Name: 用于细胞质 siRNA 传递的带电反应性聚合物纳米粒子的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习制备中性电荷pH响应型siRNA纳米粒子的方法，用于基因治疗并提高siRNA生物利用度。本方案通过动态光散射和透射电镜表征纳米粒子尺寸、形态及表面电荷，确保其适合全身给药。

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作者感谢 Craig Duvall 博士和 Rebecca Cook 博士提供数据和实验室资源以开展本项研究。作者感谢范德堡纳米科学与工程研究所（VINSE）提供动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）仪器的使用权限（NSF EPS 1004083）。作者感谢美国国家科学基金会对研究生研究奖学金项目的支持（NSF#1445197）。作者感谢美国国立卫生研究院提供的经费支持（NIH R01 EB019409）。作者感谢美国国防部国会指定医学研究项目（DOD CDMRP OR130302）提供的经费支持。

1. si-NPs 的制备与表征
<ol>
	<li>si-NP 的制备
	<ol>
		<li>将聚合物溶解于 10 mM 柠檬酸缓冲液（pH 4.0）中，浓度为 3.33 mg/mL。可先将聚合物以乙醇配制成 10 倍浓度溶液，以确保充分溶解。 
		注意：聚合物可溶解于较低浓度，但浓度高于 3.33 mg/mL 可能会阻碍均一纳米颗粒（NP）的形成。</li>
		<li>加入 siRNA（50 μM，溶于 diH2O），使 N+:P- 比值达到 10。通过移液充分混合聚合物与 siRNA 溶液，并静置孵育 30 分钟。N+:P- 比值表示聚合物中带正电荷的胺基数量与 siRNA 中带负电荷的磷酸基团数量之比，其计算公式如下： 
		<img alt="siRNA 复合反应方程，静态平衡，摩尔比计算，教学示意图" src="/files/ftp_upload/59549/59549eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程"> 
		其中，mol Pol 为聚合物的摩尔量，RU amine 为每条聚合物链中带正电荷胺基的重复单元数，mol siRNA 为 siRNA 的摩尔量，bp siRNA 为每条 siRNA 分子的碱基对数。</li>
		<li>加入 5 倍体积的 10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 8.0），通过移液或倒置离心管的方式轻柔混匀。为确认最终 pH 值为中性（~7.2–7.5），取 10 μL si-NP 溶液滴加至 pH 试纸上进行检测。 
		注意：柠檬酸缓冲液和磷酸盐缓冲液的配制方法依据 Millipore Sigma 缓冲液参考中心图表进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>si-NP 的理化表征</li>
	<li>采用动态光散射（DLS）技术测定所制备 si-NP 的粒径和表面电荷。取 1 mL si-NP 溶液（浓度 0.1–1.0 mg/mL），经 0.45 μm 孔径的注射器滤器过滤后，转移至方形石英或聚苯乙烯比色皿中制备 DLS 样品。根据仪器制造商的操作说明，使用 DLS 仪器记录粒径和表面电荷数据。
	<ol>
		<li>通过透射电子显微镜（TEM）成像分析，确认 si-NP 的粒径与形貌。
		<ol>
			<li>取 5 μL 浓度为 1 mg/mL 的 si-NP 溶液滴加至 TEM 载网，孵育 60 秒，用滤纸吸除多余液体 3 秒。</li>
			<li>加入 5 μL 3% 醋酸铀酰溶液，孵育 20 秒，再次用滤纸吸干 3 秒。将载网置于干燥环境中过夜干燥。</li>
			<li>根据所用显微镜的既定操作流程对载网进行成像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>采用琼脂糖凝胶阻滞实验，在不同 N+:P- 比值下表征 siRNA 在 si-NP 中的包封情况。
		<ol>
			<li>配制 2% 琼脂糖凝胶：将 2 g 电泳级琼脂糖粉末加入 100 mL pH 8.0 的 1× TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液中，搅拌悬浮后，于微波炉中敞口加热至琼脂糖完全溶解（1–3 分钟）。</li>
			<li>待溶液冷却后，加入 5 μL 溴化乙锭（10 mg/mL，溶于 H2O），充分混匀。将琼脂糖溶液倒入凝胶模具，插入梳子形成加样孔，静置干燥 30 分钟。小心拔出梳子，向凝胶槽中加入 1× TAE 缓冲液至最大填充线。</li>
			<li>按照前述方法制备 N+:P- 比值分别为 0、1、2、5、7、10、20 和 40 的 si-NP。在石蜡膜上为每种 si-NP 配方分别取 2 μL 上样染料（不含 SDS 和还原剂）。用移液器将 10 μL si-NP 溶液与石蜡膜上的上样染料混合。</li>
			<li>将 si-NP 与上样染料的混合液加入琼脂糖凝胶的加样孔中。以 100 V 电压电泳 35 分钟（或直至样品迁移至凝胶长度的 80%）。</li>
			<li>根据制造商的操作说明，使用紫外透射仪观察 siRNA 条带。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 确定 si-NPs 的体外生物活性
<ol>
	<li>荧光素酶模型基因的敲低
	<ol>
		<li>使用荧光素酶siRNA制备荧光素酶si-NPs（依据上述步骤），并使用随机序列siRNA制备乱序对照si-NPs。两种si-NPs均需配制为相同的最终N+:P- 摩尔比，并采用琼脂糖凝胶阻滞实验所确定的最佳比例。示例siRNA序列见于材料表中。</li>
		<li>将表达荧光素酶的细胞[MDA-MB-231/Luciferase (Bsd) 稳定细胞系]以每孔2,000个细胞的密度接种于96孔黑色壁板中。在培养箱中（37 °C，5% CO2，95%湿度）使用完全培养基（DMEM，10% FBS）孵育过夜，使其充分贴壁。</li>
		<li>将si-NPs用含血清的完全培养基稀释，使每孔终体积为100 μL，siRNA终浓度为100 nM。用si-NPs处理细胞24小时。</li>
		<li>24小时后，移除处理液，更换为含150 μg/mL D-荧光素的完全培养基。按照仪器制造商的操作说明，在平板读数仪或活体光学成像系统上检测发光信号前，先孵育5分钟。</li>
		<li>将含荧光素的培养基更换为新鲜的完全培养基，继续培养24小时。重复上述步骤：移除培养基，加入含150 μg/mL D-荧光素的完全培养基，孵育5分钟后，在48小时时间点再次检测发光强度。</li>
		<li>对于长期实验，在检测发光信号期间需维持细胞的无菌培养条件。每次检测后，移除含荧光素的培养基，更换为新鲜完全培养基继续培养。 
		注：合适的siRNA浓度会因不同的si-NPs和siRNA分子而异。当使用具有内体裂解核心的中性电荷聚集体（如PEG-DB）时，100 nM浓度通常对细胞具有良好的耐受性，并可实现>75%的荧光素酶基因敲低效果。在N+:P- 比为10、siRNA处理浓度为100 nM（假设siRNA长度为26 bp）时，PEG-DB与siRNA的质量比为23.3，即每1.0 ng siRNA需加入23.3 ng PEG-DB。例如，在96孔板中每孔以100 nM浓度处理（每孔培养液体积为100 μL），需向166.5 ng siRNA中加入1.16 μL浓度为3.33 mg/mL的聚合物溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何潜在的利益冲突。

本文所述的si-NP是通过阴离子siRNA与阳离子聚合物通过静电相互作用形成聚离子复合物（polyplexes）而制备的。在低pH（4.0）条件下混合，可促进siRNA与PEG-DB聚合物中阳离子DB嵌段之间的静电复合。在pH 4.0时，DMAEMA高度质子化，因此DB嵌段带有大量正电荷。这确保了聚合物在溶液中以单分子形式溶解，而非形成胶束，并且DB能高效地与siRNA形成复合物。随后，将溶液pH调节至中性（pH 7.4），导致DB嵌段发生“疏水化”，进而形成胶束，并将复合的siRNA包载于所形成的polyplexes的内核中。这些polyplexes的设计使得PEG在DB/siRNA核心周围形成一层亲水性、惰性的外壳，从而产生系统给药所必需的中性表面电荷。聚合物的化学结构及polyplexes的形成过程如图1所示。
对si-NPs进行严格的理化表征，对于确定其配方是否适合进入生物学测试至关重要。粒径、表面电荷以及颗粒形状/形貌均为可能影响生物学性能的重要参数。对于向肿瘤的全身递送，si-NPs的粒径应在20–200 nm...

由于siRNA能够抑制mRNA序列翻译成蛋白质，理论上可用于治疗所有已知的病理状态1,2,3,4,5。然而，siRNA在医学中的应用受到其整体较差的药代动力学特性的限制6,7。静脉注射后，siRNA会迅速经肾脏清除和/或被核酸酶降解8,9。由于其分子量较大且带有负电荷，siRNA无法进入细胞，也无法从内体-溶酶体途径中逃逸，从而无法到达位于细胞质中的RNA诱导沉默复合物（RISC）10,11,12,13。因此，大量研究致力于siRNA递送策略的设计与实现14。这些研究主要集中在开发基于脂质和聚合物的纳米颗粒，这类纳米颗粒可将siRNA包裹其中，保护其在体内不被清除和降解，并通过可离子化的阳离子胺基团促进细胞摄取和内体逃逸。已有许多临床前研究取得成功，最近更是首次报道了基于纳米颗粒的肝脏siRNA递送在治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导性（hATTR）淀粉样变性方面的临床成功案例15。
目前许多致癌基因无法通过传统药理学方法（即小分子药物）进行靶向治疗，这推动了用于癌症治疗的聚合物siRNA纳米颗粒（si-NPs）的设计16。然而，非肝脏部位的siRNA递送需要考虑另一组独立的设计参数。递送系统必须屏蔽聚集体所带的阳离子电荷，因为该电荷会导致全身循环中的聚集现象17,18,19。特别是对于肿瘤递送而言，si-NP的稳定性至关重要，它能够实现长循环时间，从而通过增强的渗透与滞留效应（EPR）提高在肿瘤组织中的富集20,21。此外，对si-NP尺寸的控制也至关重要，因为只有直径约为20–200 nm的纳米颗粒才能有效利用EPR效应22，而更小的si-NPs（约20–50 nm直径）相比更大尺寸的纳米颗粒和微粒，表现出更优的肿瘤穿透能力23。
为应对静脉注射后siRNA全身性肿瘤递送所面临的额外设计挑战，研究人员已开发出具有中性电荷且对pH响应的siRNA纳米颗粒（si-NPs）（图1）24。这些si-NPs经过聚乙二醇化（PEGylation），或最新采用两性离子化（Zwitterionation）25，以实现表面电荷中性，并在血液循环中抵抗蛋白质吸附和调理作用。由于它们不能仅依赖阳离子特性来驱动细胞内递送，因此必须实现极为高效的内涵体逃逸，才能获得显著的基因沉默效果。为此，这些si-NPs的核心由一种高效内涵体裂解性材料构成，该材料在细胞外pH值（7.4）下呈惰性，但在内涵体-溶酶体通路的酸性环境[pH 6.8（早期内涵体）至5.0（溶酶体）]中可发生类似开关的激活响应。最后，si-NPs核心内含有阳离子与疏水性成分的混合物，可同时提供静电作用力和范德华力，从而相较于单纯的阳离子体系显著提高si-NPs在血液中的稳定性。
利用可逆加成-断裂链转移（RAFT）可控聚合技术，可将多种功能整合到相对简单的结构设计中，从而制备具有复杂拓扑结构和精确组成的聚合物。为了制备表面电荷呈中性、具有pH响应性且稳定的siRNA纳米颗粒（si-NPs），采用RAFT聚合合成聚乙二醇-b-[2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯-co-丁基甲基丙烯酸酯]（PEG-DB；图1A）。PEG-DB通过静电相互作用与siRNA复合，形成具有PEG冠层和DB/siRNA内核的si-NPs（图1B）。PEG在si-NP冠层形成一层惰性、电中性的亲水性外壳。DB嵌段由等摩尔比的2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯（DMAEMA）和丁基甲基丙烯酸酯（BMA）共聚而成。带正电荷的DMAEMA通过静电作用与带负电荷的siRNA结合。BMA则通过范德华力在纳米颗粒内核中发生自聚集，从而增强纳米颗粒的稳定性。DMAEMA和BMA共同赋予DB嵌段pH依赖性的脂质双分子层裂解特性。在细胞外pH条件下，DB嵌段被封闭在si-NP内核中，对脂质双分子层呈惰性。而在酸性环境中（如内体-溶酶体通路内），DB嵌段中的可电离DMAEMA可介导“质子海绵效应”，即内体缓冲能力导致渗透压升高，进而引起内体肿胀并破裂26。此外，DB嵌段中的疏水性BMA组分可主动插入并破坏脂质双分子层，实现高效的内体裂解。因此，siRNA与PEG-DB复合形成的si-NPs在细胞外pH下呈电中性且高度稳定，而在酸性pH条件下可破坏脂质双分子层，从而确保siRNA有效递送至细胞质中。
本文描述了利用PEG-DB制备si-NP的实验步骤，并介绍和讨论了表征si-NP理化参数及生物活性的方法。为了快速评估si-NP的生物活性，本研究采用荧光素酶作为基因沉默研究的模型基因。萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）是萤火虫发光现象中 responsible 的蛋白质27。因此，转染了萤火虫荧光素酶基因的哺乳动物细胞会产生可被发光仪检测的生物发光信号，从而定量荧光素酶的表达水平。本实验中，通过向表达荧光素酶的细胞递送靶向荧光素酶的siRNA，并与接受乱序siRNA的细胞进行比较，测定生物发光信号的相应降低程度，以此评估si-NP的生物活性。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;#956;m 孔径注射器滤器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F25133</td><td>直径 17 mm，PTFE 膜</td></tr><tr><td>0-14 pH 试纸</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4786</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE 缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>6-7.7 pH 试纸</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3536</td><td></td></tr><tr><td>96 孔黑色壁板</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>经组织培养处理</td></tr><tr><td>琼脂糖粉末</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>一水柠檬酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>二水磷酸氢二钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88294</td><td>单钾盐</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td>高糖含丙酮酸钠</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>上样染料</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>荧光素酶 siRNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>反义链序列：GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC&lt;br /&gt;AAUUGUU&lt;br /&gt;正义链序列：CAAUUGCACU&lt;br /&gt;GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA 碱基</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 / 荧光素酶 (Bsd) 稳定细胞系</td><td>GenTarget Inc</td><td>SC059-Bsd</td><td>表达荧光素酶的细胞，用于评估 si-NP 生物活性</td></tr><tr><td>一水磷酸二氢钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>乱序 siRNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>反义链序列：AUACGCGUAUU&lt;br /&gt;AUACGCGAUUAACGAC &lt;br /&gt;正义链序列：CGUUAAUCGCGUAUAAUAC&lt;br /&gt;GCGUA*T* *DNA 碱基</td></tr><tr><td>方形聚苯乙烯比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td>容量 4.5 mL</td></tr><tr><td>透射电镜载网</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>1GC50</td><td>PELCO 中心标记载网，50 目，直径 3.0 mm，铜网</td></tr><tr><td>二水柠檬酸三钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>21447-25</td><td></td></tr></tbody></table>

中性电荷、ph响应性聚合物纳米颗粒的制备及其用于细胞质sirna递送

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

小干扰RNA（siRNA）作为靶向分子药物的成功，依赖于其向病变组织内细胞的高效胞质递送。在治疗以往“不可成药”的肝脏疾病靶点方面，siRNA已实现临床成功。然而，实现肿瘤部位的高效siRNA递送还需额外的药代动力学设计考量，包括延长血液循环时间、逃避免疫清除器官（如, 肝脏和肾脏）以及肿瘤组织中的穿透与滞留能力。本文描述了用于高效递送siRNA（尤其是递送至非肝组织如肿瘤）的聚合物纳米颗粒的制备方法及其体外理化性质与生物学特性的表征。该siRNA纳米颗粒通过siRNA与嵌段共聚物聚乙二醇-聚赖氨酸（poly(ethylene glycol-b-[2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯-co聚离子复合物（polyplexes）由siRNA被包封在polyplex核心内，而PEG形成亲水性、电中性冠层。此外，随着内体-溶酶体途径囊泡的酸化，DB嵌段会变得具有膜裂解性。&#60; pH 6.8），从而触发内体逃逸并实现siRNA的胞质递送。文中描述了用于表征siRNA纳米颗粒理化特性的方法，包括粒径、表面电荷、颗粒形态及siRNA载量。采用荧光素酶作为模型基因，通过快速、高通量的基因沉默实验检测siRNA纳米颗粒的生物活性。通过上述初步测试的设计（如基于PEG-DB的聚合物复合物）可被视为适合推进至临床前动物研究，以评估siRNA向肿瘤或其他病理部位的递送效果。

有效的si-NP用于体内siRNA递送的一些关键特性包括合适的粒径（约20–200 nm直径）、siRNA的包封能力以及基因沉默的生物活性。尽管这些特性并非详尽无遗（如讨论部分所述），但在进一步测试某一制剂之前，应首先确认这些基本特性。
图2展示了si-NP在制备后的粒径和表面电荷表征。动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）作为互补方法，用于检测si-NP的粒径（两者均可）、多分散性（DLS）以及形态（TEM）。DLS结果显示，si-NP 1的平均直径为35 nm，单峰分布表现为仅出现一个峰，且峰宽较窄，表明其多分散性低（图2A）。TEM结果证实了DLS测得的粒径，提示si-NP群体均一，并显示出si-NP呈球形形态（图2C）。对si-NP 2的DLS和TEM检测表明...

介绍了制备和表征中性电荷、pH响应性siRNA纳米颗粒的理化性质及生物活性的方法。讨论了siRNA纳米药物成功的关键指标，如粒径、形貌、表面电荷、siRNA载药量和基因沉默效果。

中性电荷、pH响应性聚合物纳米颗粒的制备及其用于细胞质siRNA递送

siRNA 作为靶向分子药物的成功取决于其能否高效递送至病变组织内细胞的细胞质中。临床……

本方案具有重要意义，因为它使研究人员能够制备负载siRNA的纳米颗粒，并对这些纳米颗粒进行充分表征，以确保其在后续研究前适合用于动物给药。该方法的优势在于能够制备提高siRNA生物利用度的纳米颗粒，并生成呈中性电荷的纳米颗粒，从而适用于全身性给药。该技术具有重要影响，因为siRNA纳米颗粒可应用于多种需要全身给药的疾病治疗，包括癌症、心血管疾病和自身免疫性疾病等。首先，将聚合物溶解于乙醇中，浓度为 33.3 毫克/毫升，并搅拌以确保完全溶解。然后用移液器将聚合物溶液转移至 10 毫摩尔/升的柠檬酸缓冲液中，使聚合物终浓度为 3.33 毫克/毫升。向含有小干扰 RNA 的离心管中加入去离子水，使其浓度达到 50 微摩尔/升。将聚合物溶液与小干扰RNA溶液在离心管中充分混合，通过反复吹打使氮与磷酸基团的摩尔比达到10。室温下静置30分钟。然后向管中加入1毫升pH为8的10毫摩尔磷酸缓冲液，使终浓度为0.28毫克/毫升，轻轻吹打或颠倒混匀。为确认最终 pH 值为中性（约 7.2 至 7.5），将 10 微升小干扰 RNA 纳米颗粒溶液滴加到 pH 试纸上。首先，通过 0.45 微米孔径的注射器滤器，将 1 毫升浓度为 0.28 毫克/毫升的小干扰 RNA 纳米颗粒过滤至方形石英或聚苯乙烯比色皿中，制备动态光散射样品。然后根据仪器制造商的说明，使用动态光散射仪记录粒径和表面电荷的测量结果。为通过透射电子显微镜确认小干扰RNA纳米颗粒的大小和形态，首先将5微升浓度为0.28毫克/毫升的过滤后小干扰RNA纳米颗粒溶液加入每张透射电镜载网中。将载网在室温下放置60秒，然后用滤纸 blot 干燥3秒。接下来，向每个载网上加入5 µL的3%醋酸铀溶液，孵育20秒，用滤纸吸干3秒。然后将载网置于干燥器中过夜干燥，随后在透射电子显微镜下进行成像观察。进行琼脂糖凝胶阻滞实验时，首先将两克电泳级琼脂糖粉末加入含有100毫升pH为8的1×Tris-乙酸-EDTA缓冲液的烧杯中，以制备2%琼脂糖凝胶。搅拌以悬浮琼脂糖。将烧杯敞口置于微波炉中加热1至3分钟，直至所有琼脂糖完全溶解。冷却后，向烧杯中加入5 µL浓度为10 mg/mL的溴化乙锭，并充分混匀。然后将琼脂糖倒入凝胶托盘中，并插入梳子以形成加样孔。让凝胶静置干燥30分钟。小心移除梳子，留下加样孔，并将 1× Tris-乙酸-EDTA 缓冲液倒入凝胶托盘中，至最高加液线。然后，在石蜡膜上为每种不同氮磷比的小干扰 RNA 纳米颗粒制剂分别取两微升不含 SDS 或还原剂的上样染料。用移液器在石蜡膜上将 10 微升小干扰 RNA 纳米颗粒溶液与上样染料混合均匀。将混合物加入琼脂糖凝胶孔中。将电泳系统连接至电源，以100伏电压运行35分钟，或直至样品迁移至凝胶长度的80%。将凝胶从托盘转移至紫外透射仪，根据制造商的说明在紫外透射仪下观察小干扰RNA条带。根据凝胶底部小干扰RNA条带的消失情况，确定最佳的氮与磷酸盐比例。为敲低模型基因荧光素酶，首先将表达荧光素酶的细胞以每孔2,000个细胞的密度接种于96孔黑色壁板中，每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。将培养板放入培养箱中过夜，使细胞贴壁。第二天早晨，吸去培养基，每孔加入10 µL用含血清完全培养基稀释的小干扰RNA纳米颗粒，使小干扰RNA的终浓度为100 nmol/L。将培养板放回培养箱中孵育24小时，以用小干扰RNA纳米颗粒处理细胞。次日，更换为含有150 µg/mL D-荧光素酶底物（D-luciferin）的含血清完全培养基。在使用酶标仪检测发光之前，将细胞在室温下孵育5分钟。随后用不含D-荧光素的新鲜完全培养基更换培养基两次，每次孵育24小时。最后将培养基更换为含有150毫克/毫升D-荧光素的完全培养基，并在室温下孵育5分钟。在48小时时间点测定发光信号。对于长期研究，在生物安全柜外操作时，将盖子保留在孔板上方，以维持细胞的无菌状态，并在用含新鲜完全培养基替换含荧光素的培养基后继续培养。动态光散射测量结果显示，小干扰RNA纳米颗粒一的平均直径为35纳米。单个峰且峰宽较窄表明呈单分散分布且多分散性较低。透射电子显微镜（TEM）测量结果证实了动态光散射所得的粒径数据，提示小干扰RNA纳米颗粒具有均一的种群，并揭示了小干扰RNA纳米颗粒的球形形貌。在制备过程中，若聚合物浓度过高，则导致小干扰RNA纳米颗粒二出现大于200纳米的不良直径、多峰及多分散种群，并在溶液中形成聚集体，无明确的颗粒形貌。小干扰RNA纳米颗粒一和二均表现出中性表面电荷，表现为接近零的平均Zeta电位值。琼脂糖凝胶阻滞实验显示，小干扰RNA条带在凝胶底部消失，表明小干扰RNA已与聚合物形成复合物。聚合物复合的小干扰RNA无法在凝胶中迁移，因此在加样孔附近的凝胶顶部可见。随着氮磷比的增加，小干扰RNA的复合程度也随之增加，这表现为凝胶底部小干扰RNA条带的强度降低。与乱序对照相比，具有生物活性的荧光素酶小干扰RNA纳米颗粒一显示出显著降低的荧光素酶活性。相反，荧光素酶小干扰RNA纳米颗粒二不具有生物活性。为了制备具有理想理化特性的稳定siRNA纳米颗粒，应使用浓度适当的聚合物溶液，并在实验方案的每一步骤中验证缓冲液的pH值。在研究中应用这些方法后，我们已成功开发出针对以往难以成药的致癌基因的siRNA纳米颗粒疗法，并在乳腺癌的临床前模型中测试了这些疗法的有效性。

preparation-neutrally-charged-ph-responsive-polymeric-nanoparticles

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于细胞质 siRNA 传递的带电反应性聚合物纳米粒子的制备

本文描述了一种用于评估聚合物基因递送纳米颗粒的纳米颗粒追踪分析（NTA）和高通量流式细胞术的实验方案。NTA...

通过纳米颗粒追踪分析与高通量流式细胞术评估聚合物基因递送纳米颗粒

在小鼠中每72小时重复进行眶后静脉注射阳离子脂质体/siRNA/ITSN-1s复合物，持续24天，可高效将siRNA双链递送至小鼠肺微血管系统，使ITSN-1s的mRNA和蛋白表达水平降低75%。该技术在动物模型中具有高度可重复性，无不良反应，且不会导致动物死亡。...

通过阳离子脂质体重复递送特异性siRNA实现小鼠肺组织中Intersectin-1s的长期沉默。利用电子显微镜评估基因敲低效果

关键词：Intersectin-1s，siRNA，阳离子脂质体，肺组织，基因沉默，电子显微镜，基因敲低

递送仍是小干扰RNA（siRNA）在治疗应用中的主要挑战。本方案采用一种多功能且生物相容的siRNA递送平台，由精氨酸和聚乙烯亚胺接枝的多孔硅微粒组成。...

多孔硅微粒用于递送siRNA治疗剂

本实验方案的目标是利用带有神经靶向肽的阳离子/阴离子脂质体作为中枢神经系统递送系统，使siRNA能够穿过血脑屏障。优化siRNA等治疗方法的递送系统，将为朊病毒病及其他神经退行性疾病提供更多治疗选择。...

使用阳离子和阴离子脂质体将治疗性siRNA递送至中枢神经系统

我们提出了一种新方法，该方法利用光响应性嵌段共聚物实现高效的时间和空间基因沉默控制，且未检测到脱靶效应。此外，通过简单的siRNA释放实验和简化的动力学建模即可预测基因表达的变化。...

通过光响应性聚合物纳米载体中siRNA的时空控释预测基因沉默效果

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外...

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

我们介绍了一种利用聚乙烯亚胺（PEI）包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒将siRNA转染至巨噬细胞的方法。这些纳米颗粒可高效地将siRNA递送至巨噬细胞。 体外 和 体内...

聚乙烯亚胺包被的氧化铁纳米颗粒作为小干扰RNA体外和体内递送至巨噬细胞的载体 In Vitro 和 In Vivo

我们展示了用于高效体外和体内寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成方法。多孔硅纳米颗粒负载siRNA形成核心，通过挤出法包覆融合性脂质形成外壳。本方法包括靶向配体的功能化修饰及颗粒的表征。...

用于寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成、功能化与表征

我们提供了设计、组装和表征聚电解质复合胶束的实验方案及代表性数据，这类核-壳纳米颗粒由聚电解质与亲水性带电-不带电嵌段共聚物形成。...

聚电解质复合胶束的组装与表征

采用微流控混合平台方法开发用于mRNA和DNA包封的脂质纳米颗粒。...

利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外...

用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

学习制备中性电荷pH响应型siRNA纳米粒子的方法，用于基因治疗并提高siRNA生物利用度。本方案通过动态光散射和透射电镜表征纳米粒子尺寸、形态及表面电荷，确保其适合全身给药。

中性电荷、pH响应性聚合物纳米颗粒的制备及其用于细胞质siRNA递送

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