Name: 增殖人类抗原特异性CD4+ T细胞使用卡博曲莱辛苏奇尼米酯的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学习使用CFSE标记和密度梯度离心法检测并分离人外周血抗原特异性CD4+ T细胞。该方法可识别稀有T细胞群体，为研究自身免疫疾病如1型糖尿病提供重要工具。

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本工作获得以下机构资助：青少年糖尿病研究基金会 [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N]（S. M.）；国家健康与医学研究理事会（NHMRC GNT123586）（S. M.）；澳大利亚糖尿病研究信托千禧奖（Y17M1-MANS）（S. M.）；维多利亚州政府运营基础设施支持计划（S. M.、A. D.、E. T.、M. S.）；以及国家健康与医学研究理事会研究生奖学金 APP1094337 和 JDRF 博士生补充奖学金（M. S.）。

所有受试者在采集外周血前均签署了知情同意书。使用外周血单个核细胞（PBMC）的实验已获得圣文森特医院伦理审查委员会批准（HREC-A 135/08 和 HREC-A 161/15）。
1. 试剂准备
<ol>
	<li>人T细胞培养基
	<ol>
		<li>制备用于培养PBMC的RP-5培养基，其成分为RPMI 1640、1×非必需氨基酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（2 mM）、青霉素（100 U/mL）/链霉素（0.1 mg/mL）以及5%混合人血清（PHS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CFSE储备液
	<ol>
		<li>将25 mg CFSE溶解于约9 mL DMSO中，配制母液，最终浓度为5 mM。</li>
		<li>将母液用PBS稀释，配制工作液，最终工作浓度为10 µM。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从全血中制备人外周血单个核细胞
<ol>
	<li>人外周血中单个核细胞（PBMC）的数量通常为每毫升 0.5–1.5 × 106 个。因此，所需血液量取决于目标获取的 PBMC 数量。用 PBS 至少以 1:2 的比例稀释人外周血。将 15 mL 密度梯度介质加入 50 mL 离心管中，然后在其上层叠加 35 mL 稀释后的全血，以分离 PBMC。</li>
	<li>在室温（RT）下以 850 × g 离心 15 分钟，不设减速。离心后将形成三层清晰的分层：底层为红细胞沉淀，中间层为密度梯度介质，其顶部界面附着白细胞，上层为血浆层14。</li>
	<li>移除约 20 mL 上层血浆层。收集白细胞层，注意避免混入红细胞沉淀。用 PBS 洗涤 3 次，并使用台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数活细胞。将细胞重悬于 PBS 中，调整浓度至 1 × 106 PBMCs/mL。</li>
	<li>未用 CFSE 染色的细胞
	<ol>
		<li>这些细胞用于流式细胞术的补偿对照，包括未染色细胞和仅 CD4+ 单染色细胞。将每种对照样本的 PBMC 悬液各取 300 µL 加入 10 mL 管中，补加 PBS 至满，然后在室温下以 550 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于 RP-5 培养基中，浓度为 1 × 106 个/mL。将这些未标记细胞与 CFSE 标记的细胞（步骤 2.6.1）一同在 37 °C/5% CO2 培养箱中培养 7 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CFSE 染色细胞
	<ol>
		<li>将步骤 2.3 中的细胞转移至 50 mL 管中。沿管壁加入 CFSE 工作液（10 µM）每 1 mL 细胞悬液加 1.0 µL。通过反复倒置混匀数次。CFSE 的终浓度为 10 nM。</li>
		<li>在 37 °C/5% CO2 培养箱中孵育 5 分钟。为终止染色，加入 5 mL RP-5 培养基，以 550 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀。将 PBMC 重悬于 RP-5 培养基中，浓度为 1 × 106/mL。</li>
		<li>向 10 mL 管中加入 1.0 mL 细胞悬液。每种待测抗原使用一个独立的试管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人 PBMC 的抗原刺激与细胞培养
	<ol>
		<li>将人 CFSE 标记的 PBMC 在 RP-5 培养基中与抗原共同培养 7 天，置于 37 °C/5% CO2 培养箱中。在 96 孔板中每孔接种 1 × 105 个细胞（100 µL），每孔加入含稀释抗原的 RP-5 培养基 100 µL。 
		注：所用抗原及其工作浓度汇总于 表 1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于FACS分析的抗CD4染色
<ol>
	<li>将200 µL培养的细胞移入FACS管中，加入1.0 mL含0.1% FCS的PBS洗涤细胞一次，550 × g离心5分钟。</li>
	<li>在100 µL含0.1% FCS的PBS中加入抗人CD4 Alexa Fluor 647抗体（0.25 μg/mL）进行染色。另取一份CFSE标记的细胞样品，不使用任何其他荧光染料染色，用于设置FACS的CFSE补偿。4 °C避光孵育20分钟。</li>
	<li>加入1 mL含0.1% FCS的PBS洗涤细胞，室温下550 × g离心5分钟，重悬于100 µL含0.1% FCS的PBS中。在进行FACS分析前立即向所有管中加入1 µL碘化丙啶（PI，0.1 mg/mL），以便通过流式细胞术排除死细胞。</li>
</ol>
4. 流式细胞术配置与设门策略
注意：图1展示了包括补偿对照和设门策略在内的流式细胞术配置。
<ol>
	<li>在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）图中设门（图1A），以包含所有淋巴细胞。</li>
	<li>在FSC与碘化丙啶（PI）图中对PI阴性细胞设门（图1B），以排除凋亡细胞。</li>
	<li>使用未染色细胞设定非荧光细胞的电压基线。调整CD4-A647和CFSE的电压，使每种荧光信号均低于1,000（图1C）。使用单色对照CFSE（图1D）和CD4-A647（图1E），在上述设定的电压条件下确认每种荧光的阳性信号（约10,000）。</li>
	<li>CFSE与PI存在一定的光谱重叠；调整补偿，从CFSE荧光信号中扣除PI的荧光溢出，直至仅含CFSE的样本在PI通道中无信号显示。 
	注意：上述设门策略适用于本文分析的所有样本。</li>
</ol>
5. 计算细胞分裂指数以定量抗原特异性CD4+ T细胞增殖
注意：细胞分裂指数（CDI）是指每5,000个未分裂细胞（CD4+/CFSE明亮）中分裂细胞（CD4+/CFSE暗淡）的数量。当未分裂的CD4+细胞数量不恰好为5,000时，需对分裂细胞数量进行校正，以表示每5,000个未分裂细胞中的分裂细胞数。例如，在破伤风类毒素特异性增殖实验中（图2D），未分裂细胞（CFSE明亮）为4,930个，分裂细胞（CFSE暗淡）为3,268个；因此，校正后的分裂细胞数量为 (5,000/4,930) × 3,268 = 3,304.3。
<ol>
	<li>通过将抗原刺激组中每5,000个未分裂细胞对应的分裂细胞数除以无抗原培养组中每5,000个未分裂细胞对应的平均分裂细胞数，计算CDI（表1）（表2）。</li>
</ol>

<ol><li>Duque, A., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+effects+of+BrdU+and+3H-Thymidine+incorporation+into+DNA+on+cell+proliferation%2C+position+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106, 87-95 (2002).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+%28CFSE%29+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).</li>
<li>Ten Brinke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+T-cell+responses+in+translational+studies%3A+Optimization+of+dye-based+proliferation+assay+for+evaluation+of+antigen-specific+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).</li>
<li>Gillespie, G. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+TCR+Conservation+and+Altered+T+Cell+Cross-Reactivity+Characterize+a+B%2A57-Restricted+Immune+Response+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolgy%22%5BJournal%5D)">Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection.</a> Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).</li>
<li>Tynan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Structures+of+Highly+Bulged+Viral+Epitopes+Bound+to+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I%3A+Implications+for+t-cell+receptor+engagement+and+t-cell+immunodominance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).</li>
<li>Blanchard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+aminopeptidase+associated+with+antigen+processing+defines+the+composition+and+structure+of+MHC+class+I+peptide+repertoire+in+normal+and+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells.</a> Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specificity+groups+in+the+T+cell+receptor+repertoire+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire.</a> Nature. 547, 94-98 (2017).</li>
<li>Wooldridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricks+with+tetramers%3A+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC.</a> Immunology. 126, 147-164 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+cloning+human+autoantigen-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).</li>
<li>So, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinsulin+C-peptide+is+an+autoantigen+in+people+with+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+Virus+Growth-transformed+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).</li>
<li>Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expansion+of+high+or+low+avidity+cytotoxic+T+lymphocytes+and+efficacy+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

基于CFSE的增殖检测是一种简单且可靠的方法，用于检测和计数抗原特异性的人CD4+ T细胞。已有研究证明，使用最佳浓度的CFSE对于获得理想结果至关重要4。CFSE浓度过高会抑制细胞增殖，而浓度过低则无法区分已分裂与未分裂的细胞。相比之下，标记纯化的鼠源T细胞时通常使用相对较高的CFSE浓度（5.0 µM）3。由于不同批次之间存在差异，建议对每一批次进行滴定，以确定其最佳工作浓度。我们当前使用的批次浓度（10 nM）远低于原始文献中报道的浓度（200 nM）4。
该方法的另一个重要方面是抗原剂量的优化。已有充分证据表明，使用较低抗原浓度培养的T细胞具有更高的敏感性，并表现出更强的功能。这一现象最初在HIV多肽的研究中得到证实15。本方案中所使用的破伤风类毒素剂量也已在此前经过优化4，以诱导出高敏感性和强增殖能力的CD4<su...

检测和研究抗原特异性T细胞的能力在细胞介导免疫的研究中具有重要意义。然而，针对自身抗原特异性的CD4+ T细胞反应进行检测尤为困难，因为这类反应非常微弱且难以被发现。一种常用于检测抗原特异性淋巴细胞增殖的方法是[3H]-胸腺嘧啶掺入法，该方法利用放射性标记的核苷酸掺入增殖细胞的DNA中。尽管[3H]-胸腺嘧啶掺入法能够检测DNA合成，但该方法仅能间接反映细胞分裂情况，因为DNA合成可能独立于有丝分裂而启动（例如在基因复制或细胞凋亡过程中1）。这一问题因抗原特异性细胞增殖常伴随显著的细胞凋亡而进一步加剧2，可能导致对抗原特异性增殖程度的高估。此外，[3H]-胸腺嘧啶掺入法无法提供增殖淋巴细胞的表型信息，例如在抗原肽刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4+或CD8+细胞亚群的增殖情况。
2003年，我们发表了首个使用CFSE的染料稀释法，称为基于CFSE的增殖检测法3,4。CFSE是一种荧光染料，可通过与细胞内赖氨酸残基形成共价键而稳定结合于胞内蛋白质。由于CFSE标记的蛋白质在子代细胞间均等分配3，因此可通过流式细胞术区分已分裂细胞与未分裂细胞，同时还能对淋巴细胞群体进行定量表型分析。事实上，细胞自CFSE标记以来所经历的分裂次数可在一定程度上被测定5。近年来，已开发出多种作用机制类似的染料，如CellTrace Violet增殖染料（VPD）和CytoTrack染料6。本实验方案以CFSE为重点，但其原理同样适用于其他相关染料。
肽-MHC 四聚体染色法是一种广泛用于检测和克隆抗原特异性CD8+ T细胞的方法。该方法已较为成熟7,8,9,10；然而，基于四聚体的克隆技术需要预先了解表位/MHC限制性，且每个表位均需制备相应的四聚体11，这限制了对新型表位特异性T细胞的发现与克隆。基于CFSE的增殖检测可用于肽段、蛋白质或细胞裂解物。本文所述方案操作简便且结果可靠，所获得的反应性CD4+ T细胞可进一步分选，用于下游功能分析及生物化学特性鉴定实验12,13。

<table><tbody><tr><td>抗人 CD4-AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>317422</td><td>RRID:AB_2716180</td></tr><tr><td>羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）</td><td>ThermoFisher</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1x)</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>甲型流感病毒 H1N1（PR8）基质蛋白1</td><td>Sino Biological</td><td>40010-V07E</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（1x）</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（1x）</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>混合人血清</td><td>澳大利亚红十字会</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素原C肽 PI33-63</td><td>Purar Chemicals</td><td>N/A</td><td>定制合成肽</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>破伤风类毒素蛋白</td><td>Statens Serum Intitut</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯定量增殖的人抗原特异性cd4+ t细胞

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

本文介绍了一种简单、体外的基于染料稀释法的人外周血单个核细胞（PBMCs）中抗原特异性CD4+ T细胞增殖的检测方法。稳定且无毒的荧光染料（如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，CFSE）的发展，使得可通过流式细胞术检测荧光染色强度的减弱，从而将稀有的抗原特异性T细胞与旁观者细胞区分开来。该方法相较于其他替代方法具有以下优势：（i）对低频T细胞非常敏感；（ii）无需知晓抗原或表位信息；（iii）可分析应答细胞的表型；（iv）可分选存活的应答细胞，并用于后续分析，例如T细胞克隆。

使用破伤风类毒素蛋白体外刺激人外周血单个核细胞（PBMC）：将PBMC用CFSE染色后，在存在破伤风类毒素的情况下刺激培养7天。由于几乎所有供体均接种过疫苗，因此对破伤风类毒素表现出强烈的T细胞反应，这使得破伤风类毒素成为一种有用的阳性对照抗原。图2以三复孔形式显示，未刺激的PBMC中CD4+ T细胞的CFSE增殖极低（约12个CFSEdim细胞；图2A、B、C），而对破伤风类毒素刺激则出现明显的CD4+ T细胞增殖（>3,000个CFSEdim细胞；图2D、E、F）。
使用抗原肽体外刺激人外周血单个核细胞（PBMC）：将...

本文介绍了一种利用染料稀释法检测CD4+ T细胞在抗原蛋白或肽刺激下增殖反应的实验方案。该检测方法对抗原特异性的稀有T细胞具有高度敏感性，并可进行修改以促进抗原特异性细胞的克隆。

使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯定量增殖的人抗原特异性CD4+ T细胞

描述了一种简单、体外的基于染料稀释法的人类外周血单个核细胞中抗原特异性CD4+ T细胞增殖检测方法。

本方案提供了一个研究CD4T细胞反应的平台，这类反应通常较弱且难以检测。该技术能够在无需预先了解抗原呈递情况的条件下，实现对CD4T细胞的检测、计数和分离。其主要优势在于能够分析那些通常极为稀少、且与1型糖尿病等自身免疫性疾病相关的CD4T细胞群体。从健康供体获取外周血样本后，先用 PBS 至少按 1:2 的比例稀释血液，然后将 35 毫升血液小心叠加至装有 15 毫升密度梯度介质的 50 毫升离心管中。通过密度梯度离心法分离细胞，并移除约 20 毫升上层血浆。随后收集白细胞层，注意避免接触红细胞沉淀，再用新鲜 PBS 洗涤细胞三次。计数后，将细胞稀释至每毫升 PBS 中含 1 × 10⁶ 个外周血单个核细胞（PBMC）。每个对照组分别向 10 毫升离心管中加入 300 微升细胞悬液。用 PBS 补充各管体积后，通过离心沉淀细胞，并将细胞重悬于 RP5 培养基中，调整浓度为每毫升含 1 × 10⁶ 个细胞。然后，将每种对照细胞各100微升接种到96孔板的三个孔中，每孔预先加入100微升RP5培养基。将该培养板置于细胞培养箱中培养七天。接着，将剩余的PBMC转移至一个新的50毫升离心管中，并沿管壁向每1毫升细胞悬液加入1微升CFSE工作液。迅速倒置试管数次以混匀，并将细胞置于细胞培养箱中孵育5分钟。孵育结束后，加入5 mL RP5培养基终止反应，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于新鲜RP5培养基中，浓度为每毫升含1 × 10⁶个PBMCs，并将1 mL细胞悬液分别加入每支含待测抗原的10 mL试管中。然后，将细胞以每种抗原100微升的量加入至96孔板中的三个孔，每孔预先含有100微升RP5培养基，并分别补充相应稀释的目标抗原。将该培养板置于细胞培养箱中培养七天。为进行流式细胞术分析而对CD4+ T细胞群体染色时，在培养结束时，将每个孔中的全部细胞转移至各自的荧光激活细胞分选（FACS）管中。用1毫升含0.1%胎牛血清（FCS）的PBS洗涤每个样品。将沉淀重悬于适量抗人CD4抗体中，每管加入100微升含FCS的PBS。将细胞在4°C避光孵育20分钟。孵育结束后，每管加入一毫升新鲜 PBS 加 FCS 洗涤样品，并将沉淀重悬于 100 微升新鲜 PBS 加 FCS 中。分析前立即向每管加入一微升碘化丙啶，以排除死细胞。根据淋巴细胞的前向散射和侧向散射区域设门。为了排除凋亡细胞，根据前向散射面积对碘化丙啶阴性细胞设门，并使用未染色细胞设定非荧光细胞的电压基线。调整CD4抗体荧光染料和CFSE信号的电压，使每种荧光信号均低于1000。利用单色对照CFSE和CD4样本，结合未染色细胞设定的电压，确认每种颜色均出现阳性荧光信号。由于CFSE和碘化丙啶存在一定的光谱重叠，需调整补偿以从CFSE荧光中扣除碘化丙啶的荧光信号，直至仅含CFSE的样本在碘化丙啶检测通道中无信号输出。当所有样本分析完成后，通过将抗原刺激组中每5000个未分裂细胞对应的分裂细胞数除以无抗原培养组中每5000个未分裂细胞对应的平均分裂细胞数，计算细胞分裂指数。几乎所有供体在体外刺激后均表现出对破伤风类毒素强烈的T细胞反应，因为这些供体均接种过疫苗，从而使破伤风类毒素成为一种有效的阳性对照抗原。然而，未受刺激的外周血单个核细胞（PBMC）中CD4+T细胞的增殖极为有限。在使用人胰岛素原C肽刺激七天后，可在1型糖尿病患者外周血中检测到针对胰岛素原C肽的特异性CD4+T细胞。用甲型流感病毒基质蛋白刺激的PBMC也表现出增殖现象。综上所述，这些数据表明，该检测既可使用全长蛋白，也可使用短的合成肽段进行。该方法的流式细胞术部分可利用细胞分选流式细胞仪完成。通过细胞分选仪，可将抗原特异性T细胞在单细胞水平上分离，用于后续分析。该方法已实现了在早发性1型糖尿病患者中发现CD4T细胞反应。利用其他方法分析这些罕见的T细胞群体则面临多种技术挑战。

quantification-proliferating-human-antigen-specific-cd4-t-cells-using

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

增殖人类抗原特异性CD4+ T细胞使用卡博曲莱辛苏奇尼米酯的定量

本实验展示了从全外周血中纯化并体外扩增抗原特异性CD4+ T细胞，以及利用MHC II类四聚体对其进行可视化检测的方法。四聚体技术能够直接可视化具有单一抗原特性和明确MHC...

使用MHC II类四聚体可视化抗原特异性CD4+ T细胞

CFSE 可将荧光染料羧基荧光素共价标记到细胞内长寿命的分子上。因此，当 CFSE 标记的细胞发生分裂时，其子代细胞的荧光强度减半，从而可用于评估细胞增殖。本文描述了通常用于 CFSE...

使用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）监测淋巴细胞增殖

Tregs 是免疫系统的强效抑制细胞。由于缺乏定义 Tregs 的特异性表面标志物，因此对 Tregs 的定义主要基于其功能。本文描述了一种优化的 体外...

人类 体外 抑制作为识别免疫失衡早期状态的筛选工具

成功使用细胞示踪染料来监测免疫细胞功能和增殖涉及多个关键步骤。我们描述了以下方法：1）使用膜染料获得明亮、均一且可重复的标记；2）选择荧光染料及数据采集条件；3）选择基于染料稀释的细胞增殖定量模型。...

优化的细胞分裂监测染色与增殖建模方法——基于细胞示踪染料

本视频展示了一种用于分析处于不同细胞周期阶段的抗原特异性CD8+...

一种用于抗原特异性CD8+ T细胞细胞周期分析的检测方法

本视频展示了一种制备嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术 离体...

一种用于制备嵌合抗原受体T细胞的离体技术

本方案描述了一种灵敏的基于细胞的细胞毒性检测方法。通过计数在效应CD8+ T细胞数量递增的情况下，存活的靶CD4+ T细胞频率的减少，该检测可直接评估抗原特异性CD8+...

基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

本文介绍了一种标准免疫学技术（CFSE标记的OT-I增殖）的应用，旨在快速监测佐剂介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在体内的生成。in...

快速 体内 评估佐剂在疫苗开发中诱导细胞毒性T淋巴细胞的能力

在此，我们介绍一种可快速、可重复地制备具有可调控大小、形状及表面蛋白呈递能力的仿生可降解人工抗原呈递细胞（aAPC）的实验方案，用于T细胞扩增。 离体 或 体内.

各向异性聚合物人工抗原呈递细胞的制备及其在CD8+ T细胞活化中的应用

本文详细介绍了一种简单、快速且可靠的多参数流式细胞术联合肿瘤芯片辅助的实验方案，用于监测和表征构成癌症-免疫循环的各个步骤。事实上，深入理解癌症细胞与免疫细胞之间的相互作用，对于破解肿瘤免疫机制、指导临床诊疗具有重要意义。...

体外共培养系统重现癌症-免疫循环

学习使用CFSE标记和密度梯度离心法检测并分离人外周血抗原特异性CD4+ T细胞。该方法可识别稀有T细胞群体，为研究自身免疫疾病如1型糖尿病提供重要工具。

使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯定量增殖的人抗原特异性CD4⁺ T细胞

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