Name: 从鸡蛋黄中分离脂蛋白颗粒,研究细菌病原体脂肪酸并入膜磷脂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 学习从鸡蛋黄中分离脂蛋白颗粒的方法，用于研究金黄色葡萄球菌膜磷脂的脂肪酸并入机制。该方案结合质谱技术为细菌脂质组学分析提供可靠框架。

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我们感谢Hammer实验室的成员对本文稿的批判性评价以及对本工作的支持。科罗拉多大学医学院的Alex Horswill博士惠赠菌株AH1263。密歇根州立大学Chris Waters实验室提供了试剂。本工作由美国心脏协会资助项目16SDG30170026及密歇根州立大学启动资金支持。

注意：以下从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）颗粒的实验方案源自 Moussa 等人 2002 年的研究33。
1. 准备鸡蛋黄以富集低密度脂蛋白颗粒
<ol>
	<li>用70%乙醇溶液清洗两个大型鸡蛋的蛋壳以进行消毒，并使其自然风干。</li>
	<li>使用70%乙醇溶液对蛋清分离器进行消毒，并使其自然风干。将蛋清分离器固定在中等大小烧杯的边缘。</li>
	<li>将每个鸡蛋单独打入蛋清分离器中，使蛋清流入烧杯，完整的蛋黄则被分离器保留。</li>
	<li>用30 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗蛋黄两次，以去除残留的蛋清。</li>
	<li>将蛋黄轻轻放置在滤纸上。</li>
	<li>用无菌移液器吸头刺破卵黄膜，将膜内内容物排入无菌的50 mL锥形离心管中。弃去卵黄膜和滤纸。</li>
</ol>
2. 从鸡蛋蛋黄中分离含低密度脂蛋白（LDL）的血浆组分
<ol>
	<li>向蛋黄中加入约两倍体积的 0.17 M NaCl（pH 7.0），并剧烈混合。然后在 4 °C 下搅拌该溶液 60 分钟。</li>
	<li>在 10 °C 下以 10,000 x g 离心蛋黄稀释液 45 分钟。将血浆组分（上清液）从颗粒组分（沉淀）中分离，转移至无菌的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>重复步骤 2.2。</li>
</ol>
3. 从血浆中分离低密度脂蛋白颗粒
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，将血浆组分与 40%（w/v）硫酸铵混合，持续 60 分钟。</li>
	<li>使用 420 mM 氢氧化钠溶液将血浆组分的 pH 值调节至 8.7。</li>
	<li>在 4 °C、10,000 × g 条件下离心蛋黄稀释液 45 分钟。将上层半固体黄色组分转移至孔径为 7 kDa 的透析管中，并在管中预留空间以允许其膨胀。</li>
	<li>在 3 L 超纯水中于 4 °C 透析过夜，以去除硫酸铵。使用搅拌子轻轻搅动水。</li>
	<li>将透析后的溶液转移至无菌的 50 mL 锥形离心管中。</li>
	<li>在 4 °C、10,000 × g 条件下离心该溶液 45 分钟。小心地将上层半固体黄色组分转移至无菌管中，并在 4 °C 下保存。</li>
</ol>
4. 评估鸡 LDL 作为脂肪酸来源
<ol>
	<li>将S. aureus细胞接种于5 mL无脂肪酸的1%胰蛋白胨肉汤中，于37 °C振荡培养（225 rpm）过夜。对于脂肪酸营养缺陷型菌株，需在培养基中添加脂肪酸来源进行补充。</li>
	<li>将过夜培养物用1%胰蛋白胨肉汤稀释至600 nm处的光密度（OD600）为0.1。用移液器将50 μL菌液加入圆底96孔板的每个孔中。 
	注意：处理脂肪酸营养缺陷型菌株时，在测定菌液OD值前，需用两倍体积的胰蛋白胨肉汤洗涤过夜培养物，并重悬于5 mL胰蛋白胨肉汤中，以减少脂肪酸的残留。</li>
	<li>对于未处理对照组所在的孔，每孔加入50 µL 1%胰蛋白胨肉汤。</li>
	<li>对于含有实验组菌悬液的孔，每孔加入50 µL含有10%卵黄来源低密度脂蛋白（LDL）、2 μM三氯生，或同时含有10%卵黄来源LDL和2 μM三氯生的1%胰蛋白胨肉汤。 
	注意：此时每个孔的总体积为100 μL，卵黄来源LDL和三氯生的终浓度分别为5%和1 µM。</li>
	<li>使用设定为37 °C并带有连续线性振荡功能的酶标仪，随时间测定OD600以监测细菌生长情况。</li>
</ol>
5. 用于膜脂质分析的S. aureus与低密度脂蛋白（LDLs）孵育。
<ol>
	<li>将分离的单菌落接种于5 mL无脂肪酸的1%胰蛋白胨液体培养基中，37 °C、225 rpm振荡培养过夜。</li>
	<li>将过夜培养物按1:100比例稀释，接种于含50 mL 1%胰蛋白胨液体培养基的无菌250 mL带挡板三角瓶中，37 °C振荡培养至对数中期（约4小时）。</li>
	<li>取25 mL培养物转移至无菌50 mL离心管中，离心收集菌体。弃上清，将菌体沉淀重悬于750 µL 1%胰蛋白胨液体培养基中。</li>
	<li>将重悬后的菌液混合均匀，分装300 µL至无菌1.5 mL离心管中。</li>
	<li>加入低密度脂蛋白（LDLs）至所需终浓度，37 °C、225 rpm振荡孵育4小时。</li>
	<li>4 °C、16,000 x g 离心2分钟，收集菌体，用两倍体积无菌PBS洗涤菌体沉淀，重复一次。</li>
	<li>称量每份湿菌体沉淀的重量。将菌体沉淀在干冰或液氮中迅速冷冻，于-80 °C保存，或直接进入第6节操作。</li>
</ol>
6. 提取 S. aureus 膜脂质
<ol>
	<li>将冻存的 S. aureus 细胞沉淀置于干冰上。在每个细胞沉淀上加入0.5 mm的氧化锆珠，珠子的体积大约等于细胞沉淀的体积。 
	注：作为该脂质提取方法的替代方案，研究人员可以采用已确立的Bligh和Dyer法或Folch法从细菌细胞中精确提取脂质34。</li>
	<li>向细胞沉淀中直接加入740 µL预冷至-80 °C的75%甲醇（HPLC级）。</li>
	<li>每1 mg细胞加入2 μL用甲醇配制的50 µM二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱作为内标。盖紧试管，将含有各样品的1.5 mL离心管插入Bullet Blender组织匀浆仪的可用孔位中。以低速（设定2-3级）匀浆3分钟。</li>
	<li>目视检查样品的均一性。若可见细胞团块，则在Bullet Blender中继续匀浆，每次增加2分钟。</li>
	<li>从Bullet Blender中取出样品，转移至化学通风橱中。</li>
	<li>向每个样品管中加入270 µL氯仿。剧烈涡旋震荡样品30分钟。 
	注意：氯仿可能具有致癌性。</li>
	<li>在台式离心机中以至少2,000 x g 离心最多30分钟。若使用兼容的离心管，可采用更高速度，并将离心时间缩短至10分钟。</li>
	<li>在化学通风橱中，收集单相上清液并转移至新的试管中，注意避免吸入提取管底部的蛋白沉淀。</li>
	<li>向蛋白沉淀中加入740 µL 75%甲醇（HPLC级）和270 µL氯仿，按照上述步骤6.6–6.8所述方法重新提取每个样品。将第二次提取所得的上清液与之前收集的上清液合并。</li>
	<li>在惰性气体（如氮气或氩气）气流下或使用离心浓缩仪（材料表）在真空条件下蒸发提取溶剂。</li>
	<li>用1.0 mL水相10 mM碳酸氢铵溶液洗涤干燥的脂质提取物三次，并按照步骤6.10的方法重新干燥样品。</li>
	<li>将干燥的脂质提取物重悬于合适的非极性溶剂（如异丙醇）中。根据步骤5.7测定的每1 mg新鲜细胞重量使用20 µL溶剂重悬样品。或者，若细胞沉淀重量未知，则将样品重悬于200 µL异丙醇中，并继续进行第7节操作。</li>
</ol>
7. 分析 S. aureus 使用高分辨率/高精度质谱法进行脂质谱分析
<ol>
	<li>在进行完整的脂质分析之前，从实验组中选取具有代表性的测试样品，并在一系列样品稀释倍数下进行分析，以确定样品总脂质浓度处于质谱仪检测器响应线性范围内的稀释范围，具体方法如前所述35。</li>
	<li>将用于脂质分析的各样品脂质提取液等分试样在惰性气体下或使用离心浓缩仪在真空条件下干燥，以蒸发溶剂（材料表）。</li>
	<li>将每份干燥的脂质提取物重新悬浮于含有20 mM甲酸铵的液相色谱-质谱（LC-MS）级异丙醇:甲醇（2:1, v:v）溶液中，所用体积应相当于步骤7.1中确定的最佳样品稀释倍数。</li>
	<li>对于非靶向脂质分析，样品可通过流动注射或直接进样方式直接引入高分辨/准确质量质谱平台，无需色谱分离35,36。将步骤7.3中制备的稀释脂质提取液转移至合适的自动进样瓶或96孔板中。</li>
	<li>对于基于流动注射的分析，将自动进样瓶放入可进行毛细管/低流速应用的高效液相色谱（HPLC）系统（材料表）的温控（15 °C）自动进样器中，该系统需配备电子流量比例调节和流量监测装置。</li>
	<li>用含有20 mM甲酸铵的LC-MS级异丙醇:甲醇（2:1, v:v）填充HPLC溶剂储液瓶。</li>
	<li>使用Agilent Chemstation软件，设置HPLC自动进样器进行5 µL样品进样。在仪器菜单中选择设置进样器，在“进样体积”字段中输入5.0，单位为微升。确保HPLC设置为等度洗脱，流动相为含20 mM甲酸铵的2:1（v:v）异丙醇:甲醇，流速为1 µL/min。</li>
	<li>在Chemstation的仪器菜单中选择设置泵…，然后选择微流模式切换开关。</li>
	<li>在时间表字段中输入：时间 0.00，100% B，流速 1.0。按回车键，并通过输入时间 10.0，100% B，流速 1.0创建第二行时间表。点击设置泵菜单底部的确定按钮。这些设置将实现10次分析运行，流速为1.0 µL/分钟。</li>
	<li>使用配备低流速（34 G）金属针的电喷雾电离源，将HPLC传输管线中的洗脱液引入质谱仪。</li>
	<li>使用Thermo Tune Plus仪器控制软件，选择设置菜单并选择加热式ESI源。在对话框的相应字段中输入离子化电压为4000 V，鞘气为5（任意单位）。同样地，将毛细管温度设为150 °C，S透镜设为50%。 
	注意：这些参数需针对每种质谱平台进行优化。</li>
	<li>对于非靶向脂质分析，使用高分辨/准确质量质谱平台（材料表）作为检测器。</li>
	<li>使用Thermo Tune Plus软件，点击定义扫描按钮，在分析器菜单中选择FTMS。将质量范围字段设为正常，在分辨率字段中选择100,000。确保扫描类型设置为全扫描。在扫描范围菜单下，在起始质量（m/z）字段中输入200，在终止质量（m/z）字段中输入2000。</li>
	<li>确保使用负离子模式以检测最丰富的S. aureus脂质。</li>
	<li>为确认脂质结构及脂肪酸组成，重复样品分析，采用离子映射串联质谱（MS/MS）对目标质谱区域内所有脂质离子进行碎裂分析。或者，在第8节完成初步脂质鉴定后，可对感兴趣的特定脂质离子进行MS/MS分析。</li>
</ol>
8. 数据库搜索以鉴定内源性S. aureus和外源性LDL来源的脂质
<ol>
	<li>使用 Thermo Xcalibur 软件进一步优化观测质量精度。在 Xcalibur 中，位于 工具 菜单，选择 离线重新校准。在 离线重新校准 窗口打开后，通过选择要重新校准的质谱文件进行加载 文件 菜单并选择 开放 选项</li>
	<li>打开感兴趣的文件，切换 插入行 单击视图窗口顶部的按钮，查看质谱运行的总离子色谱图。在总离子色谱图中，用鼠标左键单击所观测信号峰的一侧边缘，然后将鼠标拖动至峰最宽处，以对采集到的质谱信号进行平均。</li>
	<li>在……之下 扫描滤光片 菜单中，选择对应于全扫描质谱数据的滤镜。加载一个参考文件，其中包含至少三种已知物质的理论单同位素质量 S. aureus 通过选择内源性脂质 加载参考… 按钮并选择参考文件。检查 使用 每个脂质单一同位素质量旁的方框。</li>
	<li>点击 搜索 查看窗口底部的按钮。像之前一样，在总离子色谱图的信号峰范围内重新对质谱信号进行平均。</li>
	<li>点击 转化 视图窗口底部附近的按钮。当 转化 对话框打开后，单击 好的如果数据是在非赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）的质谱平台采集的，则省略此步骤。</li>
	<li>使用 Xcalibur 软件，将每个未经处理或经 LDL 处理的样品的重新校准精确质量峰列表导出至 Excel 文件的不同工作表中。选择 Qual Browser 图标。通过选择感兴趣的重新校准文件来打开该文件 文件 菜单并选择 打开… 选项</li>
	<li>按照第8.2步所述，对总离子色谱图中宽峰范围内的信号取平均值。</li>
	<li>右键单击质谱图查看窗口中的图钉图标，然后选择 查看 | 光谱列表. 从同一菜单中选择 显示选项 然后 所有峰 切换框中的 显示 菜单。单击 好的 关闭查看窗口按钮。</li>
	<li>再次右键单击质谱图查看窗口中的图钉图标，然后选择 导出 | 剪切板（精确质量）将导出的数据粘贴到新 Excel 工作簿第一个工作表的 A1 单元格中。</li>
	<li>删除导出数据文件的前8行文本，使得Excel电子表格的A1单元格包含质谱中的第一个质荷比数据点。对每个重新校准的质谱文件重复导出操作，每个导出的峰列表使用Excel文件中的一个新工作表。</li>
	<li>使用脂质质谱分析（LIMSA）软件37 Excel 加载项，构建包含已知分子式的数据库 S. aureus 如 Hewelt-Belka 等人所述的脂质种类. 201438以及可能存在于LDL中的脂质种类的分子式。 
	注意：此外，在数据库中应考虑包含可能的分子式，以涵盖已整合主要低密度脂蛋白脂肪酸（如油酸（18:1）和亚油酸（18:2））的假定细菌脂质。32.</li>
	<li>构建数据库时，打开一个空白的 Excel 工作表。在第一个工作表的 A1 单元格中，输入待添加至数据库的脂质种类的理论/计算单同位素质量，该质量对应于质谱仪中检测到的脂质种类离子状态的质量。在 B1 单元格中，输入该脂质种类的名称，例如 PG(34:0)。</li>
	<li>在 C1 单元格中输入脂质种类的分子式，该分子式需对应质谱仪中观察到的脂质离子状态。在 D1 单元格中输入质谱仪中观察到的脂质种类电荷数。移至 A2 单元格，开始输入下一个待录入可搜索数据库的脂质种类新条目。</li>
	<li>重复步骤 8.12 和 8.13，直至所有目标脂质种类均已录入数据库。保存数据库文件，并保持其在 Excel 中打开状态。</li>
	<li>在 Excel 中，选择 加载项 菜单中选择 LIMSA 启动LIMSA软件。从主菜单中，点击 化合物库 按钮。在出现的新窗口中，单击 导入化合物这将上传化合物数据库，供LIMSA软件使用。</li>
	<li>根据厂商说明，使用 Excel 的 LIMSA 软件插件对所有质谱谱图进行基于精确质量数的脂质鉴定35从 LIMSA 主菜单中选择 峰列表 在……之下 光谱类型 菜单。选择 正离子模式 或 负离子模式 以匹配质谱数据采集时的极性。</li>
	<li>在 峰宽半高（m/z） 窗口，输入峰检测所需的质荷比搜索范围。对于高分辨率/精确质量的质谱数据，建议采用0.003–0.005 m/z的质荷比容差搜索窗口。</li>
	<li>在 灵敏度 窗口中输入所需的基线截断值（例如，0.01% 相对丰度）。在 同位素校正 菜单，选择 线性拟合 或 减去 算法，两者均可与峰列表数据一起使用。</li>
	<li>通过点击数据库搜索中要包含的目标脂质种类来高亮显示脂质化合物 可获取的化合物 窗口。单击 添加 单击按钮，将高亮的脂质种类添加到搜索组中。</li>
	<li>通过点击添加的化合物并更改内部标准 浓度 对应内标物浓度的窗口</li>
	<li>确保内标物与待定量的目标脂质种类属于相同的类别名称，方法是选择每种添加的脂质种类和内标物，并在“类别”字段中输入类别名称（如 PG 或 Lipid）。</li>
	<li>要保存可搜索的脂质化合物组以供将来使用，请点击 保存 按钮旁边的下一个 组别 菜单</li>
	<li>确保包含所有导出的质谱峰列表的 Excel 文件已打开，并显示对应于第一个的表格 S. aureus MS 运行，然后单击 搜索 从 LIMSA 主菜单中点击按钮。 
	注意：LIMSA 数据库搜索结果将包含与步骤 8.12–8.13 中构建的数据库中脂质相匹配的质谱特征列表，以及在对一个或多个选定的内标进行归一化后，每个匹配特征的浓度。</li>
	<li>使用 Xcalibur 软件分析对应于目标脂质离子的 m/z 准确质量 MS/MS 谱图，以确认各鉴定脂质分子种类中存在的脂肪酸组成成分。选择 Qual Browser 打开感兴趣的MS/MS文件，方法是选择 文件 下拉菜单并选择 打开… 选项</li>
	<li>在质谱图查看窗口中，通过右键单击图钉图标，选择与目标脂质 m/z 的 MS/MS 分析相对应的扫描过滤器 范围 从菜单中。在出现的新窗口中，选择 过滤 菜单中选择扫描。</li>
	<li>对总离子流色谱图中的信号进行平均，具体操作如步骤8.2所述。使用MetaboAnalyst（www.metaboanalyst.ca）软件进行适当的统计学检验。评估具有统计学意义的差异 S. aureus 通过比较未经处理和经LDL处理条件下标准化后的脂质丰度来分析脂质组成。</li>
</ol>

作者无披露信息。

S. aureus 可将外源性脂肪酸整合到其膜磷脂中27,32,43。利用外源性脂肪酸进行磷脂合成可绕过FASII的抑制作用，但也会改变膜的生物物理特性27,32,44。尽管外源性脂肪酸整合入革兰氏阳性病原菌磷脂的过程已有充分记载，但关于宿主脂肪酸储存库的具体身份，以及外源性脂肪酸整合后对金黄色葡萄球菌三种主要磷脂类型的结构改变，目前仍存在研究空白。本文描述了可用于以下目的的实验方案：i）从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）颗粒，作为脂肪酸来源；ii）测定外源性脂肪酸对S. aureus生长的影响；以及iii）采用非偏倚的脂质组学分析方法，监测外源性脂肪酸在S. aureus膜磷脂中的整合情况。本研究提供的先进质...

耐甲氧西林S. aureus（MRSA）是医疗机构相关感染的首要致病原因，其伴随的抗生素耐药性构成了重大的临床挑战1,2,3。因此，开发新型治疗策略具有高度优先性。针对革兰氏阳性病原菌的一种有前景的治疗策略是抑制脂肪酸合成，该过程是膜磷脂生成所必需的，在S. aureus中包括磷脂酰甘油（PG）、赖氨酰-PG和心磷脂4。在细菌中，脂肪酸的生成通过脂肪酸合成II途径（FASII）进行5，该途径与真核生物中的对应途径存在显著差异，使得FASII成为抗生素开发的有吸引力靶点5,6。FASII抑制剂主要靶向FabI，即脂肪酸碳链延长所必需的一种酶7。FabI抑制剂三氯生被广泛用于消费品和医疗用品中8,9。多家制药公司正在开发其他FabI抑制剂，用于治疗S. aureus感染10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。然而，许多革兰氏阳性病原菌（包括S. aureus）能够摄取外源性脂肪酸用于磷脂合成，从而绕过FASII的抑制作用27,28,29。因此，由于我们对宿主脂肪酸来源以及病原体从宿主提取脂肪酸的机制仍存在显著认知空白，FASII抑制剂的临床潜力仍存在争议27,28。为填补这些空白，我们开发了一种无偏倚的脂质组学分析方法，用于监测S. aureus膜磷脂中外源性脂肪酸从脂蛋白颗粒中的整合情况。
在脓毒症期间，宿主脂蛋白颗粒可作为血管系统内宿主来源脂肪酸的潜在来源，因为大多数宿主脂肪酸均与这些颗粒相关30。脂蛋白由磷脂和蛋白质组成的亲水性外壳包裹着甘油三酯和胆固醇酯的疏水性核心构成31。宿主产生四类主要的脂蛋白——乳糜微粒、极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白（LDL），它们作为脂质运输载体，通过血管系统将脂肪酸和胆固醇递送至宿主细胞或从宿主细胞运出。LDL富含酯化脂肪酸，包括甘油三酯和胆固醇酯31。我们先前已证明，高度纯化的人源LDL可作为PG合成所需的外源性脂肪酸的有效来源，从而提供一种FASII抑制剂绕过机制32。纯化人源LDL在技术上具有挑战性且耗时较长，而商业来源的纯化人源LDL价格昂贵，难以常规使用或用于大规模细菌筛选。为克服这些局限性，我们改进了一种从鸡卵黄中富集LDL的方法，卵黄是脂蛋白颗粒的丰富来源33。我们已成功利用非靶向、高分辨率/精确质量质谱及串联质谱技术，监测人源LDL来源的脂肪酸掺入S. aureus细胞膜的过程32。与以往报道的方法不同，该方法可对三种主要葡萄球菌磷脂类型的每一种中的单个脂肪酸异构体进行定量。油酸（18:1）是一种不饱和脂肪酸，存在于所有宿主脂蛋白颗粒中，并可被S. aureus readily 掺入其磷脂中29,30,32。S. aureus无法自身合成油酸29；因此，磷脂中掺入的油酸含量可反映葡萄球菌细胞膜中存在宿主脂蛋白来源的脂肪酸29。这些磷脂种类可通过本文所述的先进质谱方法进行鉴定，从而以前所未有的分辨率揭示S. aureus在感染过程中可能遇到的脂肪酸来源存在条件下培养时的细胞膜组成。

<table><tbody><tr><td>硫酸铵</td><td>Fisher</td><td>BP212R-1</td><td>&amp;ge;99.5% 纯度</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Thermo</td><td>MaxQ 6000</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td>Sorvall Legen XTR，转子 F14-6x250 LE</td></tr><tr><td>Costar 检测板</td><td>Corning</td><td>3788</td><td>96 孔</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Schleicher &amp; Schuell</td><td>597</td><td></td></tr><tr><td>大型鸡卵</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>普通市售鸡蛋</td></tr><tr><td>微孔板分光光度计</td><td>BioTek</td><td>Epoch 2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus 菌株 AH1263</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>由科罗拉多大学 Alex Horswill 提供</td></tr><tr><td>透析管</td><td>Pierce</td><td>68700</td><td>截留分子量 7,000</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Becton, Dickison and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 氧化锆珠</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender 匀浆仪</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（LC-MS 级）</td><td>Fisher</td><td>A4561</td><td></td></tr><tr><td>氯仿（试剂级）</td><td>Fisher</td><td>MCX10559</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（LC-MS 级）</td><td>Fisher</td><td>A4611</td><td></td></tr><tr><td>二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>&amp;ge;99.5% 纯度</td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Sigma</td><td>70221-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 软件</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-30801</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velos 质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>高分辨率/精确质量质谱</td></tr><tr><td>Agilent 1260 毛细管高效液相色谱仪</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 真空浓缩仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从鸡蛋蛋黄中分离脂蛋白颗粒以研究细菌病原体脂肪酸向膜磷脂的掺入

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Staphylococcus aureus 及其他革兰氏阳性病原菌可将环境中存在的脂肪酸整合到膜磷脂中。在感染过程中，外源性脂肪酸主要存在于宿主的脂蛋白颗粒内。目前尚不明确宿主脂肪酸的具体储存库，以及细菌从脂蛋白颗粒中获取脂肪酸的作用机制。本研究中，我们描述了从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）颗粒的实验方案，并验证LDL是否可作为S. aureus的脂肪酸来源。该方法利用非偏向性脂质组学分析和鸡源LDL——一种研究LDL与细菌相互作用的有效且经济的模型系统。通过高分辨率/精确质量质谱和串联质谱技术，分析S. aureus从LDL中整合外源性脂肪酸的情况，从而表征细菌膜的脂肪酸组成，并非偏向性地鉴定细菌膜脂质在暴露于LDL后所产生的新型脂肪酸组合。这些先进的质谱技术能够揭示被整合至磷脂中的特定外源性脂肪酸，为研究脂肪酸的摄取提供了前所未有的视角。本文所述方法可推广应用于其他细菌病原体及复杂脂肪酸不同来源的研究。

从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）的实验方案如图1所示。该过程首先用生理盐水稀释全蛋黄，将蛋黄中的固体部分（称为颗粒）与含有LDL的可溶性或血浆组分分离（图1）33。通过沉淀分子量约为30–40 kDa的β-卵黄蛋白，可进一步富集血浆组分中的LDL含量（图2）33。在140、80、65、60和15 kDa处出现的蛋白条带与LDL的载脂蛋白相对应（图2）33,39。三氯生可在无外源脂肪酸的培养基中抑制S. aureus的生长32。我们先前已证明，在培养体系中添...

该方法为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是Staphylococcus aureus）提供了框架。为此，本文描述了从鸡蛋蛋黄中富集脂蛋白颗粒的方案，以及利用质谱技术对细菌磷脂进行脂肪酸谱分析的方法。

金黄色葡萄球菌及其他革兰氏阳性病原体可将环境中的脂肪酸整合到膜磷脂中。在感染过程中，……

本方案为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是金黄色葡萄球菌）提供了框架。该方案采用无偏倚的脂质组学分析，并利用从鸡蛋蛋黄中分离的脂蛋白颗粒作为复杂脂肪酸的经济来源，以定量测定脂肪酸在细菌脂质中的掺入情况。本文所述的质谱技术可前所未有地揭示金黄色葡萄球菌脂质的脂肪酸谱型，也可经调整后用于研究其他细菌膜。进行该方案时，需注意每一步分级分离过程，以鉴定并保留含LDL的组分。从血浆组分中去除硫酸铵对于LDL的后续应用至关重要。透析过程中应确保透析管内有足够空间，并根据需要及时更换透析液，以保证透析效果。首先，用30毫升无菌磷酸盐缓冲液将两个蛋黄清洗两次，以去除残留的卵白蛋白。用无菌移液器吸头刺破卵黄膜，将膜内含物排入无菌的50毫升锥形离心管中。向蛋黄中加入约24至30毫升、pH为7的17摩尔氯化钠溶液，并剧烈混合。然后将试管置于摇床上，在 4 摄氏度条件下混匀 60 分钟。在 10 摄氏度下以 10,000 ×g 离心 45 分钟，离心蛋黄稀释液。将上清液血浆组分转移至无菌的 50 毫升锥形管中，留下沉淀的颗粒组分。再次离心。首先，在4°C条件下，将血浆组分与40倍体积百分比的硫酸铵在摇床或类似装置上混合，持续60分钟。调节pH后，在4°C、10,000 × g条件下离心血浆组分，持续45分钟。将上层半固体状黄色部分移入七千道尔顿孔径的透析管中。透析管内需预留至少25%的额外空间，以容纳其膨胀。将透析管置于三升超纯水中，在三摄氏度下透析过夜，以去除硫酸铵。透析后，按照先前所述方法在4°C下离心溶液。小心将上层黄色半固体部分转移至无菌管中，并在4°C下保存。培养过夜后，将500 µL培养物转移至两个含有49.5 mL 1%胰蛋白胨肉汤的无菌250 mL带挡板锥形瓶中。在37摄氏度下振荡培养约四小时，以达到对数中期。将100毫升培养物以25毫升为增量分装至四个无菌的50毫升离心管中，并将这四个离心管在10,000 × g条件下离心，使细胞沉淀。弃去上清液，并将每一份细胞沉淀重新悬浮于750微升1%胰蛋白胨培养基中。将四个750微升的细胞悬液合并到一个15毫升离心管中。然后将350微升细胞悬液分装至六个无菌的1.5毫升离心管中。使用移液器向每个1.5毫升离心管中加入30微升低密度脂蛋白（LDLs），以达到5%的终浓度，并在37摄氏度下振荡孵育4小时。在 4 摄氏度、16,000 ×g 条件下离心培养物 2 分钟。用 330 µL 无菌磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀以进行洗涤。重复此洗涤步骤一次。通过减去空管的重量，记录六个湿细胞沉淀的重量。将细胞沉淀在干冰上迅速冷冻。首先在每个细胞沉淀上加入一勺5毫米的氧化锆珠。将740微升预冷至-80摄氏度的75% HPLC级甲醇直接加入每个试管中。然后加入2微升50微摩尔的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱作为内标。将含有1.5毫升离心管的样品放入子弹式混匀仪组织匀浆器的可用孔位中。以低速均质化样品，设置转速为2至3，持续3分钟。目视检查样品的均匀性。如果可见细胞团块，则继续在子弹式匀浆器中以两分钟为间隔进行匀浆。随后在化学通风橱中向每个样品加入270 µL氯仿。剧烈涡旋振荡样品30分钟。将样品在台式离心机中以至少2,000 ×g的离心力离心最多30分钟。在化学通风橱中，收集单相上清液并转移至新的试管中，注意避免触及提取管底部的蛋白质沉淀。将先前制备的稀释脂质提取物转移至合适的自动进样瓶中。对于基于流动注射的分析，将自动进样瓶置于具备毛细管流速应用能力的高效液相色谱系统温控自动进样器中。根据论文所述设置高效液相色谱系统。流动相通过配有低流速34号金属针的电喷雾离子源，从高效液相色谱传输管路引入质谱仪。在 Thermo Tune Plus 仪器控制软件中，将电离电压设置为 4,000 伏特，鞘气设置为 5。同样，将毛细管温度设置为 150 摄氏度，S-透镜设置为 50%。单击“定义扫描”按钮，在分析器菜单中选择 FTMS。将质量范围字段设置为正常，在分辨率字段中选择 100,000。确保扫描类型设置为全扫描。在扫描范围菜单下，第一个质量字段中输入 200，最后一个质量字段中输入 2,000。在进一步定义观测质量精度后，对总离子色谱图中宽峰范围内的信号进行平均。在质谱图查看窗口中右键单击图钉图标，然后选择“查看谱图列表”。从同一菜单中选择“显示选项”，然后在显示菜单中勾选“所有峰”复选框。单击“确定”按钮以关闭查看窗口。再次右键单击质谱图查看窗口中的图钉图标，然后选择“复制到剪贴板精确质量”。将导出的数据粘贴至新 Excel 工作表的第一个工作表的 A1 单元格中，并按照手稿说明进行后续操作。为了进行基于精确质量的脂质鉴定，请打开 LIMSA 软件。在主菜单中，从谱图类型菜单下选择峰列表。根据质谱数据采集时的极性，选择正离子模式或负离子模式。在半峰全宽及电荷数（z）窗口中，输入用于峰检测的目标质量搜索范围。本方案中，通过沉淀30至40千道尔顿的β浮素，进一步富集血浆组分中的低密度脂蛋白（LDL）含量。在140、80、65、60和15千道尔顿处出现的蛋白条带与低密度脂蛋白的载脂蛋白相对应。在无脂肪酸培养基中，三氯生处理可抑制金黄色葡萄球菌的生长。虽然通过添加蛋黄血浆作为外源性脂肪酸来源可克服三氯生诱导的生长抑制。类似地，向三氯生处理的培养物中补充富含低密度脂蛋白（LDL）的蛋黄可恢复其生长。此外，添加蛋黄低密度脂蛋白（LDL）能够支持一种先前已表征的金黄色葡萄球菌（S. aureus）脂肪酸营养缺陷型菌株的生长。采用流动注射高分辨精确质量质谱法测定了1%胰蛋白胨肉汤或鸡卵黄低密度脂蛋白（LDL）中的前脂肪酸含量。检测到的游离脂肪酸含量极低。对丰富的金黄色葡萄球菌膜磷脂进行正交偏最小二乘判别分析，结果显示未处理组与鸡卵黄LDL处理组之间存在明显的类别分离，并揭示了两组间脂肪酸组成的差异。从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDLs）可为研究细菌病原体与宿主脂蛋白之间的相互作用提供一种成本低廉的复杂脂肪酸来源。制备脂质提取物过程中使用的氯仿和甲醇具有危害性。请务必在化学通风橱中使用这些试剂，并妥善收集所有废液。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

从鸡蛋黄中分离脂蛋白颗粒,研究细菌病原体脂肪酸并入膜磷脂

来源：Armbruster, K. M., Meredith, T. C. 细菌脂蛋白的富集及用于质谱结构测定的N端脂肽制备。J. Vis. Exp.

利用非离子型去污剂相分离富集细菌脂蛋白

分离和表征革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的脂质A区域，有助于深入了解基于细胞表面的抗生素耐药机制、细菌存活与适应性，以及化学结构多样的脂质A分子如何差异性地调节宿主先天免疫反应。...

革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

介绍了两种分离细胞脂滴的方法，分别来自1）酵母细胞和2）人胎盘。这两种方法的核心步骤均为密度梯度离心，其中含有脂滴的上浮层可通过肉眼清晰观察，随后可被提取，并通过蛋白质印迹分析检测其纯度。...

从酵母细胞和人胎盘中分离细胞脂滴：两种纯化技术

利用Caco-2细胞研究肠道脂质转运

microRNA 发挥重要的调控作用，并正成为多种人类疾病的新型治疗靶点。已有研究表明，miRNA 可由高密度脂蛋白（HDL）携带。我们开发了一种简化方法，可快速从人血浆中分离出适用于 miRNA 分析的高纯度...

一种快速简化的高通量分离高纯度高密度脂蛋白中miRNA的方法

本文描述了使用非离子型表面活性剂相分离方法富集细菌脂蛋白，可直接用于Toll样受体（TLR）检测或其他应用。此外，还详细介绍了制备N端胰蛋白酶消化脂肽的后续步骤，以通过质谱法进行结构表征。...

细菌脂蛋白的富集及N端脂肽的制备用于质谱法结构鉴定

本方案建立了一种利用已成熟的小鼠内质网分离试剂盒，从小鼠肝脏中分离和纯化脂滴的新方法。...

使用成熟细胞器分离试剂盒快速分离脂滴的实验方案

已有多种方法用于分析血浆脂蛋白，但超速离心法仍是目前最常用且最可靠的方法之一。本文介绍一种通过逐级密度超速离心法从血浆中分离脂蛋白的方法，并阐述如何对载脂蛋白进行分析，以用于诊断和科研目的。...

通过超速离心法分离与分析血浆脂蛋白

本实验方案描述了一种从肉鸡胚胎脂肪组织中分离前脂肪细胞的简单方法。该方法能够高效地分离前脂肪细胞，并实现其原代培养和成脂分化。通过油红O染色以及脂质/DNA染色，检测了经分化培养基诱导后分离细胞的成脂能力。...

从肉鸡胚胎中分离前脂肪细胞

本实验方案详细描述了一种用于分离小鼠十二指肠内营养物质灌注后流动的肠淋巴液的外科手术方法。该方法可用于生理条件下测定总肠道脂质吸收以及乳糜微粒的合成与分泌情况，以响应不同实验性营养物质的刺激。...

小鼠肠系膜引流淋巴液的分离与定量 在体 内 膳食脂质吸收与乳糜微粒分泌的动力学

本文描述了测定高密度脂蛋白（HDL）从全人血浆或血清中的脂质供体颗粒特异性移除荧光磷脂量的实验方案。我们已证实，该HDL功能指标可预测心血管疾病的发生。...

高密度脂蛋白特异性磷脂外流检测法

学习从鸡蛋黄中分离脂蛋白颗粒的方法，用于研究金黄色葡萄球菌膜磷脂的脂肪酸并入机制。该方案结合质谱技术为细菌脂质组学分析提供可靠框架。

从鸡蛋蛋黄中分离脂蛋白颗粒以研究细菌病原体脂肪酸向膜磷脂的掺入

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