Name: 小鼠肝外胆管有机体的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学习利用小鼠肝外胆管建立三维类器官培养系统，用于研究胆管细胞生物学和组织再生。该方法具有成体组织特异性、可重复且成本效益高，适用于缺乏人体组织样本的实验室开展胆管疾病研究。

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本研究由美国肝病研究学会（AASLD）Pinnacle 奖项（授予 N.R.）以及美国国立卫生研究院下属的国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（资助号 P30 DK34933 授予 N.R.，P01 DK062041 授予 J.L.M.）提供支持。我们感谢密歇根大学的 Ramon Ocadiz-Ruiz 博士在本方法学开发过程中提供的协助。

本文所述所有方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 小鼠EHBD分离所需仪器与材料的准备
<ol>
	<li>在50 mL锥形管中配制接种培养基和洗涤缓冲液（材料表），并在使用前置于4 °C或冰上保存。</li>
	<li>设置手术台（图1B），准备灭菌的手术器械（图1C）。</li>
	<li>将无菌的24孔板放入37 °C细胞培养箱中预热。</li>
	<li>将基底膜基质分装液置于冰上，仅在完全液化后使用。</li>
</ol>
2. EHBD 分离与胆道类器官培养
<ol>
	<li>小鼠EHBD单细胞悬液的分离与制备
	<ol>
		<li>根据机构指南实施安乐死处理一只成年小鼠（年龄大于2个月）。将小鼠仰卧位固定，沿腹中线切开腹腔，并将肝脏向上推至膈肌处。</li>
		<li>用止血钳轻轻牵拉近端十二指肠，辨认位于肝门下方的总胆管。使用手术刀片将EHBD从周围组织中分离。用镊子夹住总胆管近端，从其与十二指肠连接处近端开始向远端解剖，随后将胆管近端从肝脏分离（图1D）。立即把分离出的EHBD（图1E）放入预冷的洗涤缓冲液中。</li>
		<li>将EHBD从洗涤缓冲液中取出，置于冰上放置的玻璃板上，使用无菌手术刀片将其切成约0.5 mm长的小段（图1B）。</li>
		<li>将EHBD组织段转移至含有500 µL消化缓冲液的离心管中，在37 °C下孵育20分钟。加入500 µL预冷的细胞培养基以中和消化缓冲液。</li>
		<li>依次使用18 G和20 G针头反复吹打细胞悬液各20次。将细胞悬液通过70 µm细胞筛过滤，并将滤过液收集至50 mL离心管中。 
		注意： 过滤前先用500 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）预润湿细胞筛，以促进细胞悬液顺利通过。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立EHBD类器官
	<ol>
		<li>将步骤2.1.5所得滤过液在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>小心吸除上清液。用1 mL预冷无菌PBS重悬细胞，转移至新的1.5 mL离心管中。重复步骤2.2.1。</li>
		<li>离心后，小心吸除底部收集的洗涤后细胞的上清液。用P200枪头反复吹打，将细胞沉淀重悬于120 µL液态的预冷基底膜基质中。 
		注意： 在冰浴条件下进行细胞沉淀在基底膜基质中的重悬操作。</li>
		<li>将40 µL含细胞的基底膜基质悬液滴加至已预温的24孔板中每个孔的中央位置。 
		注意： 操作基底膜基质时避免吸入空气，以防气泡形成。</li>
		<li>将含有细胞悬液的基底膜基质置于37 °C细胞培养箱中孵育15分钟，或直至基底膜基质完全凝固。向每孔中加入600 µL预热至37 °C的接种培养基（材料表），然后将培养板放回37 °C细胞培养箱。</li>
		<li>3天后更换为600 µL新鲜的类器官培养基，此后每3天更换一次。使用倒置显微镜监测类器官生长情况。在观察到腔内碎片积聚和类器官塌陷之前，每7至9天传代一次，或用于下游实验应用（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. EHBD 类器官传代与保存
<ol>
	<li>每7至9天以1:3至1:4的比例传代EHBD类器官
	<ol>
		<li>从孔中移除培养基，并加入400 µL预冷的PBS。在孔中轻轻吹打混合物上下10次，使类器官重悬。将混合物转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>将混合物通过25 G针头吹打4次以解离类器官。在4 °C条件下，以400 × g离心4分钟。</li>
		<li>小心移除上清液，将细胞重悬于基底膜基质中（比例为1:3至1:4），用于进一步培养（步骤2.2.4），或用预冷PBS洗涤细胞以进行后续处理。 
		注意：通常将250–300个细胞接种至24孔板中用于下游应用。可通过倒置显微镜在传代后第3–5天进行明场显微镜观察，计数类器官数量并计算其占初始细胞数的百分比，以评估接种效率。可使用硫氰酸胍-酚-氯仿提取的标准方案，从经PBS洗涤的EHBDO中提取mRNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EHBD类器官的长期保存
	<ol>
		<li>从孔中移除培养基，并用室温PBS洗涤类器官。移除PBS时注意不要扰动基底膜基质液滴。</li>
		<li>向孔中加入500 µL预冷的细胞冻存液。轻轻将类器官在液化的基底膜基质和冻存液中重悬，并将混合物转移至冻存管中。</li>
		<li>将冻存管置于-80 °C保存48小时，随后转移至液氮罐中进行气相长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于石蜡包埋的EHBD类器官处理
<ol>
	<li>用移液器将EHBDO重悬于500 µL预冷的PBS（4 °C）中，上下吹打5至10次。将重悬的EHBDO收集至1.5 mL离心管中的液化基底膜基质中。 
	注意：为避免破坏类器官，需剪去P1000吸头底部2–3 mm，并小心移除上清液。</li>
	<li>在350 × g 条件下离心EHBD类器官5分钟。小心移除上清液，避免扰动类器官沉淀。</li>
	<li>向类器官中加入1 mL预冷的4%多聚甲醛（PFA），在4°C条件下孵育过夜。过夜孵育后，使用P1000吸头移除4% PFA。</li>
	<li>向含有类器官的离心管中加入1000 µL室温PBS，室温（RT）孵育5分钟。将含有类器官的离心管在350 × g 条件下离心5分钟。重复此步骤两次。</li>
	<li>移除PBS，向类器官中加入1 mL 30%乙醇，室温孵育5分钟。</li>
	<li>在室温下以350 × g 离心5分钟。移除30%乙醇，加入1 mL 70%乙醇，室温孵育5分钟。</li>
	<li>在350 × g 条件下离心5分钟。移除70%乙醇，加入1 mL 100%乙醇，室温孵育5分钟。 
	注意：类器官可在100%乙醇中室温保存最多48小时，之后再进行后续处理。</li>
	<li>将样本处理胶在微波炉中加热20秒或直至液化。向含有类器官的离心管中加入50 µL样本处理胶。将离心管置于冰上，直至样本处理胶完全凝固。</li>
	<li>将含有类器官的样本处理胶小滴从离心管中取出，置于包埋盒中的蓝色海绵垫之间，用于组织处理仪中的后续处理。&#160;在石蜡包埋仪中进行后续处理时，每个步骤使用15分钟。</li>
	<li>将包埋在样本处理胶中的石蜡包埋类器官切成4 µm切片。随后按照先前描述的方法进行免疫组织化学染色16。</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

本研究描述了小鼠肝外胆管（EHBD）胆管上皮细胞的类器官三维模型的构建方法。构建EHBDO培养物的关键步骤包括精细的EHBD解剖以避免胰腺细胞污染、维持无菌条件以防止细菌和真菌污染，以及离心后小心操作以避免细胞材料丢失。必须严格遵守所述的温度条件。该技术存在一些局限性。成年小鼠的EHBD体积较小（直径约1 mm；图1E），分离时需要较高的操作技巧。可使用解剖显微镜辅助解剖过程。
本实验方案中使用的基底膜基质是一种含有已知和未知生长因子的生物基质19，其浓度可能因批次不同而存在差异。我们建议，在进行技术重复实验时，应使用相同批次和/或同一份基底膜基质，以避免实验变异性。同时，我们建议定期检测L-WRN细胞培养物是否支原体污染，并检测条件培养基中的WNT活性11。本研究所使用的实验室分别采用了支原体检测试剂盒和WNT活性检测试剂。值得注意的是，EHBDOs培养基中含有少量胎牛血清（0.5%；材料表）...

胆管病变是一类无法治愈的慢性进行性疾病，影响位于肝内和肝外胆管（EHBDs）的胆管细胞1。某些胆管病变，如原发性硬化性胆管炎、胆管癌、胆道闭锁和胆总管囊肿，主要累及肝外胆管。由于缺乏足够的临床前模型，胆管病变的治疗开发受到限制。此外，以往关于胆管病变的研究通常将肝脏、肝内胆管和肝外胆管合并分析。然而，肝内和肝外胆管具有不同的胚胎起源，因此应被视为不同的分子病理实体。肝内胆管起源于肝内导管板和肝憩室的头端部分，而肝外胆管则起源于肝憩室的尾端部分2。在成体稳态维持中，它们也依赖不同的前体细胞区室，包括肝内胆管中的赫林管（canals of Hering）和肝外胆管中的胆管周围腺体（peribiliary glands）2,3。动物模型在临床前研究中的应用受到成本限制，并且出于伦理考虑应尽量减少使用。因此，亟需建立简化、可重复、高效且经济的体外模型。
以往大多数关于胆管疾病的研究所采用的是正常小鼠或大鼠的癌症模型，或来源于肝内及肝外胆管的胆管癌细胞系4,5,6,7。然而，这些模型均为转化细胞模型，无法再现正常胆管细胞在稳态或健康状态下的生物学特性。近年来，类器官培养模型的开发取得了进展，已能够从多种组织类型（包括肝胆组织）中生成三维结构，但尚未实现正常小鼠肝外胆管的三维培养8,9,10。这些&#34;类器官&#34;结构旨在模拟原始组织，并在人工微环境中生长，以支持器官特异性干细胞/前体细胞的自我更新11。
&#34;类器官&#34;是一个广义术语，最常用于描述由干细胞衍生的三维组织模型。类器官可由重编程的多能干细胞（包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞）生成，也可由器官特异性的成体干细胞生成12。既往研究已提出一些胆管上皮细胞类器官模型。已有研究报道由人多能干细胞衍生的类器官7,9,13，其提供了一种有价值的、时间效率高的工具，可同时生成多种不同类型的细胞。然而，这些由多能干细胞衍生的类器官并不能完全模拟原代成人肝外胆管胆管上皮细胞的结构和功能特性。
也有人提出利用人9和猫10肝脏的成体干细胞来源的类器官。然而，猫模型并不广泛可得，且可用于研究的工具十分有限。此外，这些来源于肝脏成体干细胞的类器官所模拟的是肝内胆管上皮细胞，而非肝外胆管上皮细胞。
已有研究报道，从人正常EHBDs14和小鼠EHBD胆管癌15中生成类器官。然而，人EHBD组织的获取极为有限，且来源于胆管癌转基因小鼠模型的类器官15不能代表稳态下健康的胆管细胞生物学特性，并且其来源于基因修饰的细胞。
为克服多能干细胞和肝脏来源的胆管细胞类器官模型的局限性，以及临床前模型中难以获取人类组织的问题，我们开发了一种小鼠肝外胆管类器官模型（图1A）。本文描述了一种从小鼠成年肝外胆管组织建立类器官的技术。这些源自肝外胆管的类器官（EHBDOs）将成为体外研究肝外胆管胆管细胞稳态及其疾病过程（如胆管病）机制的重要工具。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;L-WRN 细胞培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>1%</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;洗涤缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>50 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>125 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>两性霉素B&amp;nbsp;</td><td>6.25 &amp;micro;g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;类器官培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN 条件培养基&amp;nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-谷氨酰胺</td><td>10 &amp;micro;l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 &amp;micro;l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 &amp;micro;l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;类器官接种培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>类器官培养基&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>50 ng/mL</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子-10（FGF10）</td><td>100 ng/mL</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白19（CK19）抗体，兔源</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>性别决定区Y框蛋白9（SOX9）抗体，兔源</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>胰十二指肠同源盒1（PDX1）抗体，兔源</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白抗体，山羊源</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>乙酰化&amp;alpha;-微管蛋白抗体，小鼠源</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>二抗</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488标记的驴抗兔IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594标记的驴抗山羊IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568标记的山羊抗小鼠IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt 报告基因检测</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TopFlash HEK293 细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td></tr><tr><td>荧光素酶检测试剂盒</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他材料与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质，无酚Matrigel</td><td></td><td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>解离缓冲液，Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>细胞冻存液，Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>细胞筛（70 &amp;micro;m，无菌）</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td></tr><tr><td>硫氰酸胍-苯酚法RNA提取试剂，TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td></tr><tr><td>组织处理凝胶，HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>通用支原体检测试剂盒</td><td></td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td></tr><tr><td>24孔板</td><td></td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td></td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse E800</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>解剖托盘</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>13-814-61</td></tr></tbody></table>

从小鼠肝外胆管生成类器官

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

影响肝外胆管（EHBDs）的胆管疾病包括胆道闭锁、原发性硬化性胆管炎和胆管癌，目前尚无有效的治疗手段。用于研究肝外胆管的工具极为有限。我们的目的是建立一种器官特异性强、用途广泛、来源于成体干细胞的临床前胆管细胞模型，该模型可轻松地从野生型和基因工程小鼠中获得。因此，我们报道了一种新型的从成年小鼠肝外胆管建立肝外胆管类器官（EHBDO）培养体系的技术。该模型成本低廉、易于分析，并具有多种下游应用价值。具体而言，本文描述了小鼠肝外胆管的分离与单细胞解离、类器官培养的起始、扩增以及长期维持与保存的方法。本论文还介绍了对EHBDO进行免疫组织化学、荧光显微镜观察，以及通过实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测mRNA丰度的处理流程。除可生成肝外胆管特异性的类器官外，该模型还具有多项显著优势：使用L-WRN细胞的条件培养基显著降低了模型成本；利用小鼠肝外胆管可提供几乎无限的培养组织来源，而不同于人类组织。所获得的小鼠EHBDO包含一群纯度较高的上皮细胞，表达内胚层前体细胞及分化胆管细胞的标志物。培养的类器官在多次传代过程中保持形态均一，并可在液氮中长期冻存后成功复苏。该模型可用于研究胆管前体细胞的增殖，可进行药理学干预，并可由基因工程小鼠构建。未来的研究需进一步优化培养条件，以提高接种效率、评估细胞功能成熟度并引导细胞定向分化。同时，建立共培养模型以及使用更具生物学中性的细胞外基质也是值得追求的方向。

本方案描述了源自成体干细胞、具有组织特异性的成年小鼠EHBD类器官的构建方法。类器官培养后，自EHBD分离之日起1天内即可观察到囊状结构的形成。培养过程中通常不会出现成纤维细胞污染。无论是从新生小鼠还是成年小鼠（年龄大于2个月）中分离，EHBDO的接种效率均约为2%图2B）。源自成年小鼠的EHBD类器官在第2代传代时铺板效率提高至11%，并保持稳定（图2B）。大多数类器官在所有传代过程中均表现出囊性形态，仅偶见“不规则”类器官（图2C-）。类器官在培养5-7天后达到生长高峰，随后开始积聚管腔内碎片并逐渐退化（图 2A因此，为了维持类器官培养，应每隔7-10天传代一次（图2A)。一旦建立并适当处理，类器官可在培养中几乎无限期地维持（已观察到长达1...

本方案描述了小鼠肝外胆管三维类器官系统的构建方法。这些胆管类器官可在体外培养中维持生长，用于研究胆管上皮细胞的生物学特性。胆管类器官表达胆管前体细胞和成熟胆管细胞的标志物，并由具有极性的上皮细胞组成。

影响肝外胆管（EHBDs）的胆管疾病包括胆道闭锁、原发性硬化性胆管炎和胆管癌。它们具有……

这种小鼠肝外胆管类器官系统可以解决临床前胆道疾病模型获取受限，以及多能干细胞和肝脏来源的胆管细胞类器官模型所存在的局限性。我们的模型具有成年组织特异性，具备简化性、可重复性，并且在时间和成本上具有高效性，将特别有利于那些无法获得人源组织的实验室。我们的技术能够培养近乎无限数量的肝外胆管胆管细胞，用于研究组织再生和细胞间相互作用。演示该实验操作的是我实验室的博士后 Junya Shiota。对于肝内胆管的分离，将成年小鼠仰卧固定，并沿腹中线切开腹腔。将肝脏上提并置于膈肌上，用止血钳轻轻牵拉近端十二指肠，以显露位于肝门下方的胆总管。使用手术刀将肝外胆管与其周围组织分离。用镊子夹住胆总管的近端，从胆总管与十二指肠连接处 proximal 端上方开始向远端解剖，随后再将胆总管的近端从肝脏端分离。将分离的肝外胆管立即放入含有冰冷洗涤缓冲液并置于冰上的玻璃板中，去除胆管周围的组织后，切成0.5毫米长的片段。待所有组织切碎后，将组织片段转移至含有500 µL解离缓冲液的离心管中，在37 °C下孵育20分钟。解离结束后，加入500 µL预冷的细胞培养基中和缓冲液，并用18号针头吹打组织悬液20次，随后用20号针头再吹打20次。随后将所得的细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。为建立胆道类器官培养，通过离心收集细胞，并小心弃去上清液。将细胞沉淀重悬于1毫升冰上预冷的无菌PBS中，转移至1.5毫升离心管中进行第二次离心。将洗涤后的沉淀重悬于120微升液态、冰上预冷的基底膜基质中，取40微升细胞悬液接种至已预热至37摄氏度的24孔板中三个孔的中央位置，然后将培养板置于37摄氏度细胞培养箱中孵育约15分钟。当基底膜基质凝固后，向每孔加入600微升37摄氏度的接种培养基，再将培养板放回培养箱中。三天后及此后每隔三天，用600微升新鲜类器官培养基更换原有培养基，并定期使用倒置显微镜观察类器官的生长情况。传代肝外胆管类器官时，先用400微升预冷的PBS将每个孔中的类器官吹打10次，然后将每孔内容物转移至单独的1.5毫升离心管中。将每份混合物通过25号针头吹打4次以解离类器官，随后通过离心收集细胞。然后将细胞以适当比例重悬于基底膜基质中，用于重新接种。对于长期肝外胆管类器官保存，用室温 PBS 清洗类器官的每孔，注意不要扰动基底膜基质液滴，然后向每孔加入 500 微升冰冻保存液。轻轻重悬类器官，将混合液转移至各自的冷冻保存管中，随后将冻存管置于 -80 摄氏度环境中 48 小时，之后转移至液氮罐的气相中进行长期保存。为准备类器官的石蜡包埋，将培养基替换为 500 微升 4 摄氏度 PBS，并将每孔中的悬液转移至分别含有液态基底膜基质的 1.5 毫升离心管中。通过离心收集类器官，并使用改良的P1000移液枪头小心吸除上清液，避免扰动沉淀。随后向类器官中加入1 mL预冷的4%多聚

generation-of-organoids-from-mouse-extrahepatic-bile-ducts

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

小鼠肝外胆管有机体的产生

本文介绍了一种从新生小鼠肝外胆管中分离胆管上皮细胞的技术。通过精细解剖获取胆管组织，随后利用厚胶原凝胶中的细胞爬出法分离细胞。该方法为研究肝外胆管的发育过程及病理机制提供了一个有效的工具。...

新生期肝外胆管上皮细胞的分离

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。...

体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

我们介绍一种相对简单且灵敏的方法，用于精确量化小鼠肝脏中的胆管密度。该方法有助于评估遗传和环境因素的影响，以及潜在疗法在胆道疾病小鼠模型中的有效性。...

测定小鼠肝脏中胆管密度

我们展示了一种用于小鼠前列腺癌模型的尸检及解剖方法，重点介绍前列腺肿瘤的分离。同时提供了一步一步建立小鼠前列腺肿瘤类器官的实验方案。...

利用前列腺癌基因工程小鼠模型生成肿瘤类器官

三维（3D）细胞系统是研究器官发生的相关模型。本文提出一种基于水凝胶的胆管囊泡生成及其表征方法。该方案克服了三维结构表征的障碍，提供了一种简单且可靠的方法，用于评估囊泡形成效率、尺寸大小及其功能特性。...

功能性极化胆管上皮囊泡的生成与定量表征

小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作

为了观察小鼠新生仔鼠的胆管异常，需要保持胆管的完整性和高效的制备方法。因此，我们成功建立了一种新的方法，可在维持胆管完整性的前提下，分离出小鼠新生仔鼠的整个肝外胆管系统。...

九日龄小鼠幼崽的肝外胆管和胆囊解剖

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。...

功能性内胚层肝类器官的生成

将源自患者肿瘤的类器官正位注射到小鼠肝脏中。切除非肿瘤性肝组织后，可使肿瘤所在肝组织形成再生微环境。...

一种源自肝细胞癌患者的类器官异种移植模型，用于研究肝脏再生对肿瘤生长的影响

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

学习利用小鼠肝外胆管建立三维类器官培养系统，用于研究胆管细胞生物学和组织再生。该方法具有成体组织特异性、可重复且成本效益高，适用于缺乏人体组织样本的实验室开展胆管疾病研究。

从小鼠肝外胆管生成类器官

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