通过自由浮动免疫荧光测定,在皮外神经纤维中定位阿尔法核糖核酸聚合体
2019年6月25日
在这里,我们提出了一个协议,在皮肤活检部分自由浮动间接免疫荧光测定,允许识别疾病特异性形态变异的阿尔法核糖核酸与多种蛋白质外围神经系统。
帕金森病的诊断仍然依赖于在疾病过程中后来出现的运动参与的临床迹象，当时大多数的亚斯坦蒂纳的神经元已经丢失。该协议允许皮肤活检的皮肤神经分析，代表该疾病的潜在新生物标志物，用于临床试验。皮肤活检是一种易于评估的、不侵入性的程序，可以分析容易患病理学的周围神经组织。
通过皮肤活检检测的α突核素聚合检测可用于诊断目的，可能在早期阶段，当潜在的治疗是最有效的。在同一患者中进行后续皮肤活检，可以对α合成素聚合在人类皮肤神经系统中传播进行时间和特殊过程分析。这些可以揭示疾病的发病机制。
若要开始此过程，请准备新的 PLP 固定解决方案，如文本协议表 1 中所述。收集皮肤活检后，立即将皮肤淹没在含有10毫升固定溶液的管子中。在摄氏四度下孵育过夜。
第二天，在烟气罩中，轻轻取出 PLP 固定。在同一管中，每次洗涤使用5毫升0.1摩尔索伦森溶液洗活检三次，每次洗涤五分钟。丢弃索伦森的溶液，并添加五毫升的低温保护溶液。
在摄氏四度下孵育过夜。第二天，如果在一周内进行低温切割，活检将储存在摄氏四度。首先，将低温设置为零下20摄氏度。
拿一个低温，并填补它与低温嵌入介质。使用钳子，将活检浸入低温嵌入介质中，纵向轴平行于低温的底部。用液氮捕捉样品，获得含有正确方向活检的低温嵌入介质的固体立方体。
将样品放入低温恒温器中，等待 30 分钟，以便活检适应。然后，将样品固定到低温恒温器上，切成 50 微米部分。使用小刷子将低温部分转移到每个井中包含 200 微升防冻液的 96 井板中。
在此之后，将盘子存放在零下20摄氏度。首先，用100微升的洗涤液填充一个新的96孔板的一些水井。将要分析的部分从存储板转移到包含洗涤溶液的储物板。
在室温下将部分留在洗涤液中 10 分钟。然后，将每个部分转移到包含相同洗涤溶液的空井中，然后重复洗涤。接下来，将洗涤液添加到各部分，并将其转移到包含 100 微升的阻块溶液的新井中。
在室温下孵育至少90分钟，最多4小时。在工作溶液中稀释原抗体、抗PGP9.5和抗5G4。将各部分转移到含有100微升原抗体工作溶液的新井中，并在室温下孵育过夜。
第二天，洗净井中含有洗涤溶液的部分，如前所述。稀释二级抗体，山羊抗兔子检测PGP9.5，山羊抗小鼠检测5G4，在工作溶液中。将洗涤的部分转移到含有100微升二级抗体工作溶液的新井中。
用铝箔盖住板，避免氟磷与二次抗体结合的漂白，并在室温下孵育90分钟。在此之后，如前所述，在洗涤溶液中洗涤两次。在室温下将洗净的部分转移到含有 100 微升 DAPI 的新井中，为期 5 分钟。
如前所述，在洗涤液中清洗部分两次。然后，将幻灯片上的部分安装到正确的位置，避免错误折叠。在幻灯片中添加几滴安装介质，然后用盖滑盖住该部分。
让幻灯片在一夜之间变干。第二天，将幻灯片存放在4摄氏度的适当盒子里，确保避免光线照射。使用倒置荧光显微镜或共和显微镜，查看各部分。
通过连接到显微镜的摄像机获取图像。然后，使用荧光显微镜或共和显微镜，根据文本协议中概述的信号的空间分布和强度来分析各部分的正信号。按照所述方法，在PD患者皮肤神经分膜内注射自主结构中检测标有5G4抗体的α核素聚合体。
阿尔法突核素沉积的形态显示为沿着皮肤神经轴突的虚线信号。在19例PD患者和3个解剖点的皮肤活检中，有代表性地使用此协议表明，与健康对症相比，5G4的灵敏度为81%，特异性为86%。磷酸化α突核素的灵敏度为56%，特异性为100%5G4，磷酸化α突触阳性沉积物主要在汗腺周围发现，但也存在于肌肉反应器皮利、小血管、亚皮末和皮肤丛中，但从未在内皮神经纤维中发现。
一般来说，在汗腺流明中，可以观察到可能被误解为5G4或磷酸化阿尔法突触正向的非特异性信号。这种类型的信号是点状的，球形的，它最有可能是由于在发光内自发光材料，如在没有初级抗体和二级抗体的技术控制证明。使用 PGP9.5 进行结肠化，该纤维在形态学上是丝丝和拉长的，有助于识别正确的信号。
因此，5G4信号的特异性通过带气管标记的双重免疫着色而得到高度提高。活检的准确固定对于产生高质量的免疫荧光染色和荧光信号的可靠解释是必要的。如果未正确准备固定剂，或者发生了过度固定，则结果将是高自荧光，将遮盖神经纤维穿过皮肤-表皮结或内侧主皮结构的信号。
这个过程最关键的步骤是组织固定。注意PLP固定溶液的pH值和孵育时间，避免自荧光和特定信号。
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概述
本研究提出了一种用于皮肤活检切片的自由漂浮间接免疫荧光的协议，以识别与帕金森病相关的α-突触核蛋白变体。该方法便于皮肤神经的分析，为早期诊断提供了潜在的生物标志物的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 病理学
- 诊断方法
背景
- 帕金森病的诊断主要依赖于后期临床表现。
- 皮肤活检允许分析受疾病影响的周围神经组织。
- α-突触核蛋白聚集体的检测可能有助于早期诊断。
- 了解人类神经系统中的聚集体传播可以揭示疾病发病机制的方面。
研究目的
- 建立一个识别α-突触核蛋白变体的稳健协议。
- 评估皮肤活检作为一种无创诊断工具的可能性。
- 分析α-突触核蛋白聚集体的分布和特征。
使用的方法
- 皮肤活检切片的间接免疫荧光检测。
- 分析皮肤神经以评估疾病特异性标志物。
- 协议包括样品固定、切片和抗体染色。
- 使用针对特定变体的一抗和二抗。
- 关键步骤包括在受控温度下孵育和精细的洗涤程序。
主要结果
- 在帕金森病患者的皮肤神经束中发现了α-突触核蛋白聚集体。
- 5G4抗体与健康对照相比，显示出81%的敏感性和86%的特异性。
- 磷酸化α-突触核蛋白沉积物被检测到，其敏感性和特异性各异。
- 与PGP9.5的适当共定位增强了阳性信号的特异性。
结论
- 该研究展示了一种在皮肤活检中检测α-突触核蛋白聚集体的可行方法。
- 研究结果表明，皮肤活检有可能作为早期帕金森病的诊断生物标志物。
- 对聚集体分布的见解可以增进对疾病进展的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Early, minimally invasive detection of alpha synuclein aggregates in cutaneous nerve fibers addresses a critical gap in Parkinson's disease biomarker development. This immunofluorescence assay enables quantitative, reproducible assessment of disease-relevant protein pathology in accessible tissue, supporting translational research and portfolio triage. Integration of this protocol into discovery and preclinical workflows enhances predictive confidence for neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of alpha synuclein pathology in peripheral nerves for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying disease-relevant protein aggregates in human tissue.
- Facilitates hypothesis-driven studies on aggregate distribution and disease progression.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible immunofluorescence workflow for robust biomarker quantification.
- Delivers quantitative readouts of aggregate localization and intensity for assay benchmarking.
- Enables cross-sample and longitudinal analysis to support screening and validation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns peripheral biomarker detection with disease-relevant pathology for translational continuity.
- Supports longitudinal monitoring of aggregate spread in patient-derived samples.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking molecular pathology to clinical endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence assay bridges early discovery, target validation, and translational research by enabling quantitative detection of alpha synuclein aggregates in skin biopsies.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic clarification of protein aggregation in neurodegeneration.
- Screening: Provides validated, reproducible assay outputs for aggregate detection and quantification.
- Analytics: Generates spatial and intensity data for statistical comparison across patient cohorts and timepoints.
- Translational Research: Enables preclinical-to-clinical continuity through minimally invasive, repeatable sampling.
- Enterprise Reuse: Protocol adaptability allows targeting of additional proteins or disease models in peripheral nerves.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Standardizes sample processing and immunofluorescence analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing early, quantitative biomarker data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodegenerative disease assets based on validated pathology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands precise fixation, sectioning, and antibody handling to ensure signal specificity and minimize autofluorescence.
- Necessitates standardized protocols for cross-site and longitudinal reproducibility.
- Adaptable to other protein targets with validated antibody panels and controls.
- Potential limitations include tissue autofluorescence and nonspecific signal, requiring rigorous technical controls.
