Name: 巨型囊泡内单细胞层的细菌细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 了解在巨型囊泡内进行单细胞水平细菌培养的方法，使用液滴转移法制备囊泡并固定于支撑膜上。该技术可直接观察细菌生长动态，为微生物学研究提供新工具。

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本工作得到了日本文部科学省（MEXT）优秀青年研究人员领先计划（LEADER，编号16812285）、日本学术振兴会（JSPS）对M.M.的青年科学家研究资助（编号18K18157、16K21034）以及文部科学省对K.K.的资助（编号17H06417、17H06413）的支持。

1. 通过液滴转移法制备含有细菌细胞的GVs
<ol>
	<li>用氯仿/甲醇溶液（2/1，v/v）配制1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC，10 mM，1 mL）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基（聚乙二醇）-2000]（生物素-PEG-DSPE，0.1 mM，1 mL）的脂质储备液，并将储备液于-20 °C保存。</li>
	<li>含脂质油溶液的制备
	<ol>
		<li>将20 μL的POPC溶液和4 μL的生物素-PEG-DSPE溶液加入玻璃试管中（图1b (i)）。</li>
		<li>通过气流吹干有机溶剂以形成脂质膜，并将脂质膜置于干燥器中1小时，以彻底蒸发残留的有机溶剂（图1b (ii)）。 
		注意：必须在通风橱中蒸发有机溶剂。</li>
		<li>向玻璃小瓶中加入200 μL矿物油（0.84 g/mL，材料表）（图1b (iii)）。</li>
		<li>用封口膜包裹玻璃小瓶开口，然后在超声水浴（120 W）中处理至少1小时（图1b (iii)）。POPC和生物素-PEG-DSPE的最终浓度分别为1 mM和0.002 mM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌细胞的预培养
	<ol>
		<li>从LB平板接种E. coli至1x LB培养基（200 mL去离子水中含1 g酵母提取物、2 g胰蛋白胨和2 g氯化钠）中，于37 °C培养12–14小时（过夜）。</li>
		<li>培养后，取20 μL培养液转移至1.98 mL新鲜1x LB培养基中，再次培养2小时。</li>
		<li>检测预培养液（步骤1.3.2制备）在600 nm处的光密度（OD600）值。应使用OD600 = 1.0–1.5的预培养液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GVs内外水相溶液的制备
	<ol>
		<li>将葡萄糖溶解于1x LB培养基中，以制备GVs的外水相溶液。配制20 mL葡萄糖储备液（500 mM）。</li>
		<li>用1x LB培养基将葡萄糖储备液稀释至200 mM（表1）。</li>
		<li>将蔗糖溶解于1x LB培养基中，以制备GVs的内水相溶液。配制20 mL蔗糖储备液（500 mM）。</li>
		<li>混合预培养液（OD600 = 1.0–1.5）、蔗糖溶液（500 mM）和1x LB培养基（表1）。培养液的最终OD600值应为0.01–0.015，蔗糖终浓度应为200 mM。 
		注意：注意避免渗透压失衡。必须使内外水相溶液的浓度保持平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含细菌细胞的水包油（W/O）液滴的制备
	<ol>
		<li>将2 μL的GVs内水相溶液（步骤1.4.4制备）加入含有脂质的油溶液（含POPC和生物素-PEG-DSPE的矿物油）50 μL中，置于0.6 mL带盖塑料管中（图1b (iv)）。</li>
		<li>用手轻敲塑料管，使两相在管内乳化（图1b (v)）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含细菌细胞的GVs的形成
	<ol>
		<li>在1.5 mL带盖塑料管中加入50 μL的GVs外水相溶液（步骤1.4.2制备）（图1b (vi)），然后在其表面轻轻铺加150 μL含脂质的油溶液（含POPC和生物素-PEG-DSPE的矿物油）（图1b (vii)）。将样品在室温（RT，25 °C）孵育10–15分钟。检查油相与水相界面是否平整。</li>
		<li>用移液器将50 μL的W/O液滴溶液（步骤1.5.2制备）加至油相与水相的界面处（图1b (viii)）。</li>
		<li>将1.5 mL带盖塑料管（来自步骤1.6.2）在台式离心机中于室温下以1,600 × g离心10分钟（图1b (ix)）。离心后，用移液器吸除上层油相，收集含有细菌细胞的GVs（图1b (x)）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. GV 观察系统（细菌细胞培养系统）的制备
<ol>
	<li>用于构建支撑双层膜的小囊泡（SVs）的制备
	<ol>
		<li>将20 μL的POPC溶液和4 μL的生物素-PEG-DSPE溶液加入玻璃试管中（使用与步骤1.1中GV制备相同的脂质组成）。</li>
		<li>通过气流蒸发有机溶剂以形成脂质膜，并将样品置于干燥器中1小时，以彻底蒸发残留的有机溶剂。</li>
		<li>向玻璃小瓶中加入200 μL含200 mM葡萄糖的1x LB培养基（GV的外水相溶液）。</li>
		<li>用封口膜包裹玻璃小瓶开口部分，并在超声水浴（120 W）中进行超声处理至少1小时。</li>
		<li>使用微型挤出器和孔径为100 nm的聚碳酸酯膜，通过挤出法21制备SVs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自制样品腔室的制备
	<ol>
		<li>使用空心打孔器在双面密封垫（10 mm × 10 mm × 1 mm）上钻一个7 mm的孔。</li>
		<li>将带孔的双面密封垫粘贴到盖玻片（30 mm × 40 mm，厚度0.25–0.35 mm）上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在腔室孔洞内的盖玻片表面制备支撑双层膜
	<ol>
		<li>向腔室的孔洞（按步骤2.2制备）中加入30 μL SV溶液，并在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>用移液器吸取20 μL含200 mM葡萄糖的1x LB培养基（GV的外水相溶液），轻轻冲洗孔洞两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将GVs固定在腔室孔洞内盖玻片上的支撑双层膜上
	<ol>
		<li>向孔洞中加入10 μL链霉亲和素（neutravidin）与GV外水相溶液（1 mg/mL），并在室温下孵育15分钟。</li>
		<li>用移液器吸取20 μL含200 mM葡萄糖的1x LB培养基（GV的外水相溶液），轻轻冲洗孔洞两次。</li>
		<li>将含有GVs的全部溶液（按步骤1.6.3制备）加入腔室孔洞中，并用盖玻片（18 mm × 18 mm，厚度0.13–0.17 mm）密封（图2b）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察GVs内细菌细胞的生长
	<ol>
		<li>设置配备40x/0.6数值孔径（NA）长工作距离物镜的倒置显微镜加热载物台系统（图2b）。</li>
		<li>将腔室放置于显微镜加热载物台系统上（图2b），在37 °C静态条件下孵育6小时，以观察腔室内含细菌细胞的GVs。</li>
		<li>使用科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机，每30分钟拍摄并记录一次GVs内细菌细胞生长的显微图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种在GVs内对细菌细胞进行单细胞水平培养的方法。该方法通过液滴转移法，制备包含单个细菌细胞的GVs，操作简便。与其他获得含细菌细胞GVs的方法相比，本方法具有两个优势：（i）易于实施；（ii）制备GVs仅需少量样品溶液（2 μL）。与传统的水合22和微流控方法17相比，用于制备含细菌细胞GVs的液滴转移法20更为简便。例如，传统的水合法22虽是一种简单易行的GVs制备方法，但其材料包封效率较低，且至少需要数百微升的样品量。近年来发展的纤维素纸辅助水合23和凝胶辅助水合24方法在制备GVs时，对生物分子的包封效率显著高于传统水合法22。这两种方法的包封效率与液滴转移法相当，有望实现细胞在GVs内的包封。此外，微流控方法17能够精确地将单个细胞包封于GV...

单细胞水平的细菌培养近年来受到越来越多的关注。在受限空间内对单个细菌细胞进行培养，有助于阐明细菌的功能，例如表型变异性1,2,3,4、细胞行为5,6,7,8,9以及抗生素耐药性10,11。得益于近年来培养技术的进步，单个细菌的培养已可在诸如微孔芯片4,7,8、凝胶液滴12,13和油包水（W/O）液滴5,11等受限空间内实现。为了进一步加深对单个细菌细胞的理解与利用，仍需在培养技术方面进行更深入的发展与优化。
模拟生物细胞膜的囊泡是由两亲性分子构成的球形结构，能够容纳多种物质。根据尺寸不同，囊泡可分为小囊泡（SVs，直径 &#60; 100 nm）、大囊泡（LVs，&#60;1 μm）和巨型囊泡（GVs，&#62;1 μm）。由于SVs或LVs对生物细胞膜具有亲和性，常被用作药物载体14。GVs则已被用于构建原始细胞15或人工细胞的反应系统16。已有研究报道将生物细胞封装于GVs中17,18，因此当GVs与反应系统结合时，显示出作为细胞培养系统的潜力。
本文结合实验操作视频，介绍了如何将GVs用作新型细胞培养容器19。通过液滴转移法20制备含有细菌的GVs，随后将其固定在盖玻片上的支撑膜表面。利用该系统，我们实现了在GVs内对单个细菌的实时生长过程进行观察。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（18 &amp;times; 18 mm）</td><td>松野玻璃工业</td><td>C018181</td><td>厚度 0.13&amp;ndash;0.17 mm</td></tr><tr><td>盖玻片（30 &amp;times; 40 mm）</td><td>松野玻璃工业</td><td>定制订购</td><td>厚度 0.25&amp;ndash;0.35 mm</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Hi-Tech Co.</td><td>ATT101</td><td>摆动转子型</td></tr><tr><td>双面胶带（10 &amp;times; 10 &amp;times; 1 mm）</td><td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>AS ONE</td><td>6-306-01</td><td>Durham发酵管</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>和光纯药工业</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>和光纯药工业</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>显微镜加热台系统</td><td>TOKAI HIT</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>名村テスク</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>微型挤出器</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>中性亲和素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>LUCPLFLN 40&amp;times;/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>孔径 100 nm</td></tr><tr><td>sCMOS相机</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 plus</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>和光纯药工业</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>和光纯药工业</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>AS ONE</td><td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>0.6 mL 带盖塑料管</td><td>Watson</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 带盖塑料管</td><td>住友贝克莱特公司</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)-2000]</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880129P</td><td>Biotin-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

在巨型囊泡内对单个细菌细胞进行培养

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

我们开发了一种在巨型囊泡（GVs）内对单个细菌细胞进行培养的方法。细菌细胞培养对于理解细菌细胞在自然环境中的功能具有重要意义。随着技术的进步，现已能够在受限空间内揭示多种细菌细胞在单细胞水平上的功能。GVs是由两亲性脂质分子组成的球形微米级隔室，能够容纳包括细胞在内的多种物质。在本研究中，通过液滴转移法将单个细菌细胞封装进直径为10–30 μm的GVs中，并将含有细菌细胞的GVs固定在玻璃基底上的支撑膜上。该方法适用于实时观察GVs内单个细菌的生长过程。我们以大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）作为模型在GVs中进行培养，但该方法也可适用于其他类型的细胞。本方法可广泛应用于微生物学、生物学、生物技术和合成生物学等科研与工业领域。

我们介绍一种利用液滴转移法生成包含单个细菌细胞的GVs的简单方法（图1）。图1a展示了包含细菌的GVs沉淀过程的示意图。通过离心，含有细菌的水/油（W/O）液滴穿过油-水（脂质单层）界面，从而形成GVs。蔗糖（内水相溶液）与葡萄糖（外水相溶液）之间的密度差异也有助于W/O液滴穿过油-水界面。由于内外水相溶液之间微小的浓度差异可能引起GVs的变形和破裂，因此有必要监测内外水相的渗透压。图1b展示了采用液滴转移法制备包含细菌细胞的GVs的流程图。按照此流程操作，可轻松获得包含单个细菌细胞的GVs。
为了观察细菌在脂质体（GV）内的生长，构建了一套用于显微观察的原创培养系统（图2）。含有细菌的脂质体被固定在盖玻片上一层经中...

我们展示了在巨型囊泡（GVs）内进行细菌的单细胞培养。通过液滴转移法制备含有细菌细胞的巨型囊泡，并将其固定在玻璃基底上的支撑膜上，以便直接观察细菌的生长过程。该方法也可适用于其他类型的细胞。

我们开发了一种在巨型囊泡（GVs）内对细菌细胞进行单细胞水平培养的方法。细菌细胞培养对于……具有重要意义。

本方案提供了一种在巨型囊泡内于单细胞水平培养细菌细胞的方法。巨型囊泡易于制备，且制备囊泡仅需极少量的样品溶液。本实验操作将由本实验室的博士研究生Yuri Ota演示。首先，将 20 µL 新鲜配制的 POPC 溶液和 4 µL 新鲜配制的生物素-PEG-DSPE 溶液加入玻璃小瓶中。通过气流蒸发有机溶剂，直至形成脂质膜。将膜置于干燥器中一小时，以彻底蒸发残留的有机溶剂。然后向小瓶中加入 200 µL 矿物油。用塑料封口膜覆盖小瓶开口，并将小瓶内容物置于120瓦的超声水浴中至少超声处理一小时。对于小体积囊泡的制备，先按上述方法制备脂质膜，然后向膜中加入 200 µL LB 培养基中含有 200 mmol/L 葡萄糖的溶液。然后以120瓦功率对薄膜进行超声处理至少一小时，随后使用微型挤出器和孔径为100纳米的聚碳酸酯膜，将所得的巨大囊泡挤出成小囊泡。进行细菌预培养时，从LB平板接种大肠杆菌（E.coli）至数毫升LB培养基中，在37摄氏度下过夜培养。次日早晨，取20微升培养物的上清液转移至1.98毫升新鲜LB培养基中，继续培养两小时。孵育结束后，使用分光光度计检测预培养液在600纳米处的光密度（OD 600）值。应使用OD 600值为1至1.5的预培养液。然后根据表一，将预培养液与 freshly prepared蔗糖溶液和新鲜LB培养基混合。对于巨囊泡的形成，向一个1.5毫升带盖塑料管中加入50微升新配制的巨囊泡外水溶液。轻轻将150微升含脂质的油溶液铺加在巨囊泡外水溶液上方。室温孵育所得溶液10至15分钟，然后检查油相与水相界面是否平整。对于含细菌细胞的水相和油相液滴的形成，取2微升新配制的含巨囊泡的内水溶液，加入至装有50微升含脂质油溶液（经超声处理）的0.6毫升带盖塑料管中。随后轻敲管壁，使两相成分乳化。接着，使用移液器将50微升水相和油相液滴溶液加至油相与水相溶液的界面处，并通过离心沉淀含细菌细胞的巨囊泡。然后吸除上层油相，收集巨型囊泡。制备手工腔室时，使用空心打孔器在10毫米×10毫米×1毫米的双面密封垫上钻一个7毫米的孔，然后将该双面密封垫粘贴到30毫米×40毫米的盖玻片上。为制备支撑双层膜，向手工腔室的孔中加入30 µL小囊泡溶液。将囊泡在室温下孵育30分钟。孵育结束后，用20微升添加了200毫摩尔葡萄糖的LB培养基轻轻洗涤小孔两次。为将巨型囊泡固定在支撑双层膜上，向小孔中加入10微升亲和素（neutravidin），与外部水相巨型囊泡溶液混合，并在室温下孵育15分钟。孵育结束后，用20微升添加了200毫摩尔葡萄糖的LB培养基轻柔地清洗孔洞两次，并将全部体积的巨囊泡溶液加入到腔室的孔洞中。然后用18×18毫米的盖玻片密封孔洞。为了监测巨囊泡内的细菌生长情况，选择倒置显微镜的40倍物镜，将腔室置于显微镜加热载物台系统上。然后将含有细菌细胞的巨囊泡在37摄氏度下静置孵育6小时，使用科学级互补金属氧化物半导体相机每30分钟拍摄并记录一次细菌细胞的生长图像。含有细菌细胞的巨囊泡通常大小在10至30微米之间。对于两种尺寸的巨囊泡，大肠杆菌（E.coli）细胞均会经历伸长和分裂过程，在6小时的观察期内，部分E.coli细胞可增殖至极高的数量。含有单个细胞水平的巨囊泡在所获得的巨囊泡中相对频率约为10%，而在含有细菌细胞的巨囊泡中，约有50%是单细胞水平包封的巨囊泡。油水界面的稳定性对于获得含细菌细胞的巨囊泡至关重要。在进行巨囊泡校正前，需小心吸取油相。观看本视频后，您应能充分理解如何在单个巨型囊泡内对细菌细胞进行单细胞水平的培养。我们的细菌培养方法是微生物学中一种新工具，可用于培养未知环境细菌，以获取或分析其代谢产物。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

巨型囊泡内单细胞层的细菌细胞培养

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

来源：Morita, M., 等．巨型囊泡内单细胞水平的细菌细胞培养．J. Vis. Exp.

巨囊泡内细菌的单细胞培养

来源： Cabeen, M. T., 等单细胞微流控分析 芽孢杆菌属 subtilis. J. Vis. Exp.

在微流控系统中以单细胞分辨率追踪细菌生长

本方案介绍了用于原核微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器（PLBR）的制备、装置搭建及基本操作。作为原理验证，对具有工业相关性的微生物进行了分析，从而获得了在特定时间段内的生长速率、形态特征及表型异质性等方面的深入信息，而这些信息采用传统方法极难实现。...

用于微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器：制备、系统搭建与操作

包含高度密集的微米级组分的巨大囊泡是有效的细胞模型。水包油乳液离心法是一种制备包封材料的巨大囊泡的简单而强大的工具。...

通过油包水乳液离心法制备包封微球的巨型囊泡

单细胞微流控分析 Bacillus subtilis

本文介绍了一种用于分离感染性变形虫的单细胞微吸吮方法。为了分离感染了福斯托病毒（Faustoviruses）及未知巨型病毒的Vermamoeba...

单细胞微吸法作为荧光激活细胞分选的替代策略用于巨型病毒混合物的分离

细菌会分泌携带生物活性分子的纳米级细胞外囊泡（EVs）。EV研究主要关注其生物发生机制、在微生物间及宿主-微生物相互作用和疾病中的作用，以及潜在的治疗应用。本文介绍了一种可放大的从多种细菌中分离EV的方法流程，以促进EV研究的标准化。...

可扩展的细胞外囊泡分离与纯化方法 大肠杆菌 及其他细菌

本方案详细描述了从蓝细菌培养物中分离、浓缩和表征细胞外囊泡的方法。同时讨论了从不同规模培养物中纯化囊泡的技术路径、各方法之间的权衡，以及处理野外样品时的注意事项。...

蓝细菌胞外囊泡的分离与表征

本方案描述了使用倒置乳液法将无细胞表达（CFE）系统包裹于巨型单层囊泡（GUV）内，以研究模型膜蛋白在脂双层中的合成与整合。...

通过包封无细胞表达系统重构细菌谷氨酸受体通道

本文介绍了一种制备具有囊泡内嵌囊泡结构的复合型巨大单层囊泡（cGUVs）的方法，可定制其内层、环形间隙及外层区域的电导率。通过电形成法合成简单的GUVs，再经渗透冲击将其转化为口形体和cGUVs，为研究有核细胞的生物物理特性提供了有价值的模型。...

合成复合型巨大单层囊泡：一种模拟有核细胞的生物仿生模型

了解在巨型囊泡内进行单细胞水平细菌培养的方法，使用液滴转移法制备囊泡并固定于支撑膜上。该技术可直接观察细菌生长动态，为微生物学研究提供新工具。

在巨型囊泡内对单个细菌细胞进行培养

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