从鸡蛋蛋黄中分离脂蛋白颗粒以研究细菌病原体脂肪酸向膜磷脂的掺入

本方案为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是金黄色葡萄球菌）提供了框架。该方案采用无偏倚的脂质组学分析，并利用从鸡蛋蛋黄中分离的脂蛋白颗粒作为复杂脂肪酸的经济来源，以定量测定脂肪酸在细菌脂质中的掺入情况。本文所述的质谱技术可前所未有地揭示金黄色葡萄球菌脂质的脂肪酸谱型，也可经调整后用于研究其他细菌膜。

进行该方案时，需注意每一步分级分离过程，以鉴定并保留含LDL的组分。从血浆组分中去除硫酸铵对于LDL的后续应用至关重要。透析过程中应确保透析管内有足够空间，并根据需要及时更换透析液，以保证透析效果。

首先，用30毫升无菌磷酸盐缓冲液将两个蛋黄清洗两次，以去除残留的卵白蛋白。用无菌移液器吸头刺破卵黄膜，将膜内含物排入无菌的50毫升锥形离心管中。向蛋黄中加入约24至30毫升、pH为7的17摩尔氯化钠溶液，并剧烈混合。

然后将试管置于摇床上，在 4 摄氏度条件下混匀 60 分钟。在 10 摄氏度下以 10,000 ×g 离心 45 分钟，离心蛋黄稀释液。将上清液血浆组分转移至无菌的 50 毫升锥形管中，留下沉淀的颗粒组分。

再次离心。首先，在4°C条件下，将血浆组分与40倍体积百分比的硫酸铵在摇床或类似装置上混合，持续60分钟。调节pH后，在4°C、10,000 × g条件下离心血浆组分，持续45分钟。

将上层半固体状黄色部分移入七千道尔顿孔径的透析管中。透析管内需预留至少25%的额外空间，以容纳其膨胀。将透析管置于三升超纯水中，在三摄氏度下透析过夜，以去除硫酸铵。

透析后，按照先前所述方法在4°C下离心溶液。小心将上层黄色半固体部分转移至无菌管中，并在4°C下保存。培养过夜后，将500 µL培养物转移至两个含有49.5 mL 1%胰蛋白胨肉汤的无菌250 mL带挡板锥形瓶中。

在37摄氏度下振荡培养约四小时，以达到对数中期。将100毫升培养物以25毫升为增量分装至四个无菌的50毫升离心管中，并将这四个离心管在10,000 × g条件下离心，使细胞沉淀。弃去上清液，并将每一份细胞沉淀重新悬浮于750微升1%胰蛋白胨培养基中。

将四个750微升的细胞悬液合并到一个15毫升离心管中。然后将350微升细胞悬液分装至六个无菌的1.5毫升离心管中。使用移液器向每个1.5毫升离心管中加入30微升低密度脂蛋白（LDLs），以达到5%的终浓度，并在37摄氏度下振荡孵育4小时。

在 4 摄氏度、16,000 ×g 条件下离心培养物 2 分钟。用 330 µL 无菌磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀以进行洗涤。重复此洗涤步骤一次。

通过减去空管的重量，记录六个湿细胞沉淀的重量。将细胞沉淀在干冰上迅速冷冻。首先在每个细胞沉淀上加入一勺5毫米的氧化锆珠。

将740微升预冷至-80摄氏度的75% HPLC级甲醇直接加入每个试管中。然后加入2微升50微摩尔的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱作为内标。将含有1.5毫升离心管的样品放入子弹式混匀仪组织匀浆器的可用孔位中。

以低速均质化样品，设置转速为2至3，持续3分钟。目视检查样品的均匀性。

如果可见细胞团块，则继续在子弹式匀浆器中以两分钟为间隔进行匀浆。随后在化学通风橱中向每个样品加入270 µL氯仿。剧烈涡旋振荡样品30分钟。

将样品在台式离心机中以至少2,000 ×g的离心力离心最多30分钟。在化学通风橱中，收集单相上清液并转移至新的试管中，注意避免触及提取管底部的蛋白质沉淀。将先前制备的稀释脂质提取物转移至合适的自动进样瓶中。

对于基于流动注射的分析，将自动进样瓶置于具备毛细管流速应用能力的高效液相色谱系统温控自动进样器中。根据论文所述设置高效液相色谱系统。流动相通过配有低流速34号金属针的电喷雾离子源，从高效液相色谱传输管路引入质谱仪。

在 Thermo Tune Plus 仪器控制软件中，将电离电压设置为 4,000 伏特，鞘气设置为 5。同样，将毛细管温度设置为 150 摄氏度，S-透镜设置为 50%。单击“定义扫描”按钮，在分析器菜单中选择 FTMS。将质量范围字段设置为正常，在分辨率字段中选择 100,000。

确保扫描类型设置为全扫描。在扫描范围菜单下，第一个质量字段中输入 200，最后一个质量字段中输入 2,000。在进一步定义观测质量精度后，对总离子色谱图中宽峰范围内的信号进行平均。

在质谱图查看窗口中右键单击图钉图标，然后选择“查看谱图列表”。从同一菜单中选择“显示选项”，然后在显示菜单中勾选“所有峰”复选框。单击“确定”按钮以关闭查看窗口。

再次右键单击质谱图查看窗口中的图钉图标，然后选择“复制到剪贴板精确质量”。将导出的数据粘贴至新 Excel 工作表的第一个工作表的 A1 单元格中，并按照手稿说明进行后续操作。为了进行基于精确质量的脂质鉴定，请打开 LIMSA 软件。

在主菜单中，从谱图类型菜单下选择峰列表。根据质谱数据采集时的极性，选择正离子模式或负离子模式。在半峰全宽及电荷数（z）窗口中，输入用于峰检测的目标质量搜索范围。

本方案中，通过沉淀30至40千道尔顿的β浮素，进一步富集血浆组分中的低密度脂蛋白（LDL）含量。在140、80、65、60和15千道尔顿处出现的蛋白条带与低密度脂蛋白的载脂蛋白相对应。在无脂肪酸培养基中，三氯生处理可抑制金黄色葡萄球菌的生长。

虽然通过添加蛋黄血浆作为外源性脂肪酸来源可克服三氯生诱导的生长抑制。类似地，向三氯生处理的培养物中补充富含低密度脂蛋白（LDL）的蛋黄可恢复其生长。此外，添加蛋黄低密度脂蛋白（LDL）能够支持一种先前已表征的金黄色葡萄球菌（S. aureus）脂肪酸营养缺陷型菌株的生长。

采用流动注射高分辨精确质量质谱法测定了1%胰蛋白胨肉汤或鸡卵黄低密度脂蛋白（LDL）中的前脂肪酸含量。检测到的游离脂肪酸含量极低。对丰富的金黄色葡萄球菌膜磷脂进行正交偏最小二乘判别分析，结果显示未处理组与鸡卵黄LDL处理组之间存在明显的类别分离，并揭示了两组间脂肪酸组成的差异。

从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDLs）可为研究细菌病原体与宿主脂蛋白之间的相互作用提供一种成本低廉的复杂脂肪酸来源。制备脂质提取物过程中使用的氯仿和甲醇具有危害性。请务必在化学通风橱中使用这些试剂，并妥善收集所有废液。