用于细胞质 siRNA 传递的带电反应性聚合物纳米粒子的制备

目前的协议是重要的，因为它允许研究人员生产siRNA加载的纳米粒子，并充分描述这些纳米粒子，以确保其适合给给动物之前，随后的研究。这种方法的优点是生产纳米粒子，提高siRNA的生物利用度，并产生中性充电的纳米粒子，从而适用于全身管理。这项技术是有影响的，因为siRNA纳米粒子可以应用于治疗无数需要全身给普的疾病，包括癌症、心血管疾病和自身免疫性疾病等。

首先，以每毫升33.3毫克的浓度将聚合物溶解在乙醇中，搅拌以确保溶解。然后使用移液器将聚合物溶液转移到10毫摩尔柠檬酸缓冲液中，达到每毫升3.33毫克的浓度。将蒸馏水加入含有小干扰RNA的管中，达到50微摩尔的浓度。

通过上下移液将聚合物和小型干扰RNA溶液彻底混合到管中，实现氮磷比10。将管子放在环境温度下 30 分钟。然后将 pH 8 下 10 毫升磷酸盐缓冲液加入管中，达到每毫升 0.28 毫克的浓度，然后通过移液或倒置管轻轻混合。

为了确认最终pH值是中性的，大约7.2至7.5，移液器10微升的小干扰RNA纳米粒子溶液进入pH测试条。首先，通过0.45微米孔径注射器过滤器将每毫升0.28毫克浓度的小干扰RNA纳米颗粒过滤成方形石英或聚苯乙烯，制备动态光散射样品。然后根据制造商的规格使用动态光散射仪器记录尺寸和表面电荷测量。

为了确认使用传输电子显微镜的小干扰RNA纳米粒子的大小和形态，首先在每个TEM网格中添加5微升过滤小干扰RNA纳米粒子溶液，每毫升0.28毫克。将网格放在环境温度下 60 秒。用滤纸擦干三秒钟。

接下来，在每个网格中加入5个3%的醋酸兰基溶液微升，孵育20秒。干干三秒钟。然后将网格放在干燥器中干燥过夜，然后根据传输电子显微镜进行成像。

要执行气糖凝胶迟钝，首先在烧杯中 pH8 的 pH 8 中加入两克电泳级 agarose 粉末至 100 毫升 1X Tris-醋酸-EDTA 缓冲液，以产生 2%的 agarose 凝胶。搅拌暂停阿加罗斯。将烧杯盖在微波炉中加热一到三分钟，直到所有气糖溶解。

冷却后，以每毫升10毫克浓度加入5微升溴化乙酰胺，并混合好。然后将糖倒入凝胶托盘中，放置梳子以产生井。让凝胶干燥30分钟。

小心地拆下梳子，留下装料井，将 1X 三丝醋酸盐-EDTA 缓冲液倒入凝胶托盘中，以填充到最大填充线。然后，在石蜡膜上放置两个微升的负载染料等同物，每个小干扰RNA纳米粒子配方的含量量为不同的氮磷比。移液器将10微升的小干扰RNA纳米颗粒溶液与石蜡膜上的加载染料混合。

将混合物加入阿加罗斯凝胶井。将电泳系统插入电源，以 100 伏电压源运行 35 分钟，或直到样品穿过 80% 的凝胶长度。将凝胶从托盘转移到紫外线透光器，并根据制造商的规格可视化紫外透光器上的小干扰RNA波段。

根据凝胶底部小干扰RNA波段的消失，确定最佳氮磷酸比。为了击倒模型基因荧光素酶，首先在96井的黑色壁板中播种荧光素酶表达细胞，DMEM在10%FBS中，密度为每井2000个细胞。将盘子放入培养箱过夜，让细胞粘附。

早晨去除介质，每井添加10微升小干扰RNA纳米颗粒稀释到全血清介质中，最终小干扰RNA浓度为100纳米摩尔。将孔返回培养箱24小时，用小干扰RNA纳米粒子处理细胞。第二天，用含有每毫升150微克的完全血清介质更换介质。

在室温下孵育细胞五分钟，然后测量板读卡器上的发光度。然后重复介质茶点两次，使用不含D-西西法林的新鲜全血清介质，然后孵育24小时。用含有每毫升D-荧光素150毫克的全血清介质更换介质，并在室温下孵育5分钟。

测量 48 小时时间点的亮度。对于纵向研究，在生物安全柜外将盖子放在井盘顶部，以在无菌条件下维护细胞，并在用新鲜全介质替换含荧光素的介质后继续孵育。动态光散射测量表明，小干扰RNA纳米粒子一的平均直径为35纳米。

峰值宽度较窄的单峰的存在表示单模分布和低多分散度。TEM 测量确认动态光散射的大小测量表明存在一致的小干扰RNA纳米粒子，并揭示了小干扰RNA纳米粒子的球形形态。制备步骤中聚合物浓度过高，导致小干扰RNA纳米粒子2个直径超过200纳米，多模态和多分散体，溶液中的聚合体形成没有明显的颗粒形态。

两个小干扰RNA纳米粒子一和二显示中性表面电荷，以接近零的均值zeta电位值表示。Agarose凝胶迟钝测定表明，凝胶底部小干扰RNA波段的消失，表明小干扰RNA与聚合物的复合。聚合物复合小干扰RNA无法通过凝胶迁移，因此在装料井附近的凝胶顶部被可视化。

随着氮与磷酸盐比的增加，小干扰RNA复合增加，如凝胶底部小干扰RNA带强度降低所示。与搅乱控制相比，生物活性荧光素酶小干扰RNA纳米粒子一个表现出显著减少的荧光素酶活性。相比之下，荧光石小干扰RNA纳米粒子二不被认为是生物活性的。

为了产生具有所需物理化学特性的一致siRNA纳米粒子，应使用具有适当浓度的聚合物溶液，并在协议的每一步验证缓冲溶液的pH值。利用这些方法在我们的研究中，我们已经能够生产基于siRNA纳米粒子的疗法，用于以前无法治疗的致癌基因，并测试这些疗法在乳腺癌临床前模型中的有效性。