从细菌人工染色体cDNA克隆中拯救重组寨卡病毒

这一实验程序的总体目标是从全长cDNA克隆体生成传染性重组寨卡病毒，该克隆在人类巨细胞病毒早期启动剂的控制的细菌人工染色体中组装。寨卡病毒等RNA病毒的反向遗传系统的发展，使病毒基因组的直接操作能够研究病毒生物学和发病机型的多个方面，并制定疫苗策略。该技术的主要优点是，将寨卡病毒传染性克隆构建为细菌性人工染色体，克服了与病毒基因组相关的毒性，通过将BAC cDNA克隆直接转染到易感细胞中，可以挽救传染性病毒。

这种方法可用于构建稳定且全功能的传染性cDNA克隆，用于其他病毒和其他正链RNA病毒。若要开始此过程，请使用适当的限制站点，构建文本协议中概述的寨卡病毒 cDNA 克隆。跨越寨卡病毒基因组的四个DNA片段由人类CMV促进剂在五等端，肝炎三角洲病毒核糖体和牛生长激素终止和多发酶序列在三等质端组装在细菌人工染色体质粒中。

首先，在含有氯霉素的5毫升LB介质中生长携带pBAC-Zika病毒传染性克隆的单一大肠杆菌DH10B，在37摄氏度下，在37摄氏度下温和摇晃，长达8小时。然后，将含有氯霉素的500毫升LB介质添加到两升烧瓶中。将一毫升准备好的细菌培养剂加入烧瓶中，在37摄氏度下培养细胞14至16小时，直到OD600约为0.6至0.8。

在此之后，使用专为 BAC 纯化开发的商业套件，按照制造商的说明通过碱性解菌纯化 BAC 感染 cDNA 克隆。转染前一天，在生长介质中，每孔50万个细胞的密度将维罗细胞放入六井板的孔中。要准备转染混合物，在250微升血清中加入4微克的BAC cDNA克隆，并仔细混合。

在单独的管中，稀释12微升转染剂在250微升血清减少介质。在室温下混合和孵育五分钟的漩涡。接下来，将稀释的BACCDNA与转染剂结合。

在室温下小心混合并孵育20至30分钟。在这个孵化期间，使用没有抗生素的生长介质来清洗维罗细胞，使细胞在一毫升新鲜介质中没有抗生素。然后，将cDNA和转染试剂混合物的500微升分滴入维罗细胞滴。

来回摇动板，在37摄氏度的加湿培养箱中混合和孵化细胞，用5%的二氧化碳孵化6小时。在此之后，去除转染介质，并加入两毫升的新鲜生长介质与抗生素。用5%的二氧化碳在37摄氏度的加湿培养箱中孵育细胞，确保每天检查细胞病变效应的诱导。

经过四到六天的转染后，当 CPE 约为 50%至 75% 时，将组织培养超自然物收集在 15 毫升锥形管和离心机中 10 分钟，以清除细胞碎屑。然后，收获含有重组寨卡病毒的超级纳，并丢弃细胞颗粒。在低温管中将上一个上一点液，储存在零下80摄氏度。

首先，将维罗细胞生长到90%的汇合。用PBS洗两次细胞，用被救的病毒感染细胞，在含有2%FBS的生长介质中感染0.1。将细胞板放在37摄氏度的加湿培养箱中，在90分钟的吸附期中，每15分钟放置5%的二氧化碳和岩石。

病毒吸附后，去除病毒吸收，加入2%FBS的新鲜生长介质。在以前使用的相同条件下孵育三到四天。当 CPE 约为 75% 收集组织培养上上心和离心机以去除细胞碎屑时。

然后，收获含有重组寨卡病毒的上一症，并丢弃颗粒。将上一液放入冷冻管中。将管子放在冷冻箱中，储存在零下80摄氏度。

准备就绪后，从冰柜中取出病毒等分，通过斑块测定确定病毒滴度，如文本协议中所述。在这项研究中，一个稳定的，全长cDNA克隆的寨卡病毒株里奥格兰德多北纳塔尔是由连续克隆四个重叠的cDNA片段到细菌人工染色体pBeloBAC11使用传统的克隆方法和独特的限制位点存在于病毒基因组。这种全长cDNA克隆在五个质端由人类巨细胞病毒启动子侧翼，允许病毒RNA在转染细胞核的表达，在三个质端由肝炎三角洲病毒核糖体，其次是牛生长激素终止和聚亚核酸酶序列，以产生含有病毒基因组精确三个质端的RNA。

一旦BAC cDNA组装，传染性病毒可以很容易地恢复后，易感维罗细胞直接转染与BAC cDNA克隆使用阳离子脂质体。使用这种方法，R Zika病毒RGN可以拯救高于每毫升100万个斑块形成单位。此外，获救的病毒诱导明显的细胞病变效应，并产生约两毫米大小的同质斑块。

通过免疫荧光分析，通过寨卡病毒E蛋白的特定单克隆抗体确认获救病毒的身份。总体而言，这些结果表明，传染性重组寨卡病毒可以从在BAC中组装的全长cDNA克隆中拯救出来。总之，我们开发了一种强大的寨卡病毒反向遗传方法，其基础是使用细菌人工染色体，该染色体可以适应其他正链RNA病毒的cDNA克隆产生稳定和功能性感染，以利于病理学研究，开发疫苗，或促进具有抗病毒活性的药物的识别。