td>Physitemp</td><td>MTC-1</td><td></td></tr><tr><td>奶粉</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸钠</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>终浓度 10 mM</td></tr><tr><td>Na3-GTP 2H2O</td><td>Sigma</td><td>G9002</td><td>终浓度 0.4 mM</td></tr><tr><td>持针器/止血钳</td><td>FST</td><td>13005-14</td><td></td></tr><tr><td>pClamp 数据采集软件</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>显示屏设置为 14–16，对应流速 2–3 ml/min&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钾（K-葡萄糖酸盐）</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td>终浓度 135 mM</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36390</td><td></td></tr><tr><td>隆朋 2%（赛拉嗪）</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小剪刀</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠溶液&amp;nbsp;</td><td>Virbac</td><td></td><td>将 8.5 mL 稀释至总体积 10 ml</td></tr><tr><td>VISISCOPE SZT 体视显微镜</td><td>VWR</td><td>630-1584</td><td></td></tr><tr><td>带数字显示的立体定位仪</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td>小型动物立体定位装置</td></tr><tr><td>链霉亲和素-Cy3 偶联物</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>434315</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-Cy5 偶联物</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 超级胶水3</td><td>Dutscher</td><td>999227</td><td>1 g 管装</td></tr><tr><td>缝合线 Ethilon II 4-0 聚酰胺</td><td>Ethicon</td><td>F3210</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>kdScientific</td><td>Legato 130 - 788130</td><td>使用“推注”和“回吸”模式</td></tr><tr><td>组织切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>速度 0.07，振幅 1。</td></tr><tr><td>管路</td><td>Gilson</td><td>F117942, F117946</td><td>黄/黑，紫/黑</td></tr><tr><td>直立显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td></td></tr><tr><td>Versi-dry 实验台吸水纸</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在体小鼠脑切片中长程投射通路的光遗传学刺激：颅内立体定位注射方法

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

了解特定细胞类型的突触连接性是理解全脑神经元回路的关键前提。要对长距离连接进行功能研究，需要对单个神经元进行靶向记录，同时特异性地刺激已知的远端输入。使用传统的化学或电刺激技术通常难以实现这一目标，因为来自上游多个脑区的轴突可能在目标区域相互混杂。通过立体定位技术靶向特定脑区，利用病毒介导的方式在该区域表达光敏感离子通道，即可通过光照选择性地激活起源于该区域的轴突。脑内立体定位注射不仅可用于结构界限清晰的脑区（如丘脑前核），也可应用于全脑其他皮层下或皮层区域。
本文介绍了一套在小鼠脑内精确进行立体定位注射表达光敏通道蛋白的病毒载体的技术，随后在脑片标本中对轴突末梢进行光刺激。这些实验方案简单且具有广泛适用性。结合对突触后连接神经元的全细胞膜片钳记录，光刺激轴突可实现对功能性突触连接的检测、药理学表征及其连接强度的评估。此外，还可利用生物胞素对记录的神经元进行填充，以在事后对突触后神经元进行形态学鉴定。

本实验采用顺行性腺相关病毒，通过立体定位注射在丘脑前背核（ADN）中表达一种对蓝光敏感的通道视紫红质（Chronos）与GFP的融合蛋白。立体定位坐标根据小鼠脑图谱确定，并通过注射200 nL荧光示踪剂Fluoro-Ruby进行验证。注射后10分钟处死动物，取出脑组织并固定过夜。制备冠状脑切片以检查注射位点，结果显示注射位置准确且局限于ADN内（图1A,B）。
为了在ADN神经元中表达Chronos-GFP，我们注射了300 nL的AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH。注射后三周，制备急性水平脑切片。图1C显示了包含右侧半球丘脑注射位点的脑切片，其中GFP表达呈绿色。使用配备4倍物镜的落射荧光显微镜观察时，在前下托区域可见GFP标记的丘脑轴突（图1C,D）。值得注意的是，丘脑轴突密集...

本方案描述了一组利用离体脑片中的光遗传学刺激，鉴定来自远端脑区的长程输入的细胞类型特异性功能连接的方法。

了解特定细胞类型的突触连接性是理解全脑神经元回路的关键前提。其功能……

本方法旨在利用脑切片中的光刺激技术，鉴定来自远端脑区的长程输入的功能性连接。通过立体定位技术靶向特定脑区，实现光敏感离子通道的多种介导表达，从而能够用光选择性地刺激来自该脑区的轴突。本次实验操作将由我课题组的博士研究生 Louis Richevaux 演示。手术前，通过脚趾夹捏确认动物是否已充分麻醉。轻轻拉出其舌头以促进呼吸。然后，剃除颅部的毛发。在头部皮肤下注射20微升盐酸利多卡因以进行局部麻醉，并等待五分钟。为暴露颅骨，需在头皮上做一个切口。然后，将动物置于立体定位仪中。插入耳杆，将其置于耳部稍前方的骨骼上，并向下牵拉皮肤，以充分暴露颅骨。拧紧耳杆并安装鼻夹。使用可调节高度的支撑物，保持动物身体水平，并与头部处于同一高度。在动物身下放置加热垫，以维持其生理温度。然后用棉签蘸取0.9%氯化钠溶液清洁颅骨，去除软组织。调整颅骨位置，使前囟-后囟连线水平。然后，根据后部和内侧坐标在颅骨上确定注射位点，并将注射针置于其上方。使用一次性针头在颅骨上做标记。随后，将注射针向上移动4厘米。使用0.5毫米钻头，在标记处以最大转速的一半进行直径为1毫米的颅骨开孔。如有出血，用棉片擦拭。接下来，通过泵将Hamilton注射器中储存的水完全排出。仅针头内充满水。将待注射的病毒溶液在冰上解冻，随后短暂从冰上取出，用微量移液器吸取700纳升溶液。接着，将液滴加到一片石蜡膜上。将石蜡膜置于颅骨开窗处上方。将针头插入病毒溶液液滴中，保持前后和左右位置不变。随后，使用泵的回抽功能，从石蜡膜上的病毒溶液中吸取约500纳升至注射器内。在体视显微镜下进行此操作，观察液滴逐渐消失，确保不要吸入任何空气。确认注射器已正确装填。通过推动活塞驱动排出系统，测试挤出少量液体以验证其功能。随后，将针头插入脑内至选定深度。按下运行按钮进行注射。然后，在三到五分钟内缓慢撤出针头。立即用干净的蒸馏水冲洗针头，通过多次注满和排空的方式清洗，以防止堵塞。随后，将动物从立体定位仪上取出。缝合皮肤，并使用2-1-1标准外科结打三到四个缝线。为提取脑组织，从颈部向鼻部的皮肤做一切口，然后用剪刀将颅骨与最后一节椎骨分离。将皮肤向两侧推开，沿中线从尾侧向头侧方向剪开颅骨。小心移除顶骨及额骨的尾侧部分。使用小型圆头解剖刀，将其插入脑组织与颅底之间，切断嗅球、视神经及其他脑神经和小脑，从而取出脑组织。轻轻将脑组织浸入冰冷的切片液中。随后，将脑组织转移至滤纸上，轻轻吸干皮层表面。将脑皮层用胶水粘附到振动切片机的样品托上，尾侧朝向刀片，以便切割水平脑切片。接着，将冰浴的含氧切割液注入切片室，使脑组织完全浸没。使用振动切片机以每秒0.7毫米的速度、1毫米振幅，切出300微米厚的脑片。在此阶段，建议使用荧光手电筒及相应的滤光眼镜，快速检查丘脑中 Chronos-GFP 的表达情况。为进行全细胞膜片钳记录，将包含海马复合体的脑片轻轻转移

in-vivo-intracerebral-stereotaxic-injections-for-optogenetic

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在Vivo脑内立体注射中，用于小鼠脑切片中远距离输入的光遗传学刺激

该视频展示了一种研究转染小鼠海马脑片中突触相互作用和神经元反应的实验方案。该方法包括通过光照激活远距离感觉神经元以诱发动作电位，并利用全细胞膜片钳技术记录目标神经元中产生的兴奋性突触后电位。...

小鼠海马脑片中神经元的光刺激与全细胞膜片钳记录

本视频展示了小鼠海马脑片中微小RNA介导的兴奋性突触电流抑制。CA3神经元被携带表达荧光报告蛋白、光激活膜通道以及可下调电压门控钙通道表达的微小RNA构建体的重组病毒载体感染。将脑片置于记录室中，并用记录电极对CA1神经元进行膜片钳记录后，使用光脉冲刺激光激活通道，引起离子内流并产生动作电位。由于CA3神经元中缺乏电压门控钙通道，神经递质释放受到抑制，从而导致与之突触连接的CA1神经元中兴奋性突触后电流被抑制。...

小鼠海马脑片中微小RNA介导的兴奋性突触后电流抑制

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光遗传学刺激与大鼠脑片突触事件的电生理记录

来源：Fricano-Kugler, C. J., et al. 通过立体定位注射设计、包装和递送高滴度 CRISPR 逆转录病毒和慢病毒。J. Vis. Exp.

小鼠脑内靶向神经元基因编辑的立体定位病毒注射

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双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

离体脑片可用于研究挥发性麻醉剂对传入刺激诱发反应的影响。利用光遗传学技术可独立激活丘脑皮层和皮层间传入纤维，作用于非初级新皮层，并通过异氟烷调节突触和神经网络反应。...

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微型显微镜体内钙成像是一种研究自由活动小鼠神经元动态和微环路的有力技术。本方案描述了进行脑部手术以利用微型显微镜实现良好体内钙成像的步骤。...

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用于光遗传学调控与神经电生理记录同步进行的光极阵列

本方案提供了一种整合性方法，包括病毒递送、光探针植入、光血栓诱导、星形胶质细胞与神经元活动的同步记录，以及星形胶质细胞的光遗传学刺激。该整合性方法旨在对缺血性脑卒中从急性期到慢性期各个阶段的星形胶质细胞-神经元相互关系进行同步研究。...

一种用于光栓法脑卒中建模的整合方法 在体 内 行为小鼠中神经元和星形胶质细胞活动的光探针记录

学习光遗传学刺激技术，用于研究小鼠脑切片中远距离神经输入的功能连接。该方法结合立体定位注射与全细胞膜片钳记录，帮助神经科学家精确解析神经元间的突触传递机制。

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