Name: 微 Rna 对原生脂蛋白颗粒的富集及其与绝对相对微 Rna 含量及细胞转移速率的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学习使用定量实时PCR技术测定脂蛋白颗粒中微RNA含量的方法，并了解如何通过去脂化与重组技术富集微RNA，以及评估细胞摄取速率。该方法适用于神经科学与分子生物学研究。

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本工作得到了奥地利科学基金项目P29110-B21、“维也纳市高等教育纪念基金会促进科学项目”H-3065/2011、欧洲区域发展基金（EFRE, IWB2020）、上奥地利州联邦州以及“上奥地利州基础资助”的支持。

<ol><li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li>
<li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Synthesis%2C+mechanism%2C+function%2C+and+recent+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li>
<li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li>
<li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs%3A+Are+the+answers+in+sight%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li>
<li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li>
<li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor%2C+class+B%2C+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins%2C+low+density+lipoproteins%2C+and+nonlipoprotein+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li>
<li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li>
<li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%5D+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li>
<li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li>
<li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li>
<li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文逐步描述了从人血液中分离脂蛋白颗粒组分并测定其各自miRNA含量的方法。在处理分离和合成的miRNA时，必须在无RNase的环境中操作——而嵌入颗粒中的miRNA显然可免受酶降解。由于天然脂蛋白颗粒中的miRNA/颗粒比例较低，因此需要人为富集miRNA，以研究全颗粒被细胞摄取的过程。为此，对先前所述的HDL颗粒重建方法7进行了改进，以将miRNA链整合入颗粒中。此外，该过程中脂质组分与蛋白质组分的分离，使研究人员能够分别分析脂蛋白颗粒中与脂质和蛋白质相关的组分19。类似地，LDL颗粒的标记方法也进行了相应调整。有趣的是，添加精胺（一种核苷酸的天然稳定剂）并未影响miRNA/颗粒的比例。需要注意的是，原则上该方法允许将除miRNA以外的其他物质包载入脂蛋白颗粒中。当然，包载物质的物理尺寸受限于HDL颗粒（直径：5–12 nm）和LDL颗粒（直径：18–25 nm）的整体大小。
关于重组或标记脂蛋白颗粒的质量控制，高速原子力显微镜（HS-AFM）是一种可在单颗粒水平上表征高密度脂蛋白（HDL）/低密度脂蛋白（LDL）颗粒的适用方法。与电子显微镜（EM）相比，该方法具有更短的样品制备时间，并可在接近生理条件（湿润环境、室温）下进行。
由于其固有的高灵敏度和扩增能力，qPCR 是检测低浓度 miRNA 的首选方法。相比之下，尽管单分子灵敏度的荧光显微镜能够检测单个分子，但由于每个颗粒中荧光标记的 miRNA 链浓度极低，因此并不适用。据研究发现，每个天然脂蛋白颗粒中的 miRNA 链数量比为 10-8。人工富集可使该比值提高 10,000 倍，从而有助于估算细胞对脂蛋白的摄取速率（使用天然脂蛋白颗粒检测时无显著差异19）。qPCR 的高灵敏度使得通过测量孵育时间后的 miRNA 链数量以及 miRNA/颗粒比值来确定该摄取速率成为可能。需要注意的是，所计算的数值忽略了细胞内 miRNA 的降解和释放，因此仅代表脂蛋白颗粒摄取比值的最低下限。
未来，该方法可被用于将药物物质（尤其是脂溶性药物）转入细胞，并将其生物学效应与细胞内浓度相关联（通过脂蛋白颗粒的摄取速率来确定）。

脂蛋白颗粒由单层两亲性脂质和胆固醇组成，包裹着胆固醇酯和甘油三酯脂肪的核心。整个颗粒由嵌入膜中的载脂蛋白稳定，这些载脂蛋白决定了颗粒的生物学功能。根据其密度依次增加、相应粒径逐渐减小的特性，可将脂蛋白颗粒区分为极低密度脂蛋白（VLDL）、中等密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）颗粒。尽管脂蛋白的主要功能是在血液中运输水不溶性成分，但已有研究表明，HDL颗粒能够携带非编码的miRNA1,2。微小RNA（micro-RNA，miRNA）是一类短链RNA（通常约二十多个核苷酸），可在细胞内降解互补的mRNA链，从而改变特定蛋白质的表达谱3,4,5,6。此外，在多种疾病中已发现miRNA表达谱的改变，因此其表达谱可作为疾病诊断与预后的生物标志物。通过脂蛋白颗粒在细胞间进行miRNA的胞外运输，可能构成细胞间mRNA水平调控的另一种机制。为了定量评估其生物学效应，需要了解脂蛋白颗粒中miRNA的绝对含量与相对含量。
定量实时PCR是一种适合且相对快速获取该信息的方法。因此，可计算出相对定量（RQ）值，并可估算不同样本及脂蛋白组分之间的相对差异。多孔微流控阵列芯片是一种快速且易于使用的方法，用于测定样本中miRNA的相对存在量（相当于RQ值）。多孔微流控阵列芯片包含96或384个独立反应腔室，这些腔室集成于微流控装置中，用于分别进行qPCR反应。每个腔室均含有针对单个miRNA所需的水解探针和特异性qPCR引物。其优点包括由于标准化带来的较短操作时间、简单的操作流程以及减少的移液步骤。此外，所需样本体积也被最小化。与相对定量不同，绝对miRNA含量的测定需要将qPCR样本结果与已知绝对数量miRNA链的标准曲线进行比较。需要注意的是，由于其miRNA含量相对较低，常规甚至单分子敏感成像技术均不可行——为研究细胞与脂蛋白颗粒的相互作用及miRNA转移，必须对脂蛋白颗粒进行人工miRNA富集。在此方面，对HDL颗粒进行去脂化处理，随后进行再脂化7，可实现miRNA链的掺入和富集。由于apoB-100蛋白具有强疏水性，而该蛋白是LDL颗粒的主要组成成分，因此类似地对LDL颗粒进行miRNA富集不可行。然而，通过添加能够穿透脂质膜的极性溶剂二甲基亚砜（DMSO），也可实现LDL颗粒的人工miRNA加载。
高速原子力显微镜（HS-AFM）是一种强大的生物样品表征工具，具有亚纳米级的空间分辨率和亚秒级的时间分辨率8。因此，该技术非常适合用于修饰脂蛋白颗粒的质量控制，因为天然/重组/标记的脂蛋白颗粒可在接近生理的环境中进行成像。
本文逐步介绍了一种基于qPCR的实验方案，用于测定脂蛋白颗粒和细胞样品中miRNA的绝对/相对含量，从而可估算细胞对脂蛋白颗粒的摄取速率。此外，还展示了一种使miRNA在脂蛋白颗粒中富集的方法。该方法可适用于对脂蛋白内容物的一般性操控，因而证明了脂蛋白颗粒作为药物递送靶标的可行性。

<table><tbody><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP</td><td>脂蛋白分离</td></tr><tr><td>超速离心机转子</td><td>Beckman</td><td>TI 55.2</td><td>脂蛋白分离</td></tr><tr><td>真空采血管（EDTA）</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>脂蛋白分离</td></tr><tr><td>溴化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2110</td><td>脂蛋白分离</td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman</td><td>342414</td><td>脂蛋白分离</td></tr><tr><td>超速离心管密封器</td><td>Beckman</td><td>342428</td><td>脂蛋白分离</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>脂蛋白分离</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0650/50</td><td>脂蛋白分离</td></tr><tr><td>透析管，截留分子量 12 - 14k</td><td>Spectra</td><td>132700</td><td>脂蛋白分离</td></tr><tr><td>合成miRNA</td><td>microSynth</td><td>-</td><td>合成miRNA</td></tr><tr><td>TRIS缓冲液 pH 7</td><td>Ambion</td><td>AM9850G</td><td>合成miRNA</td></tr><tr><td>TRIS缓冲液 pH 8</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>合成miRNA</td></tr><tr><td>无菌管</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>ENE8.1</td><td>合成miRNA</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Biophotometer</td><td>Bradford测定</td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>XK20</td><td>Bradford测定</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝G-250染料</td><td>BioRad GmbH</td><td>161-0786</td><td>Bradford测定</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957.1</td><td>去脂化</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka Analytical</td><td>03690-100ML</td><td>去脂化</td></tr><tr><td>TRIS缓冲液 pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>去脂化</td></tr><tr><td>乙醇 100%</td><td>AustrAlco</td><td>Ethanol Absolut 99.9%</td><td>去脂化</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3942.1</td><td>去脂化</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>Multifuge X3R</td><td>去脂化</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>再构建</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4627.1</td><td>再构建</td></tr><tr><td>磷脂酰胆碱</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>P3556-25mg</td><td>再构建</td></tr><tr><td>胆固醇油酸酯</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C-9253-250mg</td><td>再构建</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C8667-500mg</td><td>再构建</td></tr><tr><td>玻璃管</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K226.1</td><td>再构建</td></tr><tr><td>精胺</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>S3256-1G</td><td>再构建</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td>再构建</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>3097-25G</td><td>再构建</td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0955.2</td><td>再构建</td></tr><tr><td>100&amp;micro;L 微量移液器</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A762.1</td><td>再构建</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9143.2</td><td>透析</td></tr><tr><td>Amberlite XAD-2 树脂珠</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>10357</td><td>透析</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析盒（截留分子量 20 kDa）</td><td>Thermo Scientific</td><td>66003</td><td>透析</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>透析</td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>Braun</td><td>465 76 83</td><td>透析</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3054.2</td><td>LDL颗粒标记</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>life technologies</td><td>D12345</td><td>LDL颗粒标记</td></tr><tr><td>原子力显微镜</td><td>RIBM</td><td>SS-NEX</td><td>再构建/标记脂蛋白颗粒的质量控制</td></tr><tr><td>云母（V-1级）</td><td>Christine Gr&amp;ouml;pl</td><td>G250-1/V1</td><td>再构建/标记脂蛋白颗粒的质量控制</td></tr><tr><td>AFM悬臂梁</td><td>Nanoworld</td><td>USC-F1.2-k0.15</td><td>再构建/标记脂蛋白颗粒的质量控制</td></tr><tr><td>Gwyddion 2.49</td><td>捷克计量研究院</td><td>http://gwyddion.net</td><td>再构建/标记脂蛋白颗粒的质量控制</td></tr><tr><td>细胞培养腔室载玻片，Nunc Lab-Tek</td><td>VWR</td><td>734-2122</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9117.1</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Omni Life Science GmbH</td><td>Casy</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td>miRNA提取</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>miRNA提取</td></tr><tr><td>20G针头</td><td>Braun</td><td>Sterican 465 75 19</td><td>miRNA提取</td></tr><tr><td>5ml注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309050</td><td>miRNA提取</td></tr><tr><td>PCR操作柜</td><td>Esco</td><td>PCR-3A1</td><td>逆转录</td></tr><tr><td>TaqMan逆转录试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td>逆转录</td></tr><tr><td>无RNase水</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T143</td><td>逆转录</td></tr><tr><td>0.2 ml 管</td><td>Brand</td><td>781305</td><td>逆转录</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Microcentrifuge AL</td><td>逆转录</td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>逆转录</td></tr><tr><td>TaqMan引物</td><td>Thermo Scientific</td><td>-</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>iTaq通用探针预混液</td><td>BioRad GmbH</td><td>1725131</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>Corbett</td><td>Rotor-Gene RG-6000</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>Megaplex RT引物，人A池 v2.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4399966</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4391128</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp引物，人A池 v2.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4399933</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>TaqMan通用主混合液II，不含UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>TaqMan Advanced miRNA人A芯片</td><td>Applied Biosystems</td><td>A31805</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0971</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>TE缓冲液，pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>7900HT快速实时PCR系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351405</td><td>TaqMan阵列</td></tr><tr><td>TaqMan阵列芯片封膜仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>-</td><td>TaqMan阵列</td></tr></tbody></table>

天然脂蛋白颗粒中microrna的富集及其绝对/相对microrna含量与细胞间转移速率的测定

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

脂蛋白颗粒主要在血液中运输脂质和胆固醇。此外，它们还含有少量非编码微小RNA（miRNA）。通常情况下，miRNA通过与信使RNA（mRNA）相互作用来改变蛋白质的表达谱。因此，了解脂蛋白颗粒中miRNA的相对含量和绝对含量，对于评估细胞摄取颗粒后的生物学效应至关重要。本文介绍了一种基于定量实时聚合酶链式反应（qPCR）的实验方案，用于测定脂蛋白颗粒中miRNA的绝对含量——以天然状态及miRNA富集的脂蛋白颗粒为例进行说明。相对miRNA含量则通过多孔微流控阵列芯片进行定量。此外，该方案还可使科研人员估算细胞内的miRNA水平，从而推断脂蛋白颗粒的摄取速率。当使用人工加载miRNA的高密度脂蛋白（HDL）颗粒时，可观察到细胞内miRNA水平显著升高；而由于天然HDL颗粒的miRNA含量较低，其与细胞共孵育后并未引起显著变化。相比之下，无论低密度脂蛋白（LDL）颗粒本身是否含有天然miRNA或经人工加载miRNA，其细胞摄取过程均未改变细胞内miRNA水平。

脂蛋白颗粒分离的通用方案 
图1展示了从全血开始，通过逐步漂浮超速离心法分离脂蛋白颗粒的通用流程16。根据需要，可在本实验过程中收集其他脂蛋白颗粒组分，如极低密度脂蛋白（VLDL）和中密度脂蛋白（IDL）颗粒。固定角钛转子与聚丙烯快速密封管的组合可耐受离心过程中产生的作用力。为防止试管塌陷，必须避免试管中存在气泡。离心过程在4 °C下进行，以最大限度减少蛋白质降解。通常从三位志愿者混合捐献的血浆（每位供者60–80 mL）开始，预计可分别获得约3 mL的低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）颗粒溶液，浓度范围为1–3 mg/mL。整个流程从采血开始，耗时约7天。
<img alt="采用不同转速和温度进行密度梯度离心的脂蛋白分离流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59573/59573fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1： 脂蛋白分离流程图。 使用真空采血管采集健康志愿者的血液，离心后收集血浆（上层相）。加入溴化钾（KBr）调节血浆密度至 ρ = 1.019 g/mL，于 4 °C 条件下以 214,000 × g 离心 20 小时。取下层组分，再次用 KBr 调节其密度至 ρ = 1.063 g/mL，于 4 °C 条件下以 214,000 × g 再次离心 20 小时。将含有低密度脂蛋白（LDL）颗粒的上层组分暂时储存在 4 °C。取剩余下层组分，用 KBr 调节其密度至 ρ = 1.220 g/mL，于 4 °C 条件下以 214,000 × g 连续两次离心，每次 20 小时。收集含有高密度脂蛋白（HDL）颗粒的上层组分，对 HDL 和 LDL 颗粒溶液均进行透析，并在 1、2 和 4 小时后更换缓冲液。24 小时后测定蛋白浓度，并将样品在惰性气体保护下储存于 4 °C。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59573/59573fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
高密度脂蛋白（HDL）颗粒的重建 
高密度脂蛋白（HDL）颗粒的重建按照 Jonas 之前发表的方案进行7。第一步是 HDL 颗粒的去脂化，如图2A所示；第二步是再脂化（即重建）过程，如图2B所示，使用磷脂酰胆碱（PC）、胆固醇（CO）和胆固醇酯（C），并加入 microRNA（miRNA）与亚精胺的混合物。我们选择人成熟 miR-223 和 miR-155，因为 miR-223 在脂蛋白颗粒中含量较高，而 miR-155 则较为稀少17。通常，这两个步骤在连续两天内完成。在重建过程中，可根据需要加入其他脂溶性或两亲性成分。PC、CO 和 C 所用的乙醇/乙醚以及甲醇/氯仿溶剂必须完全蒸发，这是关键步骤。最后一步如图2C所示，为透析过程，以分离重建后的 HDL 颗粒（rHDL）与游离脂质/miRNA/去垢剂，此过程需额外 1–2 天。在透析液中加入吸附珠可维持透析膜两侧的密度梯度恒定。rHDL 颗粒的产率约为 50%。
<img alt="HDL 制备示意图；显示去脂化、miRNA 相互作用、透析步骤；仅供研究使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59573/59573fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2： 高密度脂蛋白颗粒重建流程图 (A) 去脂化：将HDL颗粒溶液与预冷的乙醇/乙醚混合，并在 -20 °C 2小时。弃去上清液后，重悬沉淀并重复该步骤。用N₂干燥沉淀2 气体并重悬于缓冲液A中。测定浓度后，将去脂化HDL在惰性气体氛围下保存于 4 °C. (B) 重构：将磷脂酰胆碱（PC）、油酸胆固醇酯（CO）和胆固醇（C）混合后，使用氮气蒸发溶剂2 旋转试管的同时通入气体。将miRNA等分试样与亚精胺溶液在30分钟内孵育 30 °C，加入脱氧胆酸钠并重悬干燥的脂质膜。将样品搅拌2 h，于 4 °C，加入去脂质的HDL溶液，再次搅拌样品，此次在4°C下过夜搅拌 4 °C 在惰性气体氛围下。 (C透析：将溶液从图示面板转移 B 将含有重组高密度脂蛋白（rHDL）颗粒的溶液加入透析膜腔室（分子量截留值：20 kDa），用磷酸盐缓冲液（PBS）和吸附珠进行透析 4 °C. 在1小时和2小时后更换缓冲液和磁珠。24小时后收集重组高密度脂蛋白（rHDL）颗粒溶液，测定其浓度，并将样品在惰性气体氛围下保存于 4 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59573/59573fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
LDL 颗粒的标记 
由于载脂蛋白 apoB-100 是 LDL 颗粒的主要组成成分，具有疏水性，因此如 HDL 颗粒所示的 miRNA 标记方法（图 3）在 LDL 颗粒上不可行。使用 DMSO 穿透 LDL 颗粒的脂质单层，从而介导 miRNA 的结合。整个过程耗时 1–2 天，标记效率接近 100%。
<img alt="通过精胺DMSO和LDL缓冲液标记miRNA；示意图显示了吸水珠和透析装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59573/59573fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3： LDL颗粒标记流程图。 将miRNA等分试样与精胺溶液在30 °C下孵育30分钟，然后加入DMSO和LDL缓冲液。将LDL样品在冰上用LDL缓冲液孵育10分钟，随后加入miRNA/精胺/DMSO混合物。在40 °C下孵育2小时后，将溶液转移至透析膜腔室（分子量截留值：20 kDa），在+4 °C下用PBS和吸水珠进行透析。分别在1小时和2小时后更换缓冲液和吸水珠。24小时后回收标记的LDL颗粒溶液，测定浓度，并在惰性气体环境中+4 °C保存。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59573/59573fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
脂蛋白颗粒的质量控制 
高速原子力显微镜（HS-AFM）可用于在云母表面观察天然及重组/标记脂蛋白颗粒的大小和形状。使用前必须对云母进行新鲜解理（使用胶带剥离其上层），以获得洁净且平整的表面。在将高密度脂蛋白（HDL）/低密度脂蛋白（LDL）颗粒孵育于云母表面时，需调整稀释倍数（和/或孵育时间），以便观察到单个颗粒。聚集的颗粒无法用于测定颗粒尺寸。HDL颗粒在云母表面具有移动性。若使用常规原子力显微镜而非HS-AFM，则需相应调整固定化方案（缓冲液、表面涂层），以降低颗粒的侧向移动性。扫描样品时，必须保持较低的成像作用力（轻敲模式），以避免颗粒发生形变，从而影响测量结果。在数据分析中，通过阈值算法（例如在Gwyddion软件中：颗粒 &gt; 按阈值标记）识别颗粒，并相对于云母表面测定其高度。测量颗粒高度是确定颗粒尺寸最精确的方法，因为横向尺寸会因探针形状而产生展宽效应（参见图4中的示例图像）。为进行统计评估和比较不同脂蛋白颗粒的尺寸分布，计算了颗粒高度的概率密度函数（pdfs）。如图4所示，对天然LDL颗粒与miRNA标记的LDL颗粒进行比较，可验证标记与未标记（即天然）脂蛋白颗粒在结构上的基本相似性（未添加miRNA/精胺混合物的标记LDL颗粒作为标记操作本身的对照）。整个过程耗时约1天。
<img alt="原子力显微镜高度分析示意图；云母表面HDL/LDL检测；直方图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59573/59573fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：高速原子力显微镜（HS-AFM）测量的流程图及代表性结果。 将HDL/LDL颗粒样品用PBS稀释（1:102-1:103），滴加于新解理的云母表面，孵育5分钟，随后用PBS小心冲洗，以去除未结合（非静电吸附）的游离颗粒。进行HS-AFM成像，并检查表面颗粒密度。在室温下以PBS为缓冲液进行测量。本图上方图像显示颗粒密度过高；下方图像适合用于分析。经阈值处理后，对单个颗粒的高度进行分析，并在统计评估中比较天然颗粒（黑色曲线）与重组/标记颗粒（红色和绿色曲线）。比例尺 = 100 nm。该图改编自Axmann等19。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59573/59573fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
miRNA 提取、逆转录与qPCR 
采用miRNA提取试剂盒从天然/人工富集的脂蛋白或细胞样本中提取miRNA，如图5A所示。此过程需在无RNase的环境中进行，极为关键。该步骤耗时约1 h。对提取的miRNA样本进行逆转录（如图5B所示），依据试剂盒制造商提供的标准生化操作流程进行，耗时约1.5 h。最后，采用qPCR测定上一步所得cDNA的含量（如图5C所示）。通过标准曲线将获得的cq值与miRNA绝对链数关联，从而计算出初始样本中miRNA的绝对含量。该步骤耗时约2.5 h。
<img alt="miRNA 提取与 qPCR 流程；三步图示中的离心步骤及 RT-PCR 分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59573/59573fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：miRNA提取、逆转录与qPCR流程图 (A) miRNA 提取：将样品与裂解试剂混合，使用注射器抽吸裂解。孵育 5 分钟，加入 CHCl3剧烈振荡15秒，孵育3分钟。随后在1,200 x g 15 分钟 4 °C，收集上层相并与乙醇混合。将溶液转移至离心柱中（最大体积 &lt;700 µL) 并在 8,000 x g 15秒。弃去洗脱液，用剩余溶液重复上一步骤。加入第一种洗涤缓冲液，于8,000 x g 15秒。弃去洗脱液，加入第二种洗涤缓冲液，8,000 x g 15秒。以2分钟的离心时间重复上一步骤。再以最大转速离心1分钟，进一步干燥膜。用H2O并以80,000 x g 1分钟。将提取的miRNA样品在-20 °C. (B逆转录：将10x缓冲液、H2将 O、dNTP 混合液、抑制剂和酶置于冰上，并配制主混合液。从面板中加入提取的 miRNA A 将反转录引物加入主混合液中，使用PCR仪进行反转录反应。将cDNA样品保存于-20 °C. (C) qPCR：解冻超级混合液，H2O，并将引物置于冰上，准备配制混合液。加入来自板的cDNA B 加入到混合液中并进行qPCR。分析数据以获得cq 数值并计算样品中miRNA的绝对含量（参见 图6 以及代表性结果的详细信息）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59573/59573fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
miRNA 绝对含量与转移速率 
天然及人工富集的高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）颗粒中miRNA的绝对含量，是根据样品的cq值以及相应miRNA的标准曲线计算得出，如图6所示。图6A展示的数据由分析软件计算获得（启用了DynamicTube 归一化功能，用于通过各样品扩增曲线的二阶导数校正不同背景信号水平，以及噪声斜率校正，即根据噪声水平进行归一化）。标准曲线的cq值是通过qPCR仪器测得的归一化荧光信号，并使用软件包中的自动阈值识别（Auto-find threshold）功能确定。该过程中，软件会最大化标准曲线拟合的R值。在针对每种特定miRNA的样品分析中，阈值水平保持恒定。随后，将cq值对miRNA分子拷贝数作图，并拟合得到回归直线。样品的cq值采用与标准曲线相同的阈值确定，如图6B所示；不同qPCR运行之间的反应效率差异，通过每次运行中加入的一个额外校准曲线样品，由软件自动校正。利用回归方程，即可计算出样品中未知的miRNA含量。脂蛋白颗粒数量是根据初始蛋白浓度及其平均分子量（MWHDL ~250 kDa）估算得出。此估算未考虑脂质对分子量的贡献，因此每个脂蛋白颗粒所携带的miRNA拷贝数略有高估。此外，假设miRNA提取步骤的回收率为100%。进一步地，测定细胞在与HDL颗粒孵育前后细胞内的miRNA含量，并据此计算miRNA的转移速率，如图6C所示。
<img alt="定量 PCR 分析，包括荧光扩增曲线图、自动阈值设定及数据表格。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59573/59573fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：绝对miRNA含量与转移率的计算流程图 (AmiR-155标准曲线：取一份miR-155等分试样（100 µL, 10 µM) 用无 RNA 水按所示进行连续稀释。qPCR 得到 cq 每个系列稀释样品（测量两次）的数值，使用 自动查找阈值 软件包的功能。阴性对照实验（未添加miRNA）产生了cq 值 &gt;35. c 的数据点q 根据初始浓度和系列稀释计算得到的每单位样品体积中的miRNA链数，其数值通过所示方程进行拟合（红色线条，右图），得到 M = -3.36 和 B = 42.12。测定的PCR效率为0.98。误差线根据实验重复结果计算得出，且小于数据点圆圈的直径。Bcq 天然/人工富集HDL颗粒的数值采用与图中所确定的相同阈值水平进行测定 A 并转换为qPCR样本体积中miRNA链的数量。根据样本体积中HDL颗粒的数量（浓度）（3.2 x 1011 颗粒）。C细胞样品（细胞系 ldlA7-SRBI）与人工富集的HDL颗粒共同孵育16小时（50 µg/mL）并进行类似分析。所确定的 cq 仅含细胞、细胞与天然HDL共孵育、或细胞与rHDL颗粒溶液共孵育的值分别为22.5、22.5和19.3（两者） 50 µg/mL），分别。这些数值已如图示面板所示转换为miRNA链的数量 B孵育后的miRNA链数量（7.3 x 106) 通过减去孵育前的miRNA链数量（8.6 × 105）。将结果除以样本体积中的细胞数量（3,100），得到miRNA-颗粒比（1.5 x 10-4），以及孵育时间（16 小时）。由此得出通过miRNA摄取介导的脂蛋白颗粒转移速率（每细胞每秒240个HDL颗粒摄取事件）。该数据经Axmann等修改而来。19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59573/59573fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
多孔微流控阵列 
由于miRNA提取产量较低，提取后需对miRNA进行逆转录，并随后进行预扩增步骤。最后进行qPCR，如图所示 图6，进行了实验。所有步骤均按照制造商所述的标准生化操作程序进行。此处提供了针对一项关于慢性肾功能衰竭（CRF）对巨噬细胞胆固醇外流影响研究中招募的尿毒症患者HDL颗粒上全局miRNA谱的部分分析结果。18 如图所示。本研究测定了17例年轻成人尿毒症患者（CKD 3-5期）和14例年轻成人血液透析患者（均无伴随疾病）以及相匹配的对照组的血清或高密度脂蛋白（HDL）胆固醇接受能力。数据分析采用默认设置（最大允许CT值：40.0，计算中包含最大CT值，并排除重复样本中的离群值）。 P-值通过以下方法进行校正： 本杰明尼-霍赫伯格错误发现率 （减少假阳性结果的发生）以及作为归一化方法， 全局归一化 选择在所有样本中均存在的共同检测项目，并采用其 C 值的中位数T 用于标准化。在代表性结果中，展示了从尿毒症患者高密度脂蛋白（HDL）中分离的某些miRNA的相对定量值（RQ）（对照组RQ为1）。显然，miR-122和miR-224在尿毒症患者HDL中高表达。此步骤共耗时约1天。
<img alt="逆转录、热循环仪和结果图表的PCR过程示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59573/59573fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：多孔微流控阵列的流程图及代表性结果。 如图5A所示完成miRNA提取后，将miRNA样本与逆转录引物以及含有10×缓冲液、H2O、dNTP混合物、抑制剂、MgCl2和酶的主混合液混合。冰上孵育5分钟后，使用热循环仪进行逆转录反应。加入预扩增主混合液，冰上孵育5分钟，随后使用热循环仪进行预扩增。加入0.1× TE（pH 8.0），取部分产物与PCR主混合液和H2O混合。将PCR反应混合液移入多孔微流控阵列的加样口，以3,000 × g离心两次，每次1分钟。使用PCR系统进行qPCR，并分析数据以获得相对定量值（RQ值）（本图显示了尿毒症患者高密度脂蛋白颗粒的RQ值与健康对照组的比较18）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59573/59573fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种基于定量实时聚合酶链式反应的方法，用于测定脂蛋白颗粒中内源性微小RNA的含量（绝对/相对含量）。此外，还展示了提高微小RNA水平的方法，以及测定细胞对脂蛋白颗粒摄取速率的方法。

天然脂蛋白颗粒中microRNA的富集及其绝对/相对microRNA含量与细胞间转移速率的测定

脂蛋白颗粒主要是血液中脂质和胆固醇的转运载体。此外，它们还含有少量的……

脂蛋白颗粒是天然的运输载体。通过富集外源性物质可使其作为示踪物载体加以利用。对分子或完整颗粒进行特异性标记，可实现细胞摄取的定量检测。这两种富集方法操作快速简便，可适用于多种物质。本次实验操作由本实验室的两位博士后 Markus Axmann 和 Andreas Karner 演示。在通风橱中开始去脂步骤时，取一到两毫升含有五毫克高密度脂蛋白（HDL）颗粒的已制备HDL溶液，与50毫升预冷的三份乙醇与两份乙醚的混合液在锥形离心管中混合。在负20摄氏度下孵育两小时。在负10摄氏度下以2500 × g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于50毫升预冷的乙醇-乙醚混合液中，并短暂涡旋振荡。在负20摄氏度下再次孵育两小时。在负10摄氏度下以2500 ×g 离心10分钟。然后插入通入氮气的管路以干燥沉淀。然后将样品重悬于250微升缓冲液A中。使用Bradford蛋白测定法或其他合适的方法测定蛋白浓度。必须彻底去除乙醇-乙醚混合液的任何残留，因为这些溶剂会抑制载脂蛋白的再脂化。接着，用缓冲液A稀释至终浓度为每250微升含1毫克蛋白。将通入惰性气体的管路插入管中的溶液部分。如有需要，将溶液在惰性气体环境中于四摄氏度下保存过夜。开始重悬前，在洁净的玻璃管中加入100 µL CO、13.5 µL C和500 µL PC。一边旋转玻璃管，一边向管内通入氮气以干燥混合物，从而形成均匀的表面层。在0.5 mL反应管中，用缓冲液A配制新鲜的30 mM亚精胺溶液。然后在2 mL反应管中，将100 µL 10 µM合成microRNA与100 µL亚精胺溶液混合。在30摄氏度下孵育30分钟。接下来，将孵育后的200微升溶液转移至玻璃管中，以重悬已制备的PC-CO-C主混合物表面层。然后加入50微升浓度为30毫克/毫升的脱氧胆酸钠溶液。在 4 摄氏度下搅拌 2 小时。之后，向玻璃试管中加入 250 µL 脱脂 HDL 溶液，并在 4 摄氏度下搅拌过夜。开始透析时，首先将50克吸附珠加入800毫升双蒸水中，使用磁力搅拌器搅拌一分钟。静置15分钟使珠子沉降，然后倾去上清液。用预冷的 PBS 重复该步骤。用 PBS 预先润湿透析盒。根据制造商的说明，使用注射器将先前制备的混合物加入透析盒中。将经 PBS 处理的吸附珠加入三升 PBS 中，并将透析盒放入 PBS 中，在 4°C 下进行透析。吸附珠可维持透析膜两侧的密度梯度恒定。分别在 1 小时和 2 小时后更换缓冲液和吸附珠。24小时后，用注射器将溶液从胶盒中转移至1.5毫升反应管中，以回收重组高密度脂蛋白（HDL）颗粒溶液。采用Bradford法测定蛋白浓度。向反应管中通入惰性气体，密封后，在4°C的惰性气体环境中保存重组HDL颗粒溶液。首先，在无RNA酶的水中配制新鲜的30毫摩尔的亚精胺溶液。在2毫升反应管中，将100微升10微摩尔的合成microRNA与100微升亚精胺溶液混合，并在30摄氏度下孵育30分钟。然后向制备好的 microRNA 精胺溶液中加入 100 µL DMSO 和 1.2 mL 1X LDL 缓冲液。用 PBS 将预先制备的 LDL 颗粒溶液稀释至终浓度约为 4 mg/mL。然后取 450 µL 稀释后的溶液加入 1.5 mL 反应管中，并与 50 µL 10X LDL 缓冲液混合。在冰上孵育10分钟。孵育结束后，将500微升低密度脂蛋白（LDL）颗粒溶液与1.5毫升微小RNA-精胺-DMSO溶液混合，并在40摄氏度下孵育2小时。随后进行透析，方法同前文所述，将标记的低密度脂蛋白颗粒溶液在惰性气体环境中于4摄氏度保存。首先，用 PBS 将高密度脂蛋白（HDL）或低密度脂蛋白（LDL）颗粒溶液稀释 100 至 1,000 倍。通过将粘性胶带按压在云母基底上，然后撕去胶带以去除上层云母层，从而劈开云母。使用移液器将两微升（2 µL）样品滴加到新劈开的云母表面，孵育五分钟。脂蛋白颗粒倾向于在表面形成连续的膜结构。因此，调整脂蛋白颗粒在云母表面的浓度以获得单个颗粒显得尤为重要。孵育后，用PBS缓冲液冲洗样品。用 PBS 填充高速原子力显微镜液体池，并将带有云母的扫描器安装到高速原子力显微镜载物台上。在控制软件中，启动悬臂对云母表面的接近过程。扫描范围应小于一平方微米，并尽可能保持成像力最低。采用轻敲模式对样品进行成像。将数据导入 Gwyddion 软件，通过“阈值标记颗粒”功能检测颗粒。调节高度阈值以实现对单个颗粒的掩膜。通常，约 50% 的水平是一个良好的起始点。去除多项式背景以展平图像，并启用排除被遮罩区域的选项。利用各种颗粒特征分布函数导出所检测颗粒的最大高度值，并对所有记录的图像重复这些步骤。本实验中，通过高密度脂蛋白（HDL）颗粒的去脂化，随后进行再脂化和透析，实现了HDL颗粒的重建。重建的HDL颗粒产率可达50%。然而，由于载脂蛋白B100蛋白具有疏水性，相同的microRNA标记方法无法用于低密度脂蛋白（LDL）颗粒的标记。因此，使用DMSO穿透LDL颗粒的脂质单层，产率接近100%。在质量控制过程中，稀释度对分析至关重要。上方图像显示颗粒密度过高，下方图像适合用于分析。为了比较天然、标记及标记对照脂蛋白颗粒的尺寸分布，计算了颗粒高度的概率密度函数。标记前后颗粒尺寸的相对变化可忽略不计。操作RNA寡核苷酸时，应保持无RNase环境。使用新鲜的一次性塑料耗材，并始终佩戴手套。仅使用无核酸酶溶液。高速原子力显微镜只是确定脂蛋白总体形状的一种方法。另一种方法是电子显微镜技术。在处理乙醚时，应穿戴适当的个人防护装备，并在通风橱中操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

微 Rna 对原生脂蛋白颗粒的富集及其与绝对相对微 Rna 含量及细胞转移速率的测定

microRNA 发挥重要的调控作用，并正成为多种人类疾病的新型治疗靶点。已有研究表明，miRNA 可由高密度脂蛋白（HDL）携带。我们开发了一种简化方法，可快速从人血浆中分离出适用于 miRNA 分析的高纯度...

一种快速简化的高通量分离高纯度高密度脂蛋白中miRNA的方法

本方案描述了高密度脂蛋白小RNA的分离与定量方法。...

高密度脂蛋白的分离用于非编码小RNA定量

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。...

脂滴分离用于定量质谱分析

本文描述了使用非离子型表面活性剂相分离方法富集细菌脂蛋白，可直接用于Toll样受体（TLR）检测或其他应用。此外，还详细介绍了制备N端胰蛋白酶消化脂肽的后续步骤，以通过质谱法进行结构表征。...

细菌脂蛋白的富集及N端脂肽的制备用于质谱法结构鉴定

本报告描述了一种利用定量实时逆转录PCR（可选是否进行预扩增）测定血浆miRNA绝对水平的实验方案。该方案有助于更准确地理解血浆miRNA的数量，并允许对来自不同研究或实验室的相应数据进行定性评估。...

使用定量实时逆转录PCR对中国猕猴血浆中微小RNA水平进行绝对定量

本报告描述了一种快速且可靠的细胞miRNA mRNA靶标验证方法。该方法利用合成的生物素标记的锁核酸（Locked Nucleic Acid,...

基于生物素的下拉实验验证细胞miRNA的mRNA靶标

本方案描述了脂质体的制备方法，以及如何将这些脂质体固定在表面，并通过荧光显微镜以大规模并行方式对单个脂质体进行成像。该方法可实现对群体中单个脂质体的尺寸和组成非均一性的定量分析。...

一种基于定量荧光显微镜的单个脂质体检测方法用于分析单个脂质体之间的组分不均一性

采用微流控混合平台方法开发用于mRNA和DNA包封的脂质纳米颗粒。...

利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

我们开发了一种可用于细胞的内含子微小RNA（microRNA）生成报告检测方法 体外 使用四种质粒：一种携带内含子miRNA，一种携带靶序列，一种用于过表达调控蛋白，一种用于Renilla荧光素酶。miRNA被加工处理后，可通过结合靶序列来调控荧光素酶的表达。...

一种用于分析哺乳动物细胞中内含子microRNA成熟的报告基因检测方法

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利用流式细胞术追踪miRNA向细胞外囊泡的释放

学习使用定量实时PCR技术测定脂蛋白颗粒中微RNA含量的方法，并了解如何通过去脂化与重组技术富集微RNA，以及评估细胞摄取速率。该方法适用于神经科学与分子生物学研究。

天然脂蛋白颗粒中microRNA的富集及其绝对/相对microRNA含量与细胞间转移速率的测定

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