利用荧光Sumo捕获蛋白定位SUMO化修饰蛋白

本方案的意义在于使用一种新型的荧光SUMO捕获蛋白UTAG，用于在多种真核细胞中检测蛋白质修饰物SUMO。该技术的主要优势在于提供了一种无需抗体即可在多种细胞中检测SUMO的简便方案，包括哺乳动物组织培养细胞和线虫性腺。SUMO在癌症和神经退行性疾病中发挥着重要作用，因此迫切需要可靠且高效的工具来检测和功能分析SUMO修饰的蛋白质。

由于SUMO具有高度保守性，因此荧光标记的SUMO捕获蛋白UTAG可用于在多种不同生物体中标记共价连接的SUMO。本视频展示了其在哺乳动物细胞中的应用，此外，全文还描述了其在线虫卵母细胞中的使用。

该技术的可视化演示为染色前细胞处理及SUMO检测提供了关键提示。首先，在六孔组织培养板中，将所选的组织培养细胞接种于22毫米圆形盖玻片上，培养至细胞融合度达到70%至80%。随后用一毫升DPBS短暂洗涤细胞。

为了固定细胞，向每个孔中加入两毫升新鲜的4% PFA和DPBS。在室温下孵育细胞20分钟。在摇动培养板的条件下，用一毫升DPBS洗涤固定后的细胞，每次五分钟，共洗涤三次。

为了透化细胞，将细胞与含1% Triton X-100的DPBS孵育15分钟。再次按前述方法洗涤细胞。将细胞与500微升1摩尔的甘氨酸盐酸溶液（pH 2）孵育10秒。

然后立即加入500微升10X SUMO蛋白酶缓冲液（SPB）以中和pH值。按照之前的方法洗涤细胞后，将盖玻片从孔中取出，并置于湿盒中。仅针对UTAG-FL染色，取1微克UTAG-FL与含有5毫摩尔TCEP的100微升1X SPB缓冲液在离心管中混合。

然后，将混合液用移液器加到盖玻片上的细胞中，在湿盒中室温孵育1小时。洗涤盖玻片时，向每个盖玻片上加入200 µL的DPBS，静置10分钟。重复此洗涤步骤两次。

从最后一次洗涤液中取出盖玻片，将其倒置在预先清洁的显微镜载玻片上，滴加一滴封片介质。将样品在20摄氏度的冰箱中避光保存过夜，然后在显微镜下观察。使用适用于DAPI和Texas Red的相应滤光片组观察细胞。

有关对SUMO和固定线虫性腺进行标记的完整方案，请参见全文。虽然标记哺乳动物细胞相对简单，但标记线虫卵母细胞需要事先接受性腺解剖方面的培训。将KmUTAG-FL与固定的PMT2细胞共同孵育后，显示出明显的细胞核染色。

可见弥散性核染色以及明显的核内焦点。通过与DAPI共染色确认了核定位。与KmUTAG-FL的SUMO捕获活性一致，其核定位模式与SUMO23染色相似。

使用抗SUMO23 8A2抗体进行共染色，证实了KmUTAG-FL与SUMO23信号的共定位。这验证了KmUTAG-FL在哺乳动物细胞中检测SUMO23的有效性。从产生卵母细胞的成年雌雄同体c.

秀丽隐杆线虫的线虫卵母细胞用抗SUMO抗体进行标记。与先前的报道一致，抗SUMO抗体最初定位于减数分裂晚期前期卵母细胞的核质中。随后，随着核膜破裂以及染色体向中期板聚集，抗SUMO抗体重新分布至成对同源染色体的中央环状复合体上。

在平行制备实验中，用 KmUTAG-FL 标记的性腺显示出相似的模式。随着卵母细胞开始并完成核膜破裂过程，KmUTAG-FL 的标记信号从核质逐渐集中到环状复合体上。这些结果验证了 KmUTAG-FL 是研究 c 中减数分裂及 SUMO 相关过程的有效工具。

秀丽隐杆线虫及其他可能的线虫。在进行固定时，关键是要使用新鲜的多聚甲醛，并控制较短的固定时间，以保持SUMO的天然折叠构象，从而使其能够被KmUTAG识别。由于SUMO的三级结构高度保守，因此极有可能利用KmUTAG-FL试剂对更多模式及非模式生物系统中的SUMO变体进行分析。

目前，我们正在利用这种新型的荧光SUMO捕获UTAG蛋白来研究细胞应激过程中SUMO的功能。最后，请注意，所有使用固定剂多聚甲醛的步骤都必须在实验室安全通风橱中进行，且该试剂必须妥善处理。