小鼠肝外胆管有机体的产生
April 23rd, 2019
该方案描述了小鼠肝外胆管三维器官系统的产生。这些胆道有机物质可以维持在培养中, 以研究胆管细胞生物学。胆道有机体表达的标志物的祖先和胆道细胞, 是由偏振上皮细胞。
这种粘膜外肝胆管器官系统可以解决临床前胆管病变模型的有限获取，以及多能干细胞和肝衍生胆细胞器官模型的局限性。我们的模型是成人组织特异性，还原性，可重复性，时间和成本效益。它将对无法获得人体组织的实验室特别有利。
我们的技术允许培养几乎无限数量的肝胆管细胞，以研究组织再生和细胞对细胞的相互作用。演示程序将是 JunyaShiota， 一个博士后从我的实验室。对于肝内胆管隔离，将成年小鼠放在一个上部位置，然后沿中线打开腹腔。
缩回肝脏，在隔膜上休息，并使用半叶板轻轻拉近体十二指肠，以揭示肝脏下方常见的胆管。使用手术刀将外肝胆管与周围组织分离。用钳子握住普通胆管的近端，在从肝脏解剖导管的近端之前，先用十二指肠在它的交汇处上方解剖导管。
立即将分离的肝胆管放入玻璃板中，在冰上含有冷洗缓冲液，然后将胆管从周围组织和肉末清洁为0.5毫米部分。当所有组织都被切碎后，将部分转移到一个管子中，里面装着500微升分离缓冲液，在37摄氏度下孵育20分钟。在分离结束时，用500微升的冰冷细胞培养剂中和缓冲液，通过18量针将组织悬浮液三联，然后通过20个量程针进行20次三联。
然后通过70微米细胞滤株将产生的细胞悬浮液过滤到50毫升管中。建立胆道器官培养，通过离心收集细胞，并小心去除上经。将颗粒重新在一毫升冰冷的无菌PBS中，将细胞转移到1.5毫升管中进行第二次离心。
将洗净的颗粒重新放入120微升的液化、冰冷的基底基质和板40微升的细胞中，放入三口37摄氏度加热、24孔的孔的中心，然后将板放入37摄氏度的组织培养培养箱中约15分钟。当基底基质凝固后，在将板返回孵化器之前，将 600 微升 37 摄氏度的播种介质添加到每个井中。三天以后，每三天用600微升的新鲜有机体培养培养剂代替播种介质，用倒置显微镜定期监测器官生长。
要通过肝外胆管培养物，在每井将井内水管转移到单独的1.5毫升管之前，用每井400微升的冰冷PBS移液管。通过每个混合物通过25规格的针头四次分离器官，并通过离心收集细胞。然后以适当的比率重新镀金在地下室矩阵中重新暂停细胞。
对于长期的肝胆管有机物储存，用室温PBS清洗每井的有机体，而不干扰地下室基质滴，并在每井中加入500微升的冰冷冷冻介质。轻轻重新暂停器官，将混合物转移到单个低温小瓶中，然后将小瓶在零下80摄氏度下放置48小时，然后将器官转移到氮气罐中，在蒸汽相中长期储存。为了准备石蜡嵌入的器官，用500微升4摄氏度PBS代替介质，并将悬浮液从每口井转移到含有液化基质的1.5毫升管中。
通过离心收集器官，并使用经过修改的 P1000 移液器尖端小心去除超钠，而不会干扰颗粒。然后加入一毫升的冰冷，4%的副甲醛到器官中，在4摄氏度下过夜孵育。第二天早上，用一毫升室温PBS代替固定剂，在室温下孵育5分钟，用离心洗三次。
最后一次洗涤后，将有机物重新用一毫升30%乙醇在室温下孵育5分钟，随后在室温下将一毫升70%乙醇的5分钟孵育。在70%乙醇孵育结束时，通过离心收集器官，并在室温下将有机体重新在100%乙醇的一毫升中再加5分钟。在100%乙醇孵育结束时，在微波炉中加热样品加工凝胶20秒或直到液化，并将50微升的液化凝胶加入每管有机体。
将管子放在冰上，直到试样加工凝胶凝固，并将有机物的滴件从每个管转移到盒式纸盒中的蓝色海绵垫之间，在石蜡嵌入器中进一步加工。将盒式磁带放入每步编程15分钟的组织处理器中，然后将样品加工凝胶中的石蜡嵌入器官切成每节四微米，用于免疫组织化学染色和标准方案分析。与新生儿或成年小鼠分离时，肝胆管风管器官电镀效率约为2%。
第二次通过后，从成年小鼠中提取的肝胆管器官的电镀效率提高至11%，并保持稳定。大多数器官都表现出囊状形态，贯穿所有具有罕见不规则器官的通道。器官在五到七天内达到生长高峰，之后它们开始积累宫内碎片并恶化。
因此，为了维持器官培养，有机体应每7至10天分裂一次。当用免疫荧光分析时，肝外胆管器官由以E-cadherin标记的上皮细胞的纯种群组成。有机细胞也表现出胆道祖细胞的标记以及胆汁分化的标记。
重要的是，高比例的器官细胞拥有以乙酰化α图布林为标志的原发细胞，这是正常胆血管细胞的特征，并建议适当的器官细胞极化。需要密切遵守所述温度条件。细致的胆管解剖可防止胰腺细胞污染。
离心后通过仔细操作，可以避免细胞材料的流失。这些器官可以用作临床前模型，基因和药理处理，或用于测试药物和传染性物质的影响。这种方法可用于希望利用转基因小鼠模型进一步研究胆血管细胞生物学的机制的实验室。
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概述
本协议描述了小鼠肝外胆管三维类器官系统的生产。这些胆道类器官可以在培养中维持，以研究胆管细胞生物学，并由极化上皮细胞组成。
关键研究组件
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 器官模型
背景
- 对临床前胆管病模型的访问有限。
- 全能干细胞和肝衍生胆管细胞类器官模型的挑战。
- 对成人组织特异性和可重复的模型需求。
- 研究胆管细胞生物学的重要性。
研究目的
- 开发一个研究胆管细胞生物学的模型。
- 提供一种简化和成本效益的类器官培养方法。
- 为缺乏人体组织访问权限的实验室提供便利。
使用的方法
- 从成年小鼠中分离肝内胆管。
- 在培养中维持类器官。
- 研究组织再生和细胞间相互作用。
- 由博士后研究员演示该程序。
主要结果
- 成功生产胆道类器官。
- 类器官表达祖细胞和胆管细胞标记。
- 能够培养无限数量的胆管细胞。
- 研究胆管细胞生物学和相互作用的潜力。
结论
- 开发的类器官系统是胆管细胞研究的宝贵工具。
- 它解决了现有模型的局限性。
- 提供了一种研究胆管病的可重复方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol provides a reproducible, adult-tissue-specific model for studying cholangiocyte biology and cholangiopathies, addressing the limited availability of preclinical models for extrahepatic bile duct diseases. The system enables cost-efficient generation of organoids from wild-type and genetically engineered mice, supporting target validation and mechanistic de-risking in biliary disease research. It offers a scalable platform for drug screening and functional assays in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of biliary progenitor cell proliferation and differentiation pathways using a pure epithelial cell population.
- Operational Value: Supports pharmacological manipulation and genetic engineering to validate target mechanisms in cholangiocyte biology.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by modeling human cholangiopathies in a reductionist, reproducible system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces quantifiable outputs via immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and qRT-PCR for biomarker and drug response analysis.
- Scalability: Allows generation of almost unlimited organoids from mouse tissue, enabling high-throughput compound screening.
- Standardization: Maintains homogenous morphology and stable plating efficiency after passage two, supporting reproducible assay performance.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cholangiopathies including biliary atresia, PSC, and cholangiocarcinoma, enabling preclinical efficacy testing.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation through long-term storage and recovery of organoids.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows evaluation of drug effects and infectious agent responses to inform go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a validated biological system for hypothesis testing and pathway clarification in biliary biology.
- Discovery Biology: Supports functional target validation and pathway interrogation through measurable epithelial cell markers and polarization.
- Screening: Enables reliable compound evaluation via standardized organoid culture and quantitative readouts.
- Analytics: Generates measurable outputs including marker expression and morphological changes for comparative analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through long-term storage, recovery, and disease-relevant phenotypic modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for biliary disease modeling across multiple projects and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through expression of biliary progenitor and differentiation markers.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via defined culture passaging and long-term storage protocols.
- Strategic Value: Reduces biological risk in biliary disease programs by enabling early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cholangiocyte-targeted therapies using a scalable, cost-efficient model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse tissue dissection and sterile organoid culture techniques.
- Dependent on access to basement matrix, conditioned medium from L-WRN cells, and standard cell culture infrastructure.
- Necessitates standardized handling to prevent pancreas cell contamination and ensure consistent plating efficiency.
- Involves optimization considerations for increasing plating efficiency and directing functional cell maturity.
- Limited by the need for careful post-centrifugation handling to avoid cellular material loss during processing.
