利用体内吞噬作用检测法评估果蝇Drosophila melanogaster的细胞免疫反应

这种体内吞噬作用检测方法可使研究人员进行基因筛选和全基因组关联研究，以鉴定调控成体血细胞吞噬作用的新基因。该实验具有定量性、操作简便，可用于活体动物中影响病原体识别、摄取和清除的宿主因子的筛选。使用拉针仪拉制薄壁玻璃毛细管后，用显微操作器在显微镜下固定针头，并使用5号精细不锈钢镊子将针尖折断至尖端直径约为100 µm。

为测量将要注射到每只果蝇体内的液体体积，先用无菌的含5%食用色素的PBS溶液填充毛细玻璃针，然后将液体排出至置于0.01毫米刻度载物台测微尺上的一滴矿物油中。将10微升浓度为1.6毫克/毫升的颗粒溶液滴加到一小块Parafilm膜上，并用毛细针吸取该液体。将毛细针安装至注射器喷嘴中，将麻醉后的果蝇按指定区域排列在果蝇操作垫上，腹面朝上，头部朝向操作垫前方。

将小瓶放置在实验台相应的区域，用液体对果蝇腹部上角进行五次、每次100毫秒的喷射，总共递送约10纳升的颗粒。每注射一只果蝇，立即将其转移至对应的收集小瓶中，并在小瓶上记录注射时间。接下来，用0.4%台盼蓝溶液装填新针头，并将气动注射器设置为门控模式，以使气流持续推动液体从针头中流出。

初次注射后30分钟，向每只果蝇的腹部注射台盼蓝，直至腹部充满并膨胀。用透明胶带将果蝇固定在显微镜载玻片上，腹面朝下，将翅膀推向果蝇两侧并粘在胶带上以固定。然后轻轻将头部压入胶带，确保果蝇不会移动。

在固定完所有果蝇后，立即将昆虫逐个置于倒置荧光显微镜下，使用连接的数码相机和计算机以25倍或32倍放大倍数进行成像，通过数码相机配套的计算机软件对准每只果蝇的背血管进行聚焦。随后，在不同实验之间记录曝光时间和放大倍数。为定量分析荧光信号，打开合适的图像分析软件，并载入一张图像。

为测量背血管的荧光强度，需在背血管周围绘制一个多边形，然后选择“测量”以记录该多边形区域内的荧光强度。为确定背景荧光强度，复制第一个多边形并将其移至每只果蝇背血管附近的区域，然后选择“测量”，记录背景区域的荧光强度。

为了通过背景荧光对背血管荧光进行归一化处理，在测量完其余果蝇的荧光强度后，将背血管荧光强度除以背景荧光强度，并计算同一品系所有果蝇的归一化背血管荧光强度的平均值。将果蝇腹面朝下固定在一段电工胶带上后，其腹部前两节（背血管所在位置）清晰可见。实验误差的主要来源出现在注射和成像步骤。

使用同一根针头对多只果蝇进行注射可能会导致针头被果蝇组织或颗粒堵塞。若果蝇未摄入足量的台盼蓝，则其整个腹部会呈现明亮的荧光，这会降低背血管与背景荧光的比值，从而减少动物体内真实的荧光强度比。果蝇应在二氧化碳麻醉下进行拍照，因为活动中的果蝇会产生模糊的图像，无法进行定量分析。

来自Zuker果蝇突变体库中经甲基磺酸乙酯处理的突变品系无法吞噬革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，在体内吞噬实验中，与同基因背景的Zuker品系及另一种常用实验室对照品系相比，其背血管荧光几乎完全缺失。需记录果蝇注射的时间和顺序，以确保成像时各果蝇处于相近的病原识别与摄取阶段。通过共聚焦显微镜观察单个血细胞，或结合荧光激活细胞分选，或利用磁珠分离成年果蝇血细胞，可进一步研究吞噬功能缺陷的分子机制。