荧光苏门答腊蛋白对 sumo 修饰蛋白的定位

该协议的意义是使用一种新型荧光SUMO捕获UTAG蛋白来检测各种真核细胞中的蛋白质修饰剂S SUMO。该技术的主要优点是在各种细胞（包括哺乳动物组织培养和线虫性腺）中无抗体检测 SUMO 的直接协议。SUMO在癌症和神经退行性疾病中扮演着重要角色，这突出了对SUMO改性蛋白质的检测和功能分析的可靠工具需求。

由于SUMO是高度保守的，荧光相扑捕获UTAG蛋白可用于标记在许多不同的生物体结合SUMO。此视频演示了它在哺乳动物细胞中的使用。此外，全文介绍了它在线虫卵母细胞中的用法。

该技术的视觉演示为染色和相扑检测前的细胞处理提供了关键提示。首先，在六孔 TC 板中生长 22 毫米圆形盖滑上选择的组织培养细胞，直到 70 至 80% 汇合。用一毫升的DPBS短暂清洗细胞。

要修复细胞，请在每个井中加入两毫升新鲜4%PFA和DPBS。在室温下孵育细胞20分钟。在一毫升 DPBS 中清洗固定细胞三次，5 分钟，同时使板螺母化。

为了渗透细胞，在DPBS中用1%的Triton X-100孵育15分钟。和以前一样，再次清洗细胞。用500微升1摩尔甘氨酸HCL pH 2孵育细胞10秒。

然后立即用 500 微升 10X SUMO 蛋白酶缓冲器或 SPB 中和 pH。洗完电池后，从井中取下盖滑，放在湿度室中。仅对于 UTAG-FL 染色，将一微克 UTAG-FL 与 100 微升 1X SPB 混合，在管中含有 5 毫摩尔 TCEP。

然后，将混合物移液到盖滑的细胞上，在室温下在湿度室中孵育一小时。要清洗盖滑，每个盖单上的移液器 200 微升 DPBS，并留在位 10 分钟。再重复洗涤两次。

从上次洗涤中拆下盖滑，然后用一滴安装介质倒置到预清洁的显微镜滑轨上。在显微镜下观察之前，将样品隔夜存放在20摄氏度的冰柜中。使用 DAPI 和德州红的适当筛选器集可视化单元格。

有关如何标记 SUMO 和固定线虫性腺的协议，请参阅全文。虽然标记哺乳动物细胞非常简单，但标记线虫卵母细胞需要事先接受性腺解剖培训。使用固定PMT2细胞孵育的KKUTAG-FL显示出明显的核染色。

扩散的核污渍和明显的核污都可见。使用与DAPI共同染色确认了核定位。与KmUTAG-FL的SUMO诱捕活动一致，核定位模式让人联想到S相扑23染色。

与抗S SUMO23 8A2抗体共同染色证实了KmUTAG-FL与SUMO23信号的共同定位。这验证了KmUTAG-FL在哺乳动物细胞中检测S SUMO23的功效。从卵母细胞产生成人草本分离的性腺 c.

埃利根线虫被贴上抗S相扑抗体的标签。与之前的报告一致，抗SSUMO抗体最初被本地化为晚期美生前细胞的核质。然后，当核包络破裂，染色体向元相板移动时，它重新分配给配对同源的中央环复合体。

在平行的制剂中，标有KKUTAG-FL的性腺也揭示了类似的模式。当卵母细胞开始并完成核包络分解过程时，KmUTAG-FL从核质标记转向专注于环复合体。这些结果验证了KmUTAG-FL作为分析c中与虫病和相扑相关的过程的有用工具。

埃利根和可能的其他线虫。在执行固定时，使用新鲜的甲状甲醛和较短的固定时间保持 SUMO 原生折叠，以便 KmUTAG 能够识别 SUMO 至关重要。由于相扑的三级结构是高度保守的，因此很可能使用KmUTAG-FL试剂分析来自其他模型和非模型系统中的SUMO变体。

目前，我们使用这种新型荧光相扑诱捕UTAG蛋白来研究SUMO在细胞应激中的功能。最后，请注意，使用固定性前甲醛的所有步骤都应在实验室安全罩中执行，并且必须正确处理该试剂。