检测果蝇黑色素的内分泌干扰的方法

嗜血杆菌黑色素酯是一个强大的模型，用于评估化学品（如内分泌干扰物）在体内的潜在毒性和内分泌作用，这些化学物质对人类健康和自然环境构成严重问题。解决EDC对苍蝇荷尔蒙寿命特征的影响，如生育能力、生育能力、发育时间和寿命。这是一种简单、廉价、快速的方法，可以调查体内内分泌中断。

果蝇的生育力、发育和寿命可能受到几个因素的影响，这些因素必须仔细控制，以确保本协议的成功结果。因此，在饲养和处理苍蝇时需要给予最大的关注。为了测定所选EDC的味道，麻醉后，将15只幼蝇从苍蝇床转移到4个平行小瓶，里面装着与食品色素混合的玉米粉介质。

控制小瓶仅含有溶剂，其他三个小瓶辅以不同剂量的选定EDC。将小瓶在加湿的培养箱中保持一天，自然12小时的光线。再次麻醉苍蝇后，将固定苍蝇转移到白纸上，将其置于立体显微镜下观察。

比较每个治疗组的腹部着色与对照组。为了检测苍蝇的生殖性能，为每个EDC准备三小瓶苍蝇作为父母小瓶，8个雌性苍蝇和4个雄性在10毫升玉米粉介质辅以EE2。为了控制，准备6瓶苍蝇，每瓶有8只雌性苍蝇和4只雄性苍蝇，在10毫升玉米粉中用EE2溶剂补充。

后在25摄氏度的孵化器里飞行。在它们发育期间，避免幼虫过度拥挤。四天后，将每个小瓶倒置在乙醚器上，取出父母，将小瓶返回孵化器五天。

在第九天的下午晚些时候，将每个小瓶倒置在乙醚器上，将小瓶中取出所有新出现的苍蝇，并在18摄氏度的孵化器中过夜。10日早晨，在嗜酒二氧化碳工作站上，小心地反转培养瓶，防止麻醉苍蝇跌落到介质上，并在棉塞和小瓶壁之间插入一根用针状针头的橡胶管。打开阀门以传递二氧化碳。

在几秒钟内，在显微镜下将苍蝇转移到苍蝇床上。将处女女性和年轻男性分别收集成两组在飞床上。随机细分每组苍蝇在小子组，10个雌性或20雄每瓶充满了新鲜相应的玉米粉介质。

继续孵育，收集30个处女和30名男性每个EDC，90个处女女性和90名男性控制。这些苍蝇在摄氏25度时，直到它们被封住后四天。然后每两天将它们转移到含有新鲜相应介质的新小瓶中。

检查雌性小瓶中没有幼虫。然后为小瓶贴上不同系列序号的标签，用于以下治疗。麻醉后，将一个EE2溶剂处理雌性转移到含有不含EE2的新鲜玉米粉番茄介质的小瓶中，并加入一个EE2溶剂处理雄性进行控制。

每次治疗，EE2 处理的男性与 EE2 溶剂处理雌性或 EE2 处理性雌性与 EE2 溶剂处理型雄性配对。房子20单十字架在25摄氏度。在随后的10天内，每天将每对交配转移到没有EDC的新鲜玉米粉番茄中小瓶中。

每天目视检查每个小瓶的卵子，并在生育电子表格上报告其数量。在每个小瓶中，仔细检查新出现的苍蝇，并记录10天期间成年后代的每日数量。从最初的交配10天后，从最后一个系列小瓶中删除父母。

在环闭性测定方案中，首先，每个治疗组，设置10瓶不到两天的年轻健康苍蝇，每只6只雌蝇和3只雄性在10毫升的玉米粉食品中，没有EDC。将苍蝇放在食物上24小时，并允许它们交配。然后，每个治疗组再准备10个平行小瓶，每组10毫升新鲜玉米粉，并辅以不同的EDC浓度或EE2溶剂进行控制。

将交配苍蝇转移到这些新瓶。制作一个开发电子表格来记录不同的系列。让苍蝇产卵16小时。

然后，将父母从小瓶中取出。在25摄氏度下孵育小瓶三到四天，或直到可见流浪幼虫。每天，通过按小瓶外在外文上按顺序书写一个数字来计算每个小瓶中新幼崽的数量，以避免数同一小瓶两次。

报告三到四天新出现幼崽的数量，或直到不再有幼崽形成。从第九天开始，每天计算新兴成年人的数量，直到不再有成年人出现。报告在发展电子表格上，并根据手稿执行余下环法测定。

在寿命协议中，首先设置了20个小瓶，有8个雌性，4个雄性，每个小瓶都装满了10毫升的玉米粉食物，并把它们放在25摄氏度的温度下。四天后，丢弃苍蝇，将小瓶放回孵化器。在第九天的下午晚些时候，从小瓶中取出所有新出现的苍蝇，然后将小瓶返回孵化器。

16至24小时后，在轻二氧化碳麻醉下，将250只一日大小的成年苍蝇分成四组，并转移到250毫升的瓶装含有成人中度食物的瓶子中，其中3只补充不同的EDC浓度，1只单独使用EE2溶剂。将苍蝇在25摄氏度下保持两到三天，以便它们交配。然后，按性别将每组苍蝇分成两组。

在每个治疗条件下，对于两性，随机细分为五个平行小瓶，密度为每瓶20人。准备一个寿命电子表格，其中从上一次转移中幸存的苍蝇数量中减去死苍蝇的数量，以便自动获得每次转移的幸存者人数。三天后，将不麻醉的苍蝇转移到含有相应食物的新小瓶中，并检查死亡情况。

记录苍蝇的年龄和死苍蝇的数量。每三天重复一次转移，直到所有的苍蝇死亡。在此实验中，寿命曲线被绘制为累积生存期与每个 EDC 浓度和控制的经过天数。

对于控制，在生存曲线保持相对较高的长期初始时间之后，它大约60天后呈指数级下降。EDC暴露后，被治疗苍蝇的生存曲线受到显著影响，36天后出现明显下降。建议分析的平行小瓶应该非常相似，否则很难理解要丢弃哪个小瓶。

因此，我们建议小心，采用良好的实验实践，使用大量的样本量。按照此协议，还可以评估选定的内分泌干扰物的代际影响，并测试不同内分泌干扰物组合的潜在添加剂效应。