使用声学纳米分配技术实现高通量DNA质粒多路复用和转染

本视频中开发的基于 Nano 组件的转染协议代表了第一种用户友好、高通量转染方法，甚至允许该领域的初学者取得成功。这在高通量技术上很容易，允许具有 384 独立条件的细胞转染。到目前为止，由于需要纳米体积的试剂，该方法成本低。

为了定义所有细胞类型的最佳转染参数，我们建议保持源DNA浓度恒定，并使用不同数量的转染DNA、转染试剂和细胞数量。要分配 40 微升电池悬浮液，请将 10 微升盒式磁带安装在近光液体处理设备上，并准备适当的程序。首先，将流速参数调整为低，以低速度分配细胞，以避免通过纯粹的应力和高冲击井底对细胞造成潜在损害。

然后，将分配高度调整为 11.43 毫米。在点胶过程中，高度必须足够高，以降低孔底的电池冲击，但足够低，以避免在点胶头上保留液滴。接下来，将板透明高度调整为 16 毫米，以便点胶每排后将点胶头自由位移在板上。

目视控制近视液体处理者头部高度的正确设置。在点胶时，确保点胶尖端上没有掉落。还要验证头部是否足够高，以允许在分配每一行后对头部进行位移。

为了生成选择列表来驱动 ADE 分配，开发了一个用户友好的电子表格宏，用于管理 DNA 量，并在 384 井板格式中混合多达四个质粒。最佳卷在电子表格的某些单元格中预先填充，但可以更改。在粉红色字段中，转染试剂（或 TR 混合物值）设置为 500 纳米光。

源板井中的最小体积值设置为四微升，源板井的最大体积设置为 11.25 微升。输入100纳米每个微升DNA开始浓度在蓝色领域对应的基础DNA。然后，在与板的 384 孔对应的灰色和绿色字段中输入所需的 DNA 量。

输入数量和质粒名称，并确保如果相同的质粒必须在几个孔中转染，请使用相同的拼写。单击生成选取列表以验证输入的值，如果请求，更正橙色填充单元格，指示错误或卷无法由 Nano 组件处理。如果未检测到任何情况，宏将从相应图纸上收集的数据生成 384 井点胶指南、DNA 选取列表文件和 TR 选取列表文件。

从源板打印模板，以可视化在点胶前要填充的油井。指示质粒名称和最小填充量。转染试剂混合物体积，将填充在以下孔，指示为TR，并突出显示为绿色。

要准备DNA源板，使用蒸馏水将储存的DNA质粒稀释至每微升100纳米。现在，将 384 井网格校准到板尺寸。在平板电脑上打开 384 井移液指南应用。

将源位置放在下部屏幕上的网格上。在左上角校准菜单中，单击正负可增强或减小网格和井的大小，以便将绿色井调整到板的四角井。使用双面胶带，将 3D 打印板适配器安装在屏幕上，以避免在点胶时发生源板移动。

如果需要，使用旋转箭头和向上、向下、向右、向左按钮移动已校准的网格，以将网格调整到板位置。一旦正确校准和定位网格和井尺寸，勾选锁校准框。单击文件并打开 384-井-管道指南。

csv 文件。按照屏幕说明手动将指定浓度的指定浓度的质粒指示体积分配到与预期板的正确目标相对应的白色高亮井中。在DNA点胶过程中，使用减或加箭头返回或进一步。

到达第一个转染试剂溶液进行加载时停止点胶。DNA 分配完成后，从适配器上取出源板。如果要填充多个源板，请将新的源板放在适配器上，然后按照点胶说明进行。

离心DNA填充源板，以确保适当的液体调平，并消除气泡，导致在 ADE 基转移不准确。现在，运行一个调查来控制手动分配的卷。在纳米组件 PC 上，运行纳米组件程序。

转到诊断选项卡，勾选源板出箱，将源板加载到板架上，然后勾选进入板。当提示时，384LDV_AQ_B2将 Nano 分配器设置为水缓冲缓冲器点胶模式，然后按"确定"。在杂项菜单中选择调查。然后点击启动。

选择要分析并单击"转到"按钮的预填充井。验证测量的体积与预期体积匹配，并确保未装载超过 12 微升的孔。用无血清介质填充新的无菌容器，用10毫升预热无血清介质填充管子，并淹没管内组织者。

按近位液体处理器的底按钮约 10 秒钟。通过目视检查点头的流量，确保尖端没有堵塞。将无菌 384 井培养板放在近位液体处理板托架上，并取下其盖子。

运行预校准程序，在 384 井板的每个井中分配一个微升。点胶时间约为 8 秒。然后更换 384 井板的盖子。

要设置 ADE 驱动的 DNA 点胶，请运行选取列表软件。将源的 384 孔设置为 384LDV。通过选择"水缓冲器"将设备设置为水缓冲384LDV_AQ_B2。

和目标板类型Greiner_384PS_781096。取消勾选优化传输吞吐量。选择选取列表选项卡。

单击导入。并选择DNA_Picklist_CSV文件。然后，单击播放并保存协议。

单击模拟以执行程序分配的模拟，以确保选取列表与预期的实验设计匹配。单击运行按钮并启动点胶程序。当询问时，插入请求的源板。

然后在纳米分配器中的目的地板。要建立转染试剂的分离，在生物安全柜中工作，将无血清介质中的脂质复性转染试剂稀释至1 x最终浓度，并涡旋管。立即根据宏的预定义源板，并使用预校准的 384 井移液导轨应用分配 TR 混合。

TR 点胶后，执行一项调查以控制 TR 加载的体积，就像以前对加载的 DNA 所做的一样。选择要分析的转染反应混合预填充井。然后点击"转到"按钮。

验证测量的体积与预期的体积匹配。并确保没有井装了超过12微升的体积。现在，在选取列表软件中执行 DNA 选择列表的重置。

验证设备参数是否仍设置为水缓冲区。输入正确的源和目标板类型。在"选取列表"选项卡上，单击重置以清除示例列表。

然后单击导入并选择TR_Picklist。CSV 文件。点击播放。

如果提示并执行程序转染试剂混合物分配的模拟，请保存协议，通过单击模拟按钮确保正确的设计。如前所述，单击运行按钮并启动点胶程序后，将源板和目标板按要求放在 NanoDipsenser 中。要分配细胞，请用准备好的细胞悬浮液填充新的无菌容器并搅拌它，以避免沉积导致不准确和细胞密度。

在溶液中插入管管理器。然后，按下底按钮，直到电池悬架开始从点胶头冲洗。通过在冲洗时目视检查来自点胶头的流量，确保尖端没有堵塞，并确保每个管都装有电池悬架。

现在，将DNA和TR填充的384井目标板加载到近源式液体处理板载体上，并取下其盖子。运行预校准程序，在完整的 384 井板上分配 40 微升的电池悬架。点胶时间约为 45 秒。

最后，更换384井板的盖子。利用脂复试剂对希拉细胞的转染成功。从5到30纳米的DNA量在一个微升稀释剂体积上显示出相同的效率，高达90%的细胞转染。

相比之下，较高的量导致转染细胞的百分比突然下降。测试了从15纳米升到4个微升的各种稀释剂体积，并确定了1个微升的最佳条件。为了进一步提高该协议的吞吐量，我们测试了两种有效的DNA存储方法，即干存储板或冷冻存储。

这两种存储方法没有导致与新分配的 DNA 溶液存储长达七天的结果显著不同。由于血浆转染通常至少使用两种不同的质粒，因此使用最佳识别条件对该协议的DNA多路复用能力进行了检查。先前使用的tdTomato红色荧光蛋白表达质粒被修改，以表达mVenus一种明亮的黄色荧光蛋白，然后两者都用于共转染尝试。

红色或绿色荧光阳性细胞分析表明，转染效率约为80%，然而，近100%的红细胞还与mVenus表达质粒的mVenus进行共膜移植，这可以从基于软件的代表性图像分析中看出。一旦DNA在源板中分配。执行调查以确保已加载预期卷且不超过 12 微升。

在源板中分配转染试剂时，尽量避免气泡，因为离心子板将导致转染功效完全丧失。该方法可应用于生物实验、犯罪和转染，适用于大部分可采用384井板格式进行。全防转染为新应用铺平了道路，例如以脆铸非筛选方法为名，这种质粒已知采用非筛选方法，能够监测间歇性影响，目前无法以不良策略进行排序。