X射线衍射技术用于完整小鼠骨骼肌以研究肌肉疾病的结构基础

生理状态完整的鼠骨骼肌可产生高质量的X射线衍射图谱，其中包含大量结构信息，有助于深入理解生理过程。X射线衍射是唯一能够在真实生理条件下、于生理时间尺度内，从活体肌肉组织中获取高分辨率结构信息的技术。许多肌肉疾病具有遗传性。

随着越来越多的肌病模型可用于基因改造，X射线衍射技术可为疾病机制提供结构层面的深入见解，并有助于提示治疗策略。其中，趾长伸肌和比目鱼肌最为适合用于此类研究。但小型动物的许多其他肌肉也可完整解剖并以类似方式处理。

开始实验前，打开组合式电机力传感器、配备高功率双相电流刺激器的电机力传感器控制器，以及计算机控制的数据采集系统。接着，用冰冷的林格氏液喷洒小鼠后肢的皮肤，并使用精细解剖剪在大腿周围剪开皮肤。用5号镊子迅速向下拉除皮肤以暴露肌肉，随后截除后肢。

将肢体置于含有充氧林格液的弹性涂层解剖皿中，并将解剖皿放置在双目解剖显微镜下。为分离比目鱼肌，用针固定后肢，使腓肠肌朝上。使用精细剪刀剪断腓肠肌/比目鱼肌肌群的远端肌腱。

剪除腓肠肌两侧的筋膜，以便轻柔缓慢地将肌肉从骨头上分离。然后游离比目鱼肌的近端肌腱。将包含腓肠肌及远端肌腱的肌群固定在培养皿中。

通过近端肌腱轻轻提起比目鱼肌，将其与腓肠肌分离，尽可能保留比目鱼肌远端肌腱的完整性。如需取材趾长伸肌（EDL），将后肢固定于培养皿中，使胫骨前肌朝上，沿胫骨前肌切开筋膜。用镊子将筋膜剥离，切断胫骨前肌的远端肌腱。

提起胫骨前肌，小心将其分离，避免牵拉趾长伸肌，切开膝关节外侧以暴露两条肌腱。切断近端肌腱，尽可能保留肌腱与肌肉相连的部分，轻柔牵拉肌腱以提起趾长伸肌。待远端肌腱暴露后，将其切断。

为了安装收获的肌肉，通过肌腱将肌肉固定，并尽可能修剪掉多余的脂肪、筋膜和肌腱。将一端肌腱插入预先打好的结中，并使用持针器将缝线扎紧。在金属钩周围打第二个结，并在肌腱的另一端重复此操作。

然后将短钩连接至实验腔室底部，长钩连接至双模式力传感器电机。用100%氧气对实验腔室中的溶液进行鼓泡。为优化刺激程序和肌肉长度，调节连接在传感器电机上的显微操作器，使基础张力维持在15至20毫牛顿之间，以确定最佳刺激参数来拉伸肌肉。

将刺激电压设置为 40 伏。系统性地增加刺激电流，直至抽搐力不再进一步增加。为确定最佳长度，逐步增加肌肉长度，并以单次抽搐刺激肌肉，直至主动张力不再增加。

进行一次持续一秒的强直收缩，以检测固定情况，并根据需要将肌肉拉伸至最佳基线张力。然后使用数显卡尺以毫米为单位记录肌肉长度。为确定光束位置，使用一张对X射线敏感的纸张，该纸在受到X射线照射时会产生深色斑点，并结合视频十字线发生器生成十字线，使其与纸上的灼烧标记对齐。

使用 BioCAT 提供的样品定位器图形用户界面，将肌肉置于光束位置中心，并移动样品台，使样品室以每秒 10 至 20 毫米的速度振荡，以便在曝光期间将 X 射线剂量均匀分布到整个肌肉组织。观察样品移动过程，避开含有胶原蛋白的大面积筋膜区域，并确保样品在其整个运动路径中始终处于光照范围内。启动探测器并等待数据采集系统发出的触发信号。

然后同时触发机械信号和X射线数据以实现同步。在整个实验过程中，将以10毫秒的曝光时间和50毫秒的曝光周期连续采集X射线衍射图样。在此典型的等长强直收缩实验中，EDL肌肉在静息状态下保持0.5秒，随后激活1秒，接着进行1.5秒的松弛。

肌肉的X射线衍射图样可提供来自肌节内部结构的纳米级分辨率结构信息。在静息肌肉的衍射图样中，包含粗肌丝的肌球蛋白层线强而锐利；而在收缩肌肉的图样中，包含细肌丝的肌动蛋白层线则更为明显。通过从收缩状态的图样中减去静息状态的图样所获得的差值图样，有助于揭示健康与病变肌肉在产生力量过程中发生的结构变化。

通过追踪肌肉收缩与舒张过程中分子事件在毫秒时间尺度上的结构变化，X射线衍射图样能够揭示出重要的结构信息。在此以开源 MuscleX 软件包中的 Equator 程序进行的代表性赤道反射分析中，赤道衍射强度比值反映了静息状态下肌球蛋白与肌动蛋白之间的接近程度，并与小鼠骨骼肌收缩时附着的横桥数量密切相关。两个1,0反射峰之间的距离与肌丝间间距呈反比关系。

干净的解剖是成功进行完整肌肉X射线实验的关键，因此在肌肉制备过程中应尽量避免任何机械损伤。这些实验中可以实施任何针对完整肌肉的标准生理学方案，可用于研究快速机械瞬变过程中的肌肉激活、舒张以及横桥行为。对小鼠的遗传操作正变得越来越复杂。

新的转基因小鼠模型将有助于设计更特异且深入的实验，以揭示人类肌病的新型治疗方向。