Name: 完整毛里丝骨骼肌的X射线衍射作为研究肌肉疾病结构基础的工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学习利用X射线衍射技术对完整小鼠骨骼肌进行结构分析，以揭示遗传性肌肉疾病的发病机制。该方法可在生理条件下实时获取纳米级分辨率结构信息，为开发治疗策略提供重要依据。

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本研究使用了先进光子源的资源，先进光子源是美国能源部（DOE）科学办公室下属用户设施，由阿贡国家实验室根据合同号 DE-AC02-06CH11357 为能源部科学办公室运行。本项目获得了美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所授予的 P41 GM103622 拨款支持。Pilatus 3 1M 探测器的使用由 NIGMS 提供的 1S10OD018090-01 拨款资助。本内容仅由作者负责，不一定反映国立普通医学科学研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。

所有动物实验方案均经伊利诺伊理工学院机构动物护理和使用委员会（Protocol 2015-001，批准日期：2015年11月3日）批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH） &#34;实验动物护理和使用的指南&#34;9.
1. 实验前准备
<ol>
	<li>每次实验当天新鲜配制 500 mL 的任氏液（含：145 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.0 mM MgSO4、1.0 mM CaCl2、10.0 mM HEPES、11 mM 葡萄糖，pH 7.4）。</li>
	<li>将 200 mL 任氏液装入喷雾瓶中，置于 4 °C 冰箱中保存。取一个直径为 10 cm 的培养皿，加入任氏液，并通过将氧气钢瓶的导管连接至水族箱用气石，通入 100% 氧气进行灌流。该培养皿（&#34;解剖皿&#34;）预先涂覆有弹性体化合物，以便在解剖过程中插入固定针。</li>
	<li>制备金属固定钩。将两段直径为 0.5 mm 的不锈钢丝剪成适当长度，并将两端弯曲成钩状。准备好所有解剖工具，包括剪刀、打结镊子和显微剪刀，以便随时使用。 
	注意：钩部长度应约为 3 mm。较长的金属丝（末端为钩）总长度应约为&#160;5 cm&#160;，较短的金属丝（末端也为钩）总长度应约为&#160;1 cm&#160;，以适配 BioCAT 使用的定制腔室，并确保换能器臂具有足够的活动范围。&#160;</li>
	<li>连接并开启所有设备。包括组合式电机/力换能器、电机/力换能器控制器、高功率双相电流刺激器，以及由计算机控制的数据采集/控制系统。
	<ol>
		<li>开启数据采集系统，并在实验开始前对其进行校准10。简要步骤如下：在力换能器上逐级施加一组已知质量的砝码，其范围达到力换能器所测最大力的 50%，记录输出电压的变化以校准力信号；通过向杠杆臂施加一组已知的输出电压，测量臂长的变化，以校准长度信号。</li>
		<li>将样品架上的温控模块管道连接至制冷循环水浴，并设定水浴温度，使腔室内的温度维持在 10 °C 至 40 °C 之间。该温度需预先通过实验确定：将循环水浴设定在不同温度下，使用热电偶测量腔室内的实际温度，从而建立对应关系。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肌肉组织制备
<ol>
	<li>处死小鼠
	<ol>
		<li>通过吸入二氧化碳处死小鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>用冷的任氏液喷洒后肢皮肤，以防止毛发飘入组织样本中。使用精细解剖剪在大腿周围剪开皮肤，并用#5镊子迅速向下拉除皮肤，以暴露肌肉。</li>
		<li>截下后肢并转移至盛有充氧任氏液的解剖皿中，随后置于双目解剖显微镜下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备比目鱼肌
	<ol>
		<li>将后肢固定在解剖皿中，使腓肠肌朝上。剪断腓肠肌/比目鱼肌肌群的远端肌腱，并使用精细剪刀沿腓肠肌两侧剪除筋膜，轻柔缓慢地抬起肌肉。在松解比目鱼肌近端肌腱后，将腓肠肌/比目鱼肌肌群从肢体上分离。</li>
		<li>将包含腓肠肌及远端肌腱的肌群固定在解剖皿中。通过比目鱼肌的近端肌腱轻轻提起该肌肉，并将其从腓肠肌上分离，尽可能保留比目鱼肌远端肌腱的完整性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备趾长伸肌（EDL肌）
	<ol>
		<li>将后肢固定在解剖皿中，使胫前肌朝上。沿胫前肌（TA肌）切开筋膜，并用镊子将其清除。识别并剪断TA肌的远端肌腱。抬起TA肌，并小心将其切除，避免牵拉到EDL肌。</li>
		<li>切开膝关节外侧，暴露两条肌腱。剪断近端肌腱，尽可能保留肌腱与肌肉的连接，然后通过轻拉肌腱提起EDL肌（内侧肌肉）。当远端肌腱暴露后，将其剪断。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装肌肉
	<ol>
		<li>通过肌腱将肌肉固定在解剖皿中，并尽可能修剪掉多余的脂肪、筋膜和肌腱组织。将一端肌腱插入预先打好的结中，并使用持针钳将缝线扎紧。在金属钩周围打第二个结固定。</li>
		<li>对另一端肌腱上的长钩重复相同操作。确保缝线不接触肌肉本体，否则会损伤标本。</li>
		<li>将短钩连接至实验腔室底部，长钩连接至双模力传感器/电机。用100%氧气持续通入实验腔室中的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化刺激参数与肌肉长度
	<ol>
		<li>通过调节连接传感器/电机的微操纵器拉伸肌肉，在确定最佳刺激参数前，使基础张力维持在15至20 mN之间。将刺激电压设为40 V，系统性地增加刺激电流，直至抽搐力不再增加。在此最高电流基础上再增加约50%，以确保达到超最大激活。</li>
		<li>通过逐步增加肌肉长度并对肌肉施加单次抽搐刺激，寻找产生最大抽搐力的肌肉长度，即定义为最适长度L0，直至主动张力（峰值力减去基础张力）不再上升为止。</li>
		<li>进行一次短暂的强直收缩（持续1秒的激活），以测试安装效果，必要时将肌肉重新拉伸至最佳基础张力。使用数显卡尺记录肌肉长度（单位：mm）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. X射线衍射
注意：以下描述适用于在美国阿贡国家实验室先进光子源（Advanced Photon Source）BioCAT 18ID 光束线上的小角X射线衍射仪上进行的X射线衍射实验，但类似方法也可应用于其他光束线，例如欧洲同步辐射装置（ESRF，法国）的 ID 02 光束线和日本 SPring8 的 BL40XU 光束线。18ID 光束线以固定的X射线束能量 12 keV（波长 0.1033 nm）运行，全束入射通量约为每秒 1013 个光子。
<ol>
	<li>选择样品到探测器的距离（相机长度）。在检测2.7 nm肌动蛋白及高阶肌球蛋白衍射（如2.8 nm子午线衍射）的实验中，使用1.8 m的相机长度。在其他实验中，若主要关注子午线和层线上的精细结构，则使用4–6 m的相机长度。</li>
	<li>优化样品在光束中的位置
	<ol>
		<li>使用一张X射线敏感纸确定光束位置，该纸在X射线照射下会产生一个深色斑点（&#34;烧灼点&#34;）。然后使用视频十字线发生器，在视频图像上创建与烧灼点对齐的十字线，或直接用记号笔在视频屏幕上做标记。</li>
		<li>使用BioCAT提供的样品定位器图形用户界面，将肌肉样品移动至光束中心位置。通过移动样品台使样品室以约10–20 mm/s的速度振荡，以便在曝光期间将X射线剂量分散到肌肉的不同区域。观察样品运动过程，避免经过大面积筋膜区域（含胶原蛋白，会污染衍射图谱），并确保样品在整个运动路径中始终处于光照范围内。 
		注意：第3.3和3.4节中使用光束线提供的图形用户界面进行设置和操作的具体步骤，取决于具体光束线和探测器配置。请咨询光束线工作人员以了解如何执行这些操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为处于特定静态状态（静息状态或等长收缩期间）的肌肉设置CCD（电荷耦合器件）探测器以获取高分辨率图谱
	<ol>
		<li>在控制软件的图形用户界面中设置曝光时间和曝光周期。在采集曝光图像前，先获取一幅暗背景图像，并每隔2小时或在更改曝光时间后重复此步骤，以校正探测器读出电子元件可能发生的漂移。</li>
		<li>将X射线光束衰减至所需曝光强度，然后采集图像。该探测器无法连续采集图像序列，且每次读出单幅图像需要数秒时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为时间分辨实验设置像素阵列探测器
	<ol>
		<li>在图形用户界面中设置图像数量、曝光时间和曝光周期。此处使用的像素阵列探测器每次读出至少需要1 ms。光子计数探测器的最大帧频为500 Hz。使用光子计数探测器的输出信号控制X射线快门。</li>
		<li>将光束衰减至所需强度。启动探测器并等待数据采集系统的触发信号。通过同时触发机械和X射线数据采集实现同步。在整个实验过程中，以1 ms曝光时间和2 ms曝光周期连续采集X射线图谱。 
		注意：具体的曝光时间和曝光周期应根据所需信息内容及样品在光束中可维持的寿命逐案确定。应适当衰减光束，确保所用X射线强度不超过在选定曝光周期内获得可分析数据所需的最低水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 实验后肌肉处理
<ol>
	<li>每次力学和X射线实验后回收并称量肌肉。利用测得的肌肉长度和肌肉质量，假设肌肉密度为1.06 g/mL11，计算肌肉的横截面积12。</li>
	<li>将肌肉拉伸至实验所需长度，并用10%甲醛固定10分钟。将固定后的肌肉从整个肌肉横截面的不同位置分离出一系列肌纤维束3。</li>
	<li>使用视频肌节长度测量系统测定肌节长度。</li>
</ol>

<ol><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thick-Filament+Extensibility+in+Intact+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle.</a> Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).</li>
<li>Ma, W., Gong, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Head+Configurations+in+Resting+and+Contracting+Murine+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li>
<li>Kiss, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulin+stiffens+the+thin+filament+and+augments+cross-bridge+interaction+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).</li>
<li>Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pointed-end+capping+by+tropomodulin+modulates+actomyosin+crossbridge+formation+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).</li>
<li>Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fraction+of+strongly+bound+cross-bridges+is+increased+in+mice+that+carry+the+myopathy-linked+myosin+heavy+chain+mutation+MYH4%28L342Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q).</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).</li>
<li>Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+measurements+of+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+in+contracting+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).</li>
<li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+evidence+for+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).</li>
<li>Anderson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mavacamten+stabilizes+a+folded-back+sequestered+super-relaxed+state+of+%CE%B2-cardiac+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li>
<li>National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+%28U.S.%29+%26+National+Academies+Press+%28U.S.%29%22">Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.)</a>. , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Rand, C. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/">https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/</a> (2017).</li>
<li>Alexander, R. M. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+of+knee+and+ankle+muscles+and+the+forces+they+exert%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Movement+Studies%22%5BJournal%5D)">The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert.</a> Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).</li>
<li>Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+Muscle-Fiber+Types+and+Sizes+and+Muscle+Architectural+Properties+in+the+Mouse+Hindlimb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb.</a> Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).</li>
<li>Jiratrakanvong, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiratrakanvong%2C+J+%22MuscleX%3A+software+suite+for+diffraction+X-ray+imaging+V1.13.1%22">MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1</a>. , (2018).</li>
<li>Reconditi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+filament+activation+in+the+heart+is+tuned+to+the+mechanical+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们课题组近期发表的研究表明，小鼠骨骼肌的X射线衍射图谱可用于揭示健康与疾病状态下肌肉的肌节结构信息1,2,3，尤其是在各类肌病的基因修饰小鼠模型日益可得的背景下。结合单根肌纤维或小束肌纤维的高分辨率力学研究与X射线衍射技术，需由专业人员完成。然而，若仅需获取较为基础的力学信息，则可通过完整肌肉制备方法，从简单的样品中获得详细的X射线衍射图谱。
干净利落的解剖是成功进行机械与X射线联合实验的关键。在解剖过程中，必须避免牵拉目标肌肉以及与比目鱼肌或趾长伸肌相关的其他肌肉，因为这可能导致肌肉部分撕裂，从而降低收缩力，还可能破坏肌肉内部结构，影响X射线衍射图样的质量。由于所有物质都会对X射线产生散射，因此在执行以下实验步骤时，必须彻底清除多余的脂肪、筋膜中的胶原组织以及任何毛发或游离的组织碎片。为了减少肌肉标本的额外顺应性，应将肌腱牢固地绑在钩子上，绑扎位置应尽可能靠近肌肉本体，但不得损伤肌肉组织。
不同的X射线曝光时间可以从同一块肌肉中提供不同类型的信息。在18ID线站使用全束流时，1毫秒的曝光即可获得可分析的赤道衍射图谱（见图2D）。要获得可分析的第一肌球蛋白层线反射，通常需要10毫秒的总曝光时间。为了收集更高阶的子午线反射，例如M15（2.8 nm肌球蛋白子午线反射）和2.7 nm肌动蛋白子午线反射，通常至少需要1秒的总曝光时间，但为了实现高精度测量，建议总曝光时间超过2秒。
为实验选择最合适的X射线探测器至关重要。若需获取最精细的X射线图样，可使用定制的CCD探测器，例如BioCAT所配备的探测器，其像素约为40 µm，磷光体中的点扩散函数约为65 µm，能够提供高动态范围和良好空间分辨率的图样，但每次只能采集一帧图像。对于时间分辨实验，BioCAT的光子计数像素阵列探测器可实现每秒500帧的X射线图样采集。然而，该探测器的像素尺寸为172 µm，无法为子午线内层区域的精细研究提供足够的空间分辨率，但适用于大多数其他用途。BioCAT已获得一种高分辨率光子计数探测器，其在最高帧率9,000 Hz下可实现75 µm的实际分辨率。预计未来几年内，此类探测器将逐步取代当前用于肌肉研究的探测器。
在第三代同步辐射光源的极高X射线通量下，辐射损伤是一个严重的问题。通常建议衰减入射光束，使其强度不超过观察所需衍射特征所需的最低水平。通过延长衰减后光束的曝光时间，可以达到相同的总X射线曝光量。光子计数像素阵列探测器的一个优势在于，多个单独的帧可以无噪声 penalty 地进行累加。即便如此，仍可能发生辐射损伤。辐射损伤的迹象包括肌肉收缩最大张力下降、层线反射弥散，甚至肌肉颜色改变。
完整小鼠骨骼肌制备方法的一个局限性是在实验过程中难以获取完整肌肉的肌节长度。由于肌肉过厚，无法使用视频显微镜或激光衍射法进行测量。尽管随着未来技术的发展，或许有可能直接从衍射图样中估算肌节长度14，但在近期唯一可行的方法仍是在实验结束后按本文所述方式进行测量。

同步辐射小角X射线衍射是研究在生理条件下主动收缩的肌肉样品纳米尺度结构的首选方法。重要的是，可同步获取来自活体或去膜肌肉样品的结构信息以及肌肉力量和长度变化等生理数据。近年来，人们越来越关注将该技术应用于研究由肌节蛋白点突变引起的遗传性肌肉疾病的结构基础。肌肉生物物理学领域研究人员已积极构建了多种转基因小鼠模型，以模拟这些人类疾病状态，为结构研究提供了理想的实验平台。我们课题组1,2,3及其它研究团队4,5的最新研究表明，从小鼠趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌获得的X射线衍射图样能够提供与传统模式生物（如蛙和兔的腰大肌骨骼肌）同样全面的衍射信息。小鼠骨骼肌样品的优势在于解剖简便，并易于开展基本的细胞膜完整、整块肌肉水平的生理实验。解剖后肌肉的尺寸具有足够的质量，因而在第三代X射线光束线上，仅需极短的X射线曝光时间（约每帧毫秒级）即可获得高度精细的肌肉衍射图样。
肌肉X射线衍射图样包括赤道反射、子午线反射以及层线反射。赤道强度比（1,1与1,0赤道反射的强度之比，I11/I10）与附着的横桥数量密切相关，而横桥数量与小鼠骨骼肌产生的力成正比2。子午线反射反映了粗肌丝和细肌丝内部的周期性结构，可用于估算肌丝的可延展性1,3,6,7。不在子午线和赤道上的衍射特征称为层线，它们来源于粗肌丝主干表面近似螺旋排列的肌球蛋白头以及近似螺旋排列的细肌丝。肌球蛋白层线的强度与不同条件下肌球蛋白头有序程度密切相关2,8。所有这些信息可用于在健康和疾病状态下原位研究肌节蛋白的行为。
同步辐射X射线衍射技术在肌肉研究中的应用传统上由高度专业化的专家团队完成，但随着技术进步以及新型数据处理工具的出现，这种情况已不再必然。位于阿贡国家实验室先进光子源的BioCAT 18ID光束线配备了专职技术人员和支持设施，可协助该领域的新手开展肌肉X射线衍射实验。许多用户选择与BioCAT工作人员正式合作，但越来越多的用户发现他们能够独立完成实验和数据分析，从而减轻了光束线工作人员的负担。本文的主要目标是提供培训，使潜在的实验人员能够获得所需信息，以便在BioCAT光束线或其他全球范围内具备高通量条件的光束线上，针对小鼠骨骼肌系统开展实验的设计与实施。

<table><tbody><tr><td>#5 镊子</td><td>WPI</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>4/0 外科缝合线</td><td>Braintree Sci</td><td>SUT-S 108</td><td></td></tr><tr><td>水族箱用气石</td><td>uxcell</td><td></td><td>宠物店常见的普通气石即可</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>CCD 检测器</td><td>Rayonix Inc</td><td>MAR 165 CCD</td><td></td></tr><tr><td>数据采集系统</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>610A</td><td></td></tr><tr><td>弹性体化合物</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率光子计数检测器</td><td>Dectris Inc</td><td>EIGER X 500K</td><td></td></tr><tr><td>高功率双相电流刺激器</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>701</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>WPI</td><td>501263-G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>微型剪刀</td><td>WPI</td><td>503365</td><td></td></tr><tr><td>电机/力传感器</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>300C-LR</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>光子计数检测器</td><td>Dectris Inc</td><td>Pilatus 3 1M</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢丝</td><td>McMaster-carr</td><td>8908K21</td><td></td></tr><tr><td>缝合打结镊</td><td>WPI</td><td>504498</td><td></td></tr><tr><td>视频肌节长度测量系统</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>900B</td><td></td></tr></tbody></table>

x射线衍射技术用于完整小鼠骨骼肌以研究肌肉疾病的结构基础

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

转基因小鼠模型一直是研究基因型与表型关系的重要工具，包括骨骼肌相关人类疾病的研究。研究表明，小鼠骨骼肌在第三代同步辐射光束线上能够产生高质量的X射线衍射图谱，这为通过确定遗传改变的结构后果，将基因型水平的变化与健康和疾病中的功能表型联系起来提供了机会。本文提供了详细的实验样本制备、X射线图谱采集以及从X射线图谱中提取相关结构参数的实验方案，可为希望自行开展此类实验的研究人员提供指导。

等长强直收缩。可同时采集X射线图样的各种经典肌肉力学实验，例如等长或等张收缩，均可在此装置上进行。图1A展示了力学与X射线实验的装置示意图。图1B显示了一次等长强直收缩的力信号示例。肌肉在静息状态下保持0.5秒，随后被激活1秒，刺激结束后力学记录再持续1秒。X射线图样在整个实验过程中以每毫秒曝光、500 Hz的频率连续采集。
X射线衍射图谱。 肌肉X射线衍射图谱可提供来自肌节内部结构的纳米级分辨率结构信息。肌肉X射线衍射图谱由赤道线和子午线划分出的四个等效象限组成。赤道图谱来源于肌节内肌丝在纤维轴垂直方向上的排列结构，而子午线图谱则反映沿肌肉轴向的肌丝结构信息。不在赤道线或子午线上的其余衍射点称为层线。层线（例如 图2A 中标注的 MLL4 和 ALL6 特征）来源于含肌球蛋白的粗肌丝和含肌动蛋白的细肌丝中分子亚基的大致螺旋排列。在静息肌肉的图谱中，基于肌球蛋白的层线强而锐利（图2A），而在收缩肌肉的图谱中，基于肌动蛋白的层线更为明显（图2B）。通过从收缩状态图谱中减去静息状态图谱所获得的差值图谱（图2C），有助于揭示健康与病变肌肉在产生力量过程中的结构变化。通过追踪肌肉收缩过程中分子事件在毫秒时间尺度上的这些结构变化，X射线衍射图谱能够揭示出重要的结构信息（图2D）。
使用 MuscleX 进行数据分析。 以下是一个使用 MuscleX 软件包中的“equator”程序进行赤道反射分析的示例（图3）。MuscleX 是由 BioCAT 开发的一款开源分析软件包13。赤道强度比（I1,1/I1,0）是静息状态下肌球蛋白与肌动蛋白接近程度的指标（图3A），而在收缩状态的小鼠骨骼肌中，该比值与附着的横桥数量密切相关（图3B）2。静息肌肉中的强度比 I1,1/I1,0 约为 0.47，收缩肌肉中约为 1.2。两个 1,0 反射峰之间的距离（2*S1,0）与肌丝间距成反比。MuscleX 的详细文档和用户手册可在线获取13。
<img alt="肌肉收缩实验装置示意图，包含电机/力传感器；张力随时间变化的曲线图，显示各个阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：力学与X射线实验装置及实验流程。（A）肌肉一端固定在实验腔室内的钩子上，另一端连接双模式电机/力传感器。肌肉被夹在两片聚酰亚胺薄膜窗口之间，以允许X射线穿过。实验腔室中充满持续通入100%氧气的任氏液。（B）肌肉在强直收缩过程中进行X射线实验的力学实验流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质晶体学的X射线衍射图谱，显示衍射强度分布的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：EDL肌肉的X射线衍射图谱。 来自静息（A）和收缩（B）状态下EDL肌肉的X射线衍射图谱。（C）静息与收缩状态图谱之间的差值图谱。蓝色区域表示在静息图谱中强度较高，而黄色区域表示在收缩图谱中强度较高。（D）EDL肌肉在1 ms曝光时间下获得的X射线衍射图谱。MLL1 = 肌球蛋白第一级层线；MLL4 = 肌球蛋白第四级层线；ALL1 = 肌动蛋白第一级层线；ALL6 = 肌动蛋白第六级层线；ALL7 = 肌动蛋白第七级层线；Tm = 原肌球蛋白反射（由白色框标示）；M3 = 第三级赤道反射；M6 = 第六级赤道反射。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光谱分析；双光谱中的发射比比较；包含 I1/I0 值的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：使用 MuscleX 对赤道图样进行数据分析。 对扣除背景后的赤道强度比分布（同时区域）以及前五阶（绿色线条）进行拟合，以计算每个峰的强度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍了使用完整小鼠骨骼肌进行小角X射线衍射实验的详细方案。随着用于人类疾病研究的转基因小鼠模型日益普及，该实验平台可作为解析遗传性肌肉疾病结构基础的有效测试系统

X射线衍射技术用于完整小鼠骨骼肌以研究肌肉疾病的结构基础

转基因小鼠模型一直是研究人类疾病基因型与表型关系的重要工具，包括骨骼系统疾病等……

生理状态完整的鼠骨骼肌可产生高质量的X射线衍射图谱，其中包含大量结构信息，有助于深入理解生理过程。X射线衍射是唯一能够在真实生理条件下、于生理时间尺度内，从活体肌肉组织中获取高分辨率结构信息的技术。许多肌肉疾病具有遗传性。随着越来越多的肌病模型可用于基因改造，X射线衍射技术可为疾病机制提供结构层面的深入见解，并有助于提示治疗策略。其中，趾长伸肌和比目鱼肌最为适合用于此类研究。但小型动物的许多其他肌肉也可完整解剖并以类似方式处理。开始实验前，打开组合式电机力传感器、配备高功率双相电流刺激器的电机力传感器控制器，以及计算机控制的数据采集系统。接着，用冰冷的林格氏液喷洒小鼠后肢的皮肤，并使用精细解剖剪在大腿周围剪开皮肤。用5号镊子迅速向下拉除皮肤以暴露肌肉，随后截除后肢。将肢体置于含有充氧林格液的弹性涂层解剖皿中，并将解剖皿放置在双目解剖显微镜下。为分离比目鱼肌，用针固定后肢，使腓肠肌朝上。使用精细剪刀剪断腓肠肌/比目鱼肌肌群的远端肌腱。剪除腓肠肌两侧的筋膜，以便轻柔缓慢地将肌肉从骨头上分离。然后游离比目鱼肌的近端肌腱。将包含腓肠肌及远端肌腱的肌群固定在培养皿中。通过近端肌腱轻轻提起比目鱼肌，将其与腓肠肌分离，尽可能保留比目鱼肌远端肌腱的完整性。如需取材趾长伸肌（EDL），将后肢固定于培养皿中，使胫骨前肌朝上，沿胫骨前肌切开筋膜。用镊子将筋膜剥离，切断胫骨前肌的远端肌腱。提起胫骨前肌，小心将其分离，避免牵拉趾长伸肌，切开膝关节外侧以暴露两条肌腱。切断近端肌腱，尽可能保留肌腱与肌肉相连的部分，轻柔牵拉肌腱以提起趾长伸肌。待远端肌腱暴露后，将其切断。为了安装收获的肌肉，通过肌腱将肌肉固定，并尽可能修剪掉多余的脂肪、筋膜和肌腱。将一端肌腱插入预先打好的结中，并使用持针器将缝线扎紧。在金属钩周围打第二个结，并在肌腱的另一端重复此操作。然后将短钩连接至实验腔室底部，长钩连接至双模式力传感器电机。用100%氧气对实验腔室中的溶液进行鼓泡。为优化刺激程序和肌肉长度，调节连接在传感器电机上的显微操作器，使基础张力维持在15至20毫牛顿之间，以确定最佳刺激参数来拉伸肌肉。将刺激电压设置为 40 伏。系统性地增加刺激电流，直至抽搐力不再进一步增加。为确定最佳长度，逐步增加肌肉长度，并以单次抽搐刺激肌肉，直至主动张力不再增加。进行一次持续一秒的强直收缩，以检测固定情况，并根据需要将肌肉拉伸至最佳基线张力。然后使用数显卡尺以毫米为单位记录肌肉长度。为确定光束位置，使用一张对X射线敏感的纸张，该纸在受到X射线照射时会产生深色斑点，并结合视频十字线发生器生成十字线，使其与纸上的灼烧标记对齐。使用 BioCAT 提供的样品定位器图形用户界面，将肌肉置于光束位置中心，并移动样品台，使样品室以每秒 10 至 20 毫米的速度振荡，以便在曝光期间将 X 射线剂量均匀分布到整个肌肉组织。观察样品移动过程，避开含有胶原蛋白的大面积筋膜区域，并确保样品在其整个运动路径中始终处于光照范围内。启动探测器并等待数据采集系统发出的触发信号。然后同时触发机械信号和X射线数据以实现同步。在整个实验过程中，将以10毫秒的曝光时间和50毫秒的曝光周期连续采集X射线衍射图样。在此典型的等长强直收缩实验中，EDL肌肉在静息状态下保持0.5秒，随后激活1秒，接着进行1.5秒的松弛。肌肉的X射线衍射图样可提供来自肌节内部结构的纳米级分辨率结构信息。在静息肌肉的衍射图样中，包含粗肌丝的肌球蛋白层线强而锐利；而在收缩肌肉的图样中，包含细肌丝的肌动蛋白层线则更为明显。通过从收缩状态的图样中减去静息状态的图样所获得的差值图样，有助于揭示健康与病变肌肉在产生力量过程中发生的结构变化。通过追踪肌肉收缩与舒张过程中分子事件在毫秒时间尺度上的结构变化，X射线衍射图样能够揭示出重要的结构信息。在此以开源 MuscleX 软件包中的 Equator 程序进行的代表性赤道反射分析中，赤道衍射强度比值反映了静息状态下肌球蛋白与肌动蛋白之间的接近程度，并与小鼠骨骼肌收缩时附着的横桥数量密切相关。两个1,0反射峰之间的距离与肌丝间间距呈反比关系。干净的解剖是成功进行完整肌肉X射线实验的关键，因此在肌肉制备过程中应尽量避免任何机械损伤。这些实验中可以实施任何针对完整肌肉的标准生理学方案，可用于研究快速机械瞬变过程中的肌肉激活、舒张以及横桥行为。对小鼠的遗传操作正变得越来越复杂。 新的转基因小鼠模型将有助于设计更特异且深入的实验，以揭示人类肌病的新型治疗方向。

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发育生物学

完整毛里丝骨骼肌的X射线衍射作为研究肌肉疾病结构基础的工具

肌肉功能的测量有助于评估肌肉病理的潜在治疗方法，以及阐明该组织生理学的潜在机制。我们将演示趾长伸肌和膈肌的功能测试前处理。将展示等长收缩和离心收缩的实验方案，并比较代表病理状态的肌营养不良肌肉与野生型肌肉在实验结果上的差异。...

评估来自肌营养不良症小鼠模型的分离骨骼肌的等长和离心收缩力

四肢肌肉收缩性和被动力学特性的改变是肌肉疾病的重要生物标志物。本文描述了用于测量小鼠趾长伸肌和胫骨前肌这些特性的生理检测方法。...

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神经肌肉疾病通常表现出时间上动态变化、空间上异质性以及多方面的病理特征。本方案的目的是利用无创磁共振成像方法对这种病理特征进行表征。...

骨骼肌疾病的定量磁共振成像

此处展示了一种用于可视化脱细胞心脏组织中细胞外基质超微结构的方法。...

利用扫描电子显微镜观察离解组织以可视化细胞外基质

测量啮齿类动物骨骼肌的收缩功能是一种有用的工具，可用于追踪疾病进展以及评估治疗干预的效果。本文描述了一种非侵入性的、可在活体（in...

小鼠背屈肌功能的非侵入性评估

本文提出一种方法，可从纯合突变型Lamin...

单根肌纤维的分离与培养：早产后发育阶段Emery-Dreifuss型肌营养不良小鼠模型的研究

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。...

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

本方案采用微型计算机断层扫描技术，可对小型动物的瘦体组织（包括骨骼肌和内脏组织）、脂肪组织以及骨骼组织进行经济高效的定量分析。该方法能够区分瘦体组织与脂肪组织，这在生物医学研究中具有显著优势，尤其适用于小型动物的转化医学研究。...

利用微型计算机断层扫描技术对小型动物骨骼肌进行无创定量分析

许多蛋白质可形成淀粉样纤维，这些纤维具有共同的"交叉β-折叠"结构。本文介绍了如何制备用于X射线纤维衍射的淀粉样纤维样品，以及如何分析所得衍射图谱。...

淀粉样蛋白与交叉β结构

局部注射线粒体染料可标记终末施万细胞的线粒体 体内...

方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析

学习利用X射线衍射技术对完整小鼠骨骼肌进行结构分析，以揭示遗传性肌肉疾病的发病机制。该方法可在生理条件下实时获取纳米级分辨率结构信息，为开发治疗策略提供重要依据。

X射线衍射技术用于完整小鼠骨骼肌以研究肌肉疾病的结构基础

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