Name: 从细菌人工染色体cDNA克隆中拯救重组寨卡病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 了解利用细菌人工染色体技术从全长cDNA克隆中拯救重组寨卡病毒的方法。该方法通过转染Vero细胞实现病毒拯救，为研究病毒致病机制和开发疫苗策略提供可靠平台。

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作者感谢Carla Gómez在BAC cDNA克隆构建过程中提供的技术协助，以及Snezhana Dimitrova在视频制备方面的帮助。本工作部分得到了西班牙经济与竞争力部（MINECO，资助号BFU2016-79127-R）向F.A.T.提供的资助，以及美国国立卫生研究院（NIH，资助号1R21AI120500）向L.M.S.和F.A.T.提供的资助。

1. 在BAC中构建寨卡病毒（ZIKV）感染性cDNA克隆
注意：寨卡病毒（ZIKV）在BACs中的组装策略以RGN株13（登录号KU527068）为例进行描述（图2）。
<ol>
	<li>在病毒基因组中选择适当间隔的独特限制性酶切位点，这些位点在质粒 pBeloBAC11 中不存在（图 2A）。 
	注意：对于 ZIKV-RGN，选择的限制性酶切位点为 Pml I、Afe I 和 BstB I（基因组位置分别为 3,347、5,969 和 9,127）。如果病毒基因组中没有合适的限制性酶切位点，可在设计 cDNA 片段时通过引入同义核苷酸突变在病毒基因组中创建新的限制性酶切位点。</li>
	<li>通过化学合成方法生成四个覆盖全长基因组的 cDNA 片段（Z1 至 Z4），其 5' 端侧翼为 CMV 启动子，3' 端侧翼为 HDV RZ、BGH 终止子和多聚腺苷酸化序列（图 2B）。每个片段必须被步骤 1.1 中选定的限制性酶切位点所侧翼。 
	注意：Z1 片段用作将其他片段克隆至 pBeloBac11 的骨架。为此，它必须包含人源 CMV 启动子，并在 5' 端被 ApaL I（用于将该片段克隆至 pBeloBAC11）和 Asc I（在病毒基因组中不存在）所侧翼，在 3' 端被用于感染性克隆组装的限制性酶切位点（Pml I、Afe I 和 BstB I）以及随后的 Mlu I（在病毒基因组中不存在）和 BamH I（用于将该片段克隆至 pBeloBAC11）所侧翼。Z4 片段必须包含从最后一个选定的限制性酶切位点（BstB I）到病毒基因组末端的基因组区域，随后是 HDV RZ、BGH 终止子和多聚腺苷酸化序列，以及 Mlu I 限制性酶切位点（图 2B）。或者，cDNA 片段（Z1-Z4）也可通过标准逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）与重叠 PCR 相结合的方法，使用特异性寡核苷酸生成。</li>
	<li>通过将片段 Z1 至 Z4 依次克隆至 pBeloBAC11 中，构建感染性 cDNA 克隆（图 2B）。
	<ol>
		<li>用 ApaL I 和 BamH I 酶切 pBeloBAC11 质粒和 Z1 片段。具体操作：将 2 µg pBeloBAC11 质粒或 1 µg Z1 片段与 10 µL 10x 反应缓冲液、每种酶 20 单位及水混合，使终体积达到 100 µL。在 37°C 下孵育 2 小时。</li>
		<li>使用虾碱性磷酸酶（SAP）对 BAC 载体进行去磷酸化处理。向消化后的 BAC 中加入 2.5 µL（2.5 单位）SAP，在 37°C 下孵育 1 小时。通过在 75°C 下孵育 15 分钟使 SAP 热失活。</li>
		<li>使用专为纯化大于 10 kb 的 DNA 片段优化的商用凝胶回收试剂盒，通过琼脂糖凝胶电泳纯化去磷酸化的 BAC 载体和 Z1 片段（参见 材料表）。</li>
		<li>进行连接反应以生成质粒 (p)BAC-Z1。具体操作：将 150 ng 纯化的消化后 BAC 载体与纯化的插入片段按载体与插入片段摩尔比 1:3 混合，加入 1.5 µL 含 10 mM ATP 的 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、1 单位 T4 DNA 连接酶及水，使终体积为 15 µL。</li>
		<li>在 16°C 下孵育连接混合物 20 小时。作为连接反应的对照，平行进行一个不含插入片段的连接反应。通过在 65°C 下孵育 15 分钟使连接酶热失活。 
		注意：对于平末端 DNA，应在 14°C 下孵育连接反应 20 小时。由于 BAC 载体尺寸较大（图 2A），为提高连接效率，必须使用比常规质粒连接更多的载体和插入片段。</li>
		<li>取 2 µL 连接反应产物（步骤 1.3.5），通过电穿孔（电容 25 µF，电压 2.5 kV，电阻 100 Ω）转化 50 µL E. coli DH10B 电转化感受态细胞，使用电极间距为 0.2 cm 的电穿孔比色皿，按照标准操作流程进行。</li>
		<li>将细胞转移至含有 1 mL SOC 培养基（2% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、0.05% NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mM 葡萄糖 [pH 7.0]）的聚丙烯管中，在 37°C 下轻柔振荡（200–250 rpm）孵育 1 小时。将细胞涂布于含 12.5 µg/mL 氯霉素的 Luria 肉汤（LB）琼脂平板上，在 37°C 下孵育 16 小时。</li>
		<li>挑取 8 至 12 个细菌菌落，在含 12.5 µg/mL 氯霉素的新鲜 LB 琼脂平板上制作影印平板，并使用特异性寡核苷酸通过直接 PCR 分析检测其是否含有正确的插入片段。</li>
		<li>从影印平板中挑取一个阳性菌落，在含 12.5 µg/mL 氯霉素的 100 mL LB 培养基中培养，使用商用质粒中量提取试剂盒，按照大拷贝数低拷贝质粒纯化的推荐方法，通过碱裂解法提取 BAC cDNA（参见 材料表）。 
		注意：通过该方法制备的 BAC cDNA 可能被高达 30% 的细菌基因组 DNA 污染，但其质量足以用于限制性酶切分析、测序和克隆。根据 BAC 大小，可获得 4–6 µg 的 BAC 质粒。</li>
		<li>通过限制性酶切分析验证克隆 cDNA 的遗传完整性。取 500 ng pBAC-Z1 质粒，用 Asc I 和 Pml I 在 37°C 下酶切 1 小时，通过凝胶电泳确认 Z1 片段的存在。为进一步确认未引入非预期突变，使用特异性寡核苷酸对插入片段进行测序。</li>
		<li>以含有选定限制性酶切位点（Pml I、Afe I、BstB I 和 Mlu I）的质粒 pBAC-Z1 为起点，依次克隆 Z2 至 Z4 片段，构建全长感染性 cDNA 克隆 pBAC-ZIKV（图 2B），实验方法与上述 Z1 片段的克隆步骤（1.3.1–1.3.10）类似。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于拯救感染性rZIKV的高纯度pBAC-ZIKV的制备
注意： 超纯pBAC-ZIKV感染性克隆的大规模制备适用于转染及感染性病毒的拯救，需使用专为BAC纯化设计的商业化试剂盒（参见材料表）通过碱裂解法进行。该试剂盒必须包含ATP依赖性外切核酸酶消化步骤，以去除细菌基因组DNA污染，从而获得纯度与氯化铯法相当的BAC cDNA。
<ol>
	<li>在含有12.5 µg/mL氯霉素的5 mL LB培养基中，于37°C、轻度振荡（200-250 rpm）条件下培养携带pBAC-ZIKV感染性克隆的单个大肠杆菌（E. coli）DH10B菌落8小时。</li>
	<li>将1 mL细菌培养物（步骤2.1）加入含12.5 µg/mL氯霉素的500 mL LB培养基中，置于2 L锥形瓶内，于37°C培养14-16小时（直至OD600达到0.6-0.8）。 
	注意：富集培养基（如TB培养基）可能导致极高的细胞密度，从而降低BAC cDNA的产量和纯度。</li>
	<li>使用专为BAC纯化设计的商业化碱裂解试剂盒，按照制造商说明纯化BAC感染性cDNA克隆（参见材料表）。将纯化的BAC cDNA保存在4 °C。根据BAC大小，可获得约30 µg的超纯BAC cDNA克隆。 
	注意：DNA沉淀干燥时间不得超过5分钟，过度干燥将导致BAC cDNA难以溶解。由于BAC cDNA克隆分子量较大，应避免涡旋振荡或剧烈移液，以防质粒剪切。</li>
</ol>
3. 通过转染 Vero 细胞从 BAC cDNA 克隆中拯救感染性 rZIKV
注意：使用商品化的阳离子脂质转染试剂，将pBAC-ZIKV cDNA克隆转染至Vero细胞，可回收获得具有感染性的重组寨卡病毒（rZIKV）（参见材料表；图3）。
<ol>
	<li>转染前一天，将细胞以每孔5 × 10⁵个接种于6孔板中5 Vero 细胞/孔，使用生长培养基（含 5% 胎牛血清 [FBS]、2 mM L-谷氨酰胺和 1% 非必需氨基酸的杜尔贝科改良伊格尔培养基 [DMEM]），不添加抗生素，培养至转染时形成 90% 汇合的单层细胞. 
	注意： 建议以三个重复组进行病毒拯救实验。</li>
	<li>将减血清培养基（见材料表）于室温平衡，并为每份转染样品在无菌微量离心管中配制转染混合液，步骤如下。
	<ol>
		<li>加入4 µg BAC cDNA克隆至250 µL中&#160;加入低血清培养基，轻轻混匀，避免涡旋震荡，以防质粒剪切。</li>
		<li>在另一个离心管中，加入 12 µL 的&#160;转染试剂（1 mg/mL）（参见 材料表在250 µL无血清培养基中，涡旋混匀，室温孵育5分钟。</li>
		<li>将稀释后的BAC cDNA与转染试剂按1:3的DNA:转染试剂比例混合，&#160;轻轻混匀，避免产生涡流，室温孵育 20–30 分钟.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在BAC孵育期间&#160;cDNA/转染试剂混合物，用不含抗生素的生长培养基洗涤Vero细胞，并将细胞置于1 mL新鲜的不含抗生素培养基中。 
	注意： 转染过程中添加抗生素可能会降低转染效率。</li>
	<li>逐滴加入&#160;将500 µL BAC cDNA/转染试剂混合物（步骤3.2.3）加入Vero细胞中，轻轻前后摇动培养板混匀，然后将细胞置于5% CO₂培养箱中孵育2 37 °C 恒温培养箱中培养 6 小时.</li>
	<li>移除转染培养基，加入2 mL含抗生素的新鲜生长培养基（100 U/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素），将细胞置于5% CO₂培养箱中培养。2 37 °C 恒温培养箱中培养，并每天观察细胞病变效应（CPE）的出现情况. 
	注意： 寨卡病毒（ZIKV）在Vero细胞中引起的细胞病变效应（CPE）十分明显，其特征是出现折光性强的圆形细胞，这些细胞会脱落并漂浮于组织培养上清液中。</li>
	<li>每隔24小时收集一份Vero细胞组织培养上清液（步骤3.5）的等分试样（100 µL），通过在新鲜Vero细胞上进行标准蚀斑试验检测ZIKV的存在，以评估病毒回收效率图4A).</li>
	<li>转染后四到六天，当细胞病变效应（CPE）达到约50%–75%时（图4B），将组织培养上清液收集到15 mL锥形管中，在2,000 x g 4 °C下离心10分钟以去除细胞碎片.</li>
	<li>收集含有重组寨卡病毒（rZIKV）的上清液，弃去细胞沉淀。将上清液分装至冻存管中，于 -80 °C 保存，以进一步确认拯救出的 rZIKV 是否存在。</li>
</ol>
4. 回收rZIKV的滴定
<ol>
	<li>滴定前一天，在12孔板中接种 2.5 x 105 在滴定前，将Vero细胞/孔接种于生长培养基中，使其形成90%汇合的单层细胞。 
	注意： 我们建议对回收的rZIKV进行三次重复的滴定实验。</li>
	<li>从冻存的上清液（步骤 3.8）中取出一份等量样品，用不含 FBS 的培养基进行连续 10 倍梯度稀释。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤Vero细胞2次，每孔加入200 µL病毒稀释液，每个稀释度设3个复孔。将培养板置于5% CO₂培养箱中2 在37 °C的加湿培养箱中孵育，并每15分钟摇动一次，吸附期为90分钟。</li>
	<li>移除病毒接种液，覆盖&#160;含有2% FBS、1% DEAE-葡聚糖和0.6% Noble琼脂的2 mL生长培养基，于37 °C、5% CO₂条件下培养 CO2 3-4 天。 
	注意： 可以使用琼脂糖、甲基纤维素或其他覆盖培养基。形成适当噬斑所需的时间将根据所使用的覆盖培养基及ZIKV毒株的不同而有所差异。</li>
	<li>用1 mL/孔的4%多聚甲醛（溶于PBS）在室温下固定ZIKV感染的细胞1 h，去除覆盖物后，用含20%甲醇的0.1%结晶紫溶液在室温下染色15 min，以显色病毒蚀斑。
	<ol>
		<li>弃去结晶紫，用清水洗涤3次，让平板晾干，然后手动计数噬菌斑（图 4C，左侧面板）。病毒滴度以每毫升噬斑形成单位（PFU/ml）计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，可通过使用针对黄病毒属E蛋白的小鼠单克隆抗体（mAb）4G2进行免疫染色来观察病毒蚀斑（图4C，右侧面板）。
	<ol>
		<li>为了通过免疫染色评估寨卡病毒（ZIKV）蚀斑，在如上所述固定并去除覆盖的琼脂糖（步骤4.5）后，用PBS洗涤细胞2次，随后在室温下用含0.5% Triton-X100的PBS溶液200 µL/孔孵育15分钟，以对细胞进行通透处理。</li>
		<li>吸除透化溶液，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每孔加入 200 µL 封闭液（含 10% FBS 的 PBS），室温封闭 1 小时。 
		注意： 其他标准封闭液（例如含2.5% BSA的PBS）也可用于此步骤。</li>
		<li>吸除封闭液，每孔加入200 µL用封闭液稀释的泛黄病毒E蛋白单克隆抗体4G2（1 µg/mL），37 °C孵育1小时。 
		注意： 可使用其他单克隆抗体或多克隆抗体（pAb）替代4G2进行病毒斑块的免疫染色与检测。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后加入 200 µL 用封闭液按制造商推荐比例稀释的生物素化山羊抗小鼠二抗，37 °C 孵育 1 小时。</li>
		<li>除去二抗，用 PBS 洗涤细胞 4 次，并根据制造商说明书使用基于亲和素/生物素的辣根过氧化物酶试剂盒显色，观察病毒蚀斑（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 重组寨卡病毒（rZIKV）成功拯救的验证
注意：为进一步确认拯救病毒的身份，使用针对ZIKV E蛋白的鼠源单克隆抗体1176-56进行免疫荧光分析ZIKV E蛋白的表达（图4D）。该单克隆抗体特异性识别ZIKV E蛋白，与泛黄病毒属E蛋白单克隆抗体4G2（步骤4.6.3）的情况不同。此外，也可通过测序来确认病毒的身份。
<ol>
	<li>免疫荧光分析前一天，在24孔板中接种盖玻片，每孔加入含有1 × 105个Vero细胞的生长培养基，使细胞在感染时达到约90%汇合度。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞2次，然后在无FBS的生长培养基中（每孔100 µL），以0.5 PFU/细胞的感染复数（MOI）接种拯救病毒，每个样本设3个重复。将培养板置于37 °C孵育90分钟。</li>
	<li>病毒吸附后，吸除病毒接种液，每孔加入0.5 mL含2% FBS的新鲜生长培养基，于37 °C、5% CO2湿化培养箱中继续培养48小时。</li>
	<li>收集组织培养上清液，每孔加入150 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，室温固定细胞20分钟；随后每孔加入150 µL含0.5% Triton-X100的PBS溶液，室温透化细胞15分钟。</li>
	<li>吸除透化液，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入150 µL封闭液，室温封闭1小时。 
	注意：也可使用其他封闭液（例如含2.5% BSA的PBS）进行封闭。</li>
	<li>吸除封闭液，每孔加入100 µL用封闭液稀释的单克隆抗体mAb 1176-56（针对ZIKV E蛋白，终浓度为1 µg/mL），37 °C孵育1小时。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞3次，每孔加入100 µL用封闭液按厂家推荐比例稀释的Alexa Fluor 488标记的抗小鼠二抗，室温孵育1小时；充分用PBS洗涤后，每孔加入150 µL用PBS稀释200倍的4',6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1 mg/mL），室温避光孵育10分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞3次，将盖玻片封片于抗荧光淬灭封片剂中（参见材料表），在荧光显微镜下观察样本。 
	注意：如需长期保存，应将样本置于4 °C避光保存。</li>
</ol>
6. 病毒毒株的扩增与制备
注意： 一旦确认拯救病毒的身份（第5节），需在Vero细胞上扩增病毒，并制备病毒储备液以用于后续研究。
<ol>
	<li>按照前述方法，在100 mm × 21 mm培养皿中培养Vero细胞至90%汇合度，并以0.1 PFU/细胞的感染复数（MOI）进行感染。</li>
	<li>当细胞病变效应（CPE）达到约75%时（感染后约48–72小时），收集组织培养上清液至50 mL锥形管中，在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。</li>
	<li>收集含有重组寨卡病毒（rZIKV）的上清液，弃去细胞沉淀。将上清液分装至冻存管中，并于-80 °C保存。</li>
	<li>从冰箱中取出一份病毒分装样品，按照前述方法（第4节）通过空斑实验测定病毒滴度。</li>
</ol>

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<li>Setoh, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Generation+and+Characterization+of+New+Zika+Virus+Isolate+Using+Sequence+Data+from+a+Microcephaly+Case%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case.</a> mSphere. 2 (3), (2017).</li>
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<li>Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Recombinant+Arenavirus+for+Vaccine+Development+in+FDA-Approved+Vero+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+nucleotide+sequence+of+two+generations+of+a+bacterial+artificial+chromosome+cloning+vector%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector.</a> BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).</li>
<li>Shizuya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+stable+maintenance+of+300-kilobase-pair+fragments+of+human+DNA+in+Escherichia+coli+using+an+F-factor-based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).</li>
<li>Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+DNA-launched+dengue+virus+type+2+infectious+clone+assembled+in+a+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome.</a> Virus Research. 180, 12-22 (2014).</li>
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<li>Balint, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+feline+infectious+peritonitis+virus+strain+DF-2+and+studies+of+the+role+of+ORF3abc+in+viral+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism.</a> Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).</li>
<li>St-Jean, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+a+neurovirulent+human+coronavirus+OC43+from+an+infectious+cDNA+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone.</a> Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).</li>
<li>Almazan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+infectious+cDNA+clone+and+a+replicon+to+study+coronavirus+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis.</a> Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).</li>
<li>Almazan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+replication-competent%2C+propagation-defective+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+as+a+vaccine+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate.</a> mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).</li>
<li>Jamsai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+modification+of+a+human+beta-globin+locus+BAC+clone+using+GET+Recombination+and+an+I-Scei+counterselection+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette.</a> Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).</li>
<li>Lee, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+Escherichia+coli-based+chromosome+engineering+system+adapted+for+recombinogenic+targeting+and+subcloning+of+BAC+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA.</a> Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

感染性cDNA克隆是RNA病毒基础研究以及疫苗开发和/或抗病毒策略鉴定所必需的分子工具。然而，对于许多正义链RNA病毒（包括黄病毒属病毒）而言，使用标准的高拷贝数质粒在细菌中扩增时，克隆的cDNA往往不稳定，导致感染性cDNA克隆的构建十分困难。以寨卡病毒（ZIKV）及其他黄病毒为例，这种不稳定性主要源于病毒基因组中存在的隐蔽性细菌启动子会泄漏表达具有毒性的病毒蛋白14,15,16,17。本文中，我们描述了一种替代性强且高效的方案，用于构建稳定的ZIKV全长感染性cDNA克隆，该克隆以单个质粒形式存在。该方案基于使用BAC质粒pBeloBAC1134（图2A）以克服毒性问题，利用CMV启动子驱动vRNA在转染细胞核内的表达，并采用HDV RZ（丁型肝炎病毒核酶）生成具有精确3'端的vRNA（图2B）。利用该方法，我们成功构建了ZIKV RGN毒株的完全稳定的感染性克隆，可在直接转染易感Vero细胞后高效且可靠地拯救出具有感染性的重组ZIKV（rZIKV）（图3和图4）。
近年来，为解决与寨卡病毒（ZIKV）感染性cDNA克隆相关的不稳定性问题，已投入大量努力，并成功实施了多种策略18，包括cDNA片段的体外连接24,25、使用低拷贝质粒19,20、通过引入同义突变失活隐匿性细菌启动子26,27、插入内含子21,22,23、吉布森组装法（Gibson assembly method）30、ISA方法28,29，以及使用CPER技术31。尽管这些方法能够克服毒性问题&#160;并可用于构建ZIKV感染性cDNA克隆，但其中一些方法操作繁琐且存在若干缺点，例如需要进行体外连接和转录步骤，从而降低病毒回收效率；或需引入大量同义突变以失活隐匿性细菌启动子，可能影响病毒适应性等。本实验方案所描述的方法具有以下优势。 i) BAC质粒pBeloBAC1134具有严格调控的复制机制，每细胞仅维持一个或两个质粒拷贝，可最大限度地减少毒性，从而在细菌中稳定保存不稳定的cDNA。ii) BAC质粒的扩增与修饰操作与常规质粒基本相似，仅需参考本方案中所述对大尺寸BAC-DNA片段和低拷贝质粒操作的细微调整。值得注意的是，还可利用Red同源重组系统在E. coli中对BAC cDNA克隆进行同源重组修饰42,43,44. iii) 使用CMV启动子可在细胞内直接表达带帽的ZIKV vRNA，无需体外转录步骤即可回收感染性病毒。iv) 将BAC cDNA克隆直接转染至易感细胞（如Vero细胞）后即可产生感染性重组ZIKV（rZIKV）。由于DNA转染哺乳动物细胞的效率高于RNA转染，因此采用BAC方法的病毒回收效率高于使用RNA转录本的方法，减少了为制备病毒储备液所需的细胞传代次数，从而有效限制了因细胞适应性培养而引入的非预期突变。
最后，BAC方法的潜力得到了支持，该方法（经轻微修改后）已成功用于构建其他黄病毒属病毒的感染性cDNA克隆，包括登革病毒36，以及多种对人类和动物健康具有重大影响的冠状病毒，例如猪传染性胃肠炎冠状病毒37（TGEV）、猫传染性腹膜炎病毒38（FIPV）、人类冠状病毒OC4339（HCoV-OC43）、严重急性呼吸综合征冠状病毒40（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒41（MERS-CoV）等。
在本方案中，有两个关键步骤需要特别注意。一个重要考虑因素是识别病毒基因组中存在但BAC质粒中缺失的合适且唯一的限制性酶切位点。如果不存在足够的限制性酶切位点，可在克隆设计过程中通过引入同义核苷酸突变来创建新的限制性酶切位点。另一个重要问题是，BAC质粒在每个细胞中仅有一个或两个拷贝，因此使用为高拷贝或中等拷贝数质粒设计的标准方法提取时，BAC质粒产量较低，且常伴有大量细菌基因组DNA污染。这一潜在问题可通过使用大体积培养物，并采用专为BAC质粒纯化设计的商业试剂盒进行纯化而轻松解决。
综上所述，我们开发了一种基于细菌人工染色体（BAC）的高效寨卡病毒（ZIKV）反向遗传学方法，该方法可被改造用于生成其他正链RNA病毒的稳定且完全具有感染性的cDNA克隆，从而促进对这些病毒生物学特性的研究以及疫苗的开发，和/或有助于抗病毒药物的筛选与鉴定。

寨卡病毒（ZIKV）是一种通过蚊子传播的黄病毒属病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae），目前已成为全球公共卫生紧急事件1。与其他黄病毒类似，ZIKV 是一种具有二十面体样结构的有包膜RNA病毒，其基因组为约 10.8 kb 的正义单链RNA分子（图1）2。病毒基因组编码一个长约 3,423 个氨基酸的多聚蛋白，该蛋白经病毒和宿主细胞蛋白酶加工后，产生三种结构蛋白——衣壳蛋白（C）、前膜/膜蛋白（prM/M）和包膜蛋白（E），这些蛋白参与病毒颗粒的形成；此外还产生七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5），参与基因组复制、病毒组装以及逃逸宿主免疫应答（图1）3。
历史上，寨卡病毒（ZIKV）感染通常与一种轻微的发热性疾病相关4,5。然而，近年来ZIKV感染在南美洲、中美洲、南太平洋及加勒比地区暴发的大流行6,7,8，以及其与吉兰-巴雷综合征和小头畸形发生之间的关联9,10,11,12,13，改变了人们对ZIKV的传统认知，并凸显了其作为一种重要人类病原体的重要性。在此背景下，开发分子工具（如感染性cDNA克隆）将有助于研究病毒的致病机制，推动基因定义疫苗的研发，并促进抗病毒药物的筛选，以用于ZIKV感染的治疗。正如其他黄病毒科病毒所述，由于病毒基因组中存在隐秘的细菌启动子14，在使用标准高拷贝数质粒于细菌中扩增cDNA克隆时，可能导致毒性病毒蛋白的泄漏表达，因此构建ZIKV感染性克隆具有较大难度15,16,17。为克服这一毒性问题，过去两年中已成功应用多种非传统策略&#160;18，包括使用低拷贝数质粒19,20、插入内含子以破坏毒性区域21,22,23、体外连接cDNA片段24,25、对病毒基因组中存在的隐秘细菌启动子进行突变沉默26,27、使用感染性亚基因组扩增子（ISA）28,29、吉布森组装法30，以及环状聚合酶延伸反应（CPER）技术31。
本文中，我们描述了利用细菌人工染色体（BAC）克服毒性问题，构建寨卡病毒（ZIKV）毒株ZIKV-RGN13全长cDNA克隆的详细方案，以及通过将该BAC cDNA克隆直接转染至Vero细胞来拯救感染性重组ZIKV（rZIKV）的方法32。Vero细胞系已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于人用疫苗的开发33。在该系统中，病毒基因组的全长cDNA拷贝被构建于BAC质粒pBeloBAC1134中（图2A），该质粒为低拷贝数质粒（每细胞含1至2个拷贝），源自大肠杆菌（Escherichia coli）F因子35，可在细菌中传代时最大限度地降低黄病毒序列的毒性。ZIKV基因组cDNA被组装在pBeloBAC11中，受控于人巨细胞病毒（CMV）即刻早期启动子，以使转染细胞的细胞核内可通过细胞RNA聚合酶II表达病毒（v）RNA，并&#160;在3'端由乙型肝炎病毒（HDV）核酶（RZ）进行限定，随后接牛生长激素（BGH）终止信号和多聚腺苷酸化信号序列，从而分别产生具有真实病毒基因组5'端和3'端的合成RNA（图2B）。该基于cDNA的系统可在细胞内表达带帽的病毒RNA，从而无需体外转录步骤即可回收具有感染性的ZIKV。BAC方法提供了一种强大且适用性广泛的技术策略，可用于构建其他黄病毒以及其他正链RNA病毒的稳定且功能完整的感染性cDNA克隆36,37,38,39,40,41。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. 分子生物学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Afe I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0652S</td><td>10,000 Units/mL</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>N8080161</td><td>5,000 Units/mL</td></tr><tr><td>ApaL I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10,000 units/mL</td></tr><tr><td>Asc I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td>10,000 Units/mL</td></tr><tr><td>BamH I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td>10,000 Units/mL</td></tr><tr><td>BstB I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0519S</td><td>20,000 Units/mL</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Cells&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>18290015</td><td>电转感受态 DH10B 细胞</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿，0.2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>易燃</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>易燃</td></tr><tr><td>Large-Construct Kit (10)</td><td>QIAGEN</td><td>12462</td><td>用于高纯度 BAC 制备</td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>12780029</td><td>也可自行配制</td></tr><tr><td>含琼脂的 LB 培养基</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>22700041</td><td>也可自行配制</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck</td><td>106009</td><td>易燃</td></tr><tr><td>Mlu I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0198S</td><td>10,000 Units/mL</td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>质粒 pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>质粒中量提取试剂盒 (25)</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>用于中等规模 BAC 质粒制备</td></tr><tr><td>Pml I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0532S</td><td>20,000 Units/mL</td></tr><tr><td>聚丙烯管（10 mL）</td><td>DeltaLab</td><td>175724</td><td>其他商业来源亦可接受</td></tr><tr><td>QIAEX II 琼脂糖凝胶回收试剂盒 (150)</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td>专为大于 10 kb 的 DNA 片段纯化优化的凝胶回收试剂盒</td></tr><tr><td>虾碱性磷酸酶（rSAP）</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1,000 Units/mL</td></tr><tr><td>SOC 培养基</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>15544034</td><td>也可自行配制</td></tr><tr><td>cDNA 片段合成</td><td>Bio Basic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>10481220001</td><td>1,000 Units/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. 细胞培养试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>优质琼脂</td><td>VWR</td><td>214230</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的抗小鼠二抗</td><td>不同厂家</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠二抗</td><td>不同厂家</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿（100 mm × 21 mm）</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（15 mL）</td><td>VWR</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（50 mL）</td><td>VWR</td><td>525-0155</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>有毒且具致癌性</td></tr><tr><td>DEAE-葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ThermoFisher Scientific (HyClone)</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>有毒且具致癌性</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>11668019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>31985070</td><td>转染用培养基</td></tr><tr><td>泛黄病毒 E 蛋白单克隆抗体 4G2</td><td>BEI Resources</td><td>NR-50327</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td>有毒且具致癌性</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC 试剂盒</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>PK-4010</td><td>基于亲和素/生物素的过氧化物酶试剂盒</td></tr><tr><td>Vero 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV E 蛋白单克隆抗体 1176-56</td><td>BioFront Technologies</td><td>BF-1176-56</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. 仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1704468</td><td>其他商业来源亦可接受</td></tr><tr><td>II 级生物安全 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 柜</td><td>不同厂家</td><td>N/A</td><td>其他商业来源亦可接受</td></tr><tr><td>台式制冷离心机</td><td>不同厂家</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>不同厂家</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>高速制冷离心机</td><td>不同厂家</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser 电穿孔仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td>其他型号仪器亦可接受</td></tr><tr><td>SimpliAmp 梯度 PCR 仪</td><td>ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>A24811</td><td>其他型号仪器亦可接受</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>不同厂家</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

从细菌人工染色体cdna克隆中拯救重组寨卡病毒

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

寨卡病毒（ZIKV）感染与近期全球暴发期间出现的神经系统并发症相关，且目前尚无获批的疫苗和/或抗病毒药物，这凸显了迫切需要开发ZIKV反向遗传系统，以促进对ZIKV生物学特性的研究以及治疗性和/或预防性策略的开发。然而，与其他黄病毒科病毒类似，由于病毒序列在细菌中扩增时具有毒性，ZIKV全长感染性cDNA克隆的构建一直受到阻碍。为克服这一问题，我们开发了一种基于细菌人工染色体（BACs）的非传统方法。利用该方法，寨卡病毒RGN Natal株（ZIKV-RGN）的全长cDNA拷贝由四个合成DNA片段组装而成，并插入单拷贝质粒pBeloBAC11中，受人巨细胞病毒（CMV）即刻早期启动子调控。所构建的BAC cDNA克隆在细菌传代过程中保持稳定，将该BAC cDNA克隆转染至Vero细胞后可恢复出具有感染性的重组ZIKV（rZIKV）。本文所述方案为构建黄病毒（包括ZIKV）及其他正链RNA病毒的感染性克隆提供了一种强大技术，尤其适用于基因组较大且在细菌&#160;传代.过程中存在稳定性问题的病毒

本方案描述了利用细菌人工染色体（BAC）构建稳定的寨卡病毒（ZIKV）全长cDNA感染性克隆的方法，以减少多种黄病毒序列相关的毒性问题。在转染易感的Vero细胞后，可高效地从BAC cDNA克隆中回收具有感染性的重组ZIKV（图2）。通过该方案，我们采用传统克隆方法和病毒基因组中存在的独特限制性酶切位点，将四个重叠的cDNA片段依次克隆至BAC质粒pBeloBAC1134中，成功构建了ZIKV RGN32毒株的稳定全长cDNA克隆（图2）。该全长cDNA克隆的5'端上游连接人巨细胞病毒（CMV）启动子，以驱动转染细胞核内病毒RNA（vRNA）的表达；3'端下游依次连接丁型肝炎病毒核酶（HDV RZ）、牛生长激素（BGH）多聚腺苷酸化信号及终止序列，从而产生具有精确病毒基因组3'端序列的RNA（图2）。所构建的BAC cDNA克隆在细菌中具有良好的稳定性，且可利用标准的重组DNA技术进行便捷操作，凸显了BAC cDNA策略在快速、可靠地构建基因组不稳定的ZIKV及其他黄病毒或正链RNA病毒全长cDNA克隆方面的应用潜力。
一旦BAC cDNA克隆构建完成（图2)，利用阳离子脂质体将BAC cDNA克隆直接转染至敏感的Vero细胞后，可轻松回收获得具有感染性的病毒(图3）。这种cDNA启动系统可实现加帽的 vRNA，无需体外转录步骤即可回收具有感染性的病毒。利用该方法，我们成功拯救出滴度高于10的重组ZIKV-RGN病毒6 转染后5天的PFU/mL（图4A）。此外，拯救出的病毒诱导出明显的细胞病变效应（CPE）图4B），产生大小约为 2 mm 的均一噬斑（图 4C），其身份通过测序（数据未显示）和使用针对ZIKV E蛋白的单克隆抗体1176-56进行的免疫荧光分析得以确认（图4D体外实验数据表明，所获得的 rZIKV-RGN 在 Vero 细胞中能够高效复制，其复制水平与一种天然分离的 ZIKV 相当32 （数据未显示）。总体而言，这些结果表明，能够从BAC中构建的全长cDNA克隆中拯救出具有感染性的rZIKV。
<img alt="病毒蛋白结构与蛋白酶切割示意图；病毒颗粒横截面及标记的蛋白。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：ZIKV基因组结构与病毒颗粒结构。（A）基因组结构：ZIKV含有一个正链单链RNA，翻译为单一多聚蛋白。该多聚蛋白经病毒蛋白酶（箭头）和宿主蛋白酶（菱形）切割，产生结构蛋白——衣壳蛋白（C，蓝色）、基质蛋白（M，棕色）和包膜蛋白（E，绿色），以及七个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5）。病毒基因组末端的5'和3'非翻译区（UTRs）以黑线标示。（B）病毒颗粒结构：ZIKV病毒颗粒表面分布有E蛋白和M蛋白，锚定于具有类二十面体结构的脂双层中。在病毒包膜下方是由C蛋白与病毒基因组RNA结合组成的病毒核衣壳。本图改编自Ávila-Pérez等人的研究18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细菌人工染色体图谱；pBeloBAC11（7,507 bp）和 pBAC-ZIKV（18,308 bp）质粒图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2ZIKV全长感染性cDNA克隆在BAC中的构建 (ApBeloBAC11 BAC 载体的示意图：调控基因 parA, parB, parC，以及 repE,F因子复制起点（OriS）），氯霉素抗性基因（Cmr）和 lacZ基因的位置已标出。用于构建感染性ZIKV cDNA克隆的相关限制性酶切位点已用下划线标出。B) 将ZIKV全长感染性cDNA克隆组装至pBeloBAC11 BAC中：四个重叠的DNA片段（Z1-Z4），覆盖整个ZIKV基因组（图1）并由指定的限制性酶切位点侧翼包围，通过化学合成方法生成，并依次克隆至 pBeloBAC11 载体中，构建出具有感染性的 ZIKV 全长 cDNA 克隆 pBAC-ZIKV。全长 ZIKV 感染性 cDNA 在人巨细胞病毒即刻早期启动子（CMV）的调控下组装，并在 3'-端由 HDV 核酶（RZ）以及牛生长激素（BGH）终止子和多聚腺苷酸化序列进行侧翼包围。病毒基因和调控元件的缩写如文中所述。 图1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="ZIKV 扩增过程，pBAC-ZIKV DNA 转染，Vero 细胞示意图，病毒复制时间线" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：从BAC cDNA克隆生成rZIKV的工作流程。 融合度为90%的Vero细胞在单层培养条件下转染ZIKV全长感染性cDNA克隆pBAC-ZIKV（图2使用阳离子脂质体. 转染后4-6天，当细胞病变效应（CPE）明显时，收集含有重组寨卡病毒（rZIKV）的组织培养上清液，并检测病毒的存在图4并在Vero细胞中用于病毒扩增。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="病毒生长曲线、模拟感染与重组寨卡病毒的显微镜观察、结晶紫染色、免疫染色分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：重组寨卡病毒（rZIKV）的拯救与体外特性鉴定。 （A）从BAC cDNA克隆中拯救具有感染性的rZIKV：将90%汇合度的Vero细胞（6孔板，三复孔）进行模拟转染或每孔转染4 µg的pBAC-ZIKV（图 3），在指定的转染后时间点，通过噬斑实验（PFU/mL）测定组织培养上清液中的病毒滴度。误差线表示三次独立转染实验的标准差。黑色虚线表示检测下限（50 PFU/mL）。（B）病毒引起的细胞病变效应（CPE）：将90%汇合度的Vero细胞（6孔板，三复孔）进行模拟感染（上图）或以MOI为0.5 PFU/细胞的rZIKV感染，在感染后48小时通过光学显微镜评估CPE的存在。比例尺 = 100 µm。（C）病毒噬斑实验与免疫染色：将90%汇合度的Vero细胞（12孔板）用rZIKV感染，在感染后72小时，通过结晶紫染色（左图）或使用针对黄病毒属E蛋白的单克隆抗体4G2进行免疫染色（右图）观察病毒噬斑。比例尺 = 5 mm。（D）免疫荧光检测：将90%汇合度的Vero细胞（24孔板，三复孔）以MOI为0.5 PFU/细胞的rZIKV感染，在感染后48小时使用针对ZIKV E蛋白的单克隆抗体1176-56进行免疫荧光分析。细胞核用DAPI染色。图中显示的是ZIKV感染Vero细胞的代表性合并图像。右上角白色方框表示ZIKV感染Vero细胞的放大图像。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

寨卡病毒最近的流行凸显了建立反向遗传学方法以开发疫苗和/或治疗策略的重要性。本文中，我们描述了从一个全长cDNA克隆中拯救出具有感染性的重组寨卡病毒的实验方案，该克隆构建于细菌人工染色体中，并由人巨细胞病毒即刻早期启动子驱动。

从细菌人工染色体cDNA克隆中拯救重组寨卡病毒

寨卡病毒（ZIKV）感染与最近全球暴发期间出现的神经系统并发症相关，且目前尚无获批的疫苗……

本实验方案的总体目标是从全长cDNA克隆中产生具有感染性的重组寨卡病毒，该克隆构建于细菌人工染色体（BAC）中，并由人巨细胞病毒即刻早期启动子驱动。针对寨卡病毒等RNA病毒建立的反向遗传学系统，可直接对病毒基因组进行操作，以研究病毒生物学和致病机制的多个方面，并推动疫苗策略的开发。该技术的主要优势在于，将寨卡病毒感染性克隆构建为细菌人工染色体形式，可克服黄病毒基因组相关的毒性问题，并可通过将BAC cDNA克隆直接转染至易感细胞中，实现感染性病毒的拯救。该方法也可用于构建其他黄病毒以及其他正链RNA病毒的稳定且完全具有感染性的cDNA克隆。开始本实验前，请按照文本方案中所述，利用适当的限制性酶切位点构建寨卡病毒cDNA克隆。将四个DNA片段组装至细菌人工染色体质粒中，这些片段覆盖寨卡病毒基因组，其5′端侧翼为人类巨细胞病毒（CMV）启动子，3′端侧翼为丙型肝炎病毒核糖体结合位点以及牛生长激素终止子和多聚腺苷酸化序列。首先，在含有氯霉素的5毫升LB培养基中，于37°C、轻度振荡条件下培养携带pBAC-Zika病毒感染性克隆的E.coli DH10B单菌落8小时。然后，向一个2升的锥形瓶中加入500毫升含氯霉素的LB培养基。将1毫升上述制备的细菌培养物加入锥形瓶中，并于37°C培养14至16小时，直至OD600达到约0.6至0.8。此后，使用专门开发用于BAC纯化的商业试剂盒，按照制造商说明书通过碱裂解法纯化BAC感染性cDNA克隆。转染前一天，将Vero细胞以每孔500,000个细胞的密度接种至6孔板的各孔中，培养基使用生长培养基。为制备转染混合物，将4微克BAC cDNA克隆加入250微升减血清培养基中，并轻轻混匀。在另一个离心管中，将12微升转染试剂加入250微升减血清培养基中稀释。涡旋混匀后，室温孵育5分钟。接着，将稀释后的BAC cDNA与转染试剂混合。小心混匀，并在室温下孵育 20 至 30 分钟。在此孵育期间，使用不含抗生素的生长培养基洗涤 Vero 细胞，并将细胞保留在 1 毫升新鲜的不含抗生素的培养基中。然后，将 500 微升 cDNA 与转染试剂的混合物逐滴加入 Vero 细胞中。轻轻来回摇动培养板以混匀，并在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育细胞6小时。此后，移除转染培养基，加入2毫升含抗生素的新鲜生长培养基。将细胞继续在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育，并确保每天观察细胞病变效应的出现情况。转染后四到六天，当细胞病变效应（CPE）达到约50%至75%时，将组织培养上清液收集至15毫升锥形管中，离心10分钟以去除细胞碎片。随后，收集含有重组寨卡病毒的上清液，并弃去细胞沉淀。将上清液分装至冻存管中，于-80摄氏度保存。首先，将Vero细胞培养至90%汇合度。用PBS洗涤细胞两次，然后在含有2%胎牛血清的培养基中，以0.1的感染复数接种拯救病毒进行感染。将细胞培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中，在90分钟的吸附期内每15分钟轻轻摇动一次。病毒吸附后，移除病毒接种液，加入含2%FBS的新鲜培养基。在与之前相同的条件下培养三至四天。当细胞病变效应（CPE）达到约75%时，收集组织培养上清液，离心以去除细胞碎片。然后，收集含有重组寨卡病毒的上清液，弃去沉淀。将上清液分装至冻存管中。将冻存管放入冻存盒，于负80摄氏度保存。准备就绪后，从冰箱中取出一份病毒等分试样，并按照文本方案中所述的噬斑试验测定病毒滴度。在本研究中，通过使用传统克隆方法及病毒基因组中存在的独特限制性酶切位点，将四个相互重叠的cDNA片段依次克隆至细菌人工染色体pBeloBAC11中，从而构建出寨卡病毒株Rio Grande do Norte Natal的稳定全长cDNA克隆。该全长cDNA克隆在5′端由人巨细胞病毒启动子 flank，以便在转染细胞的细胞核中表达病毒RNA；在3′端则由乙型肝炎delta病毒核酶以及随后的牛生长激素终止子和多聚腺苷酸化序列 flank，以产生具有精确病毒基因组3′端序列的RNA。一旦完成BAC cDNA的构建，即可通过阳离子脂质体将BAC cDNA克隆直接转染易感的Vero细胞，从而轻松回收具有感染性的病毒。采用该方法，可拯救出滴度高于每毫升一百万空斑形成单位的寨卡病毒RGN株。此外，所拯救的病毒可诱导明显的细胞病变效应，并产生大小约为2毫米的均一空斑。通过使用针对寨卡病毒E蛋白的特异性单克隆抗体进行免疫荧光分析，确认拯救病毒的身份。总体而言，这些结果表明，可从在细菌人工染色体（BAC）中组装的全长cDNA克隆中成功拯救出具有感染性的重组寨卡病毒。总之，我们建立了一种基于细菌人工染色体的高效寨卡病毒反向遗传学方法，该方法可被改造用于生成其他正链RNA病毒cDNA克隆的稳定且具有功能的感染，从而促进对病理机制的研究、疫苗开发，以及有助于鉴定具有抗病毒活性的药物。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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