评估小鼠后肢缺血模型中的治疗性血管生成

本实验的总体目标是通过建立后肢缺血模型，为全面评估潜在促血管生成因子在功能、组织学及分子水平上的作用提供实验基础。该方案为在小型动物模型中测试可能的促血管生成疗法建立了标准，具有未来在临床环境中应用的潜力。由于20%至30%的严重缺血患者不适合进行血管重建治疗，因此，治疗性血管生成已成为改善缺血部位血液灌注的一种新策略。

该实验方案可全面理解血管生成疗法在各项结果中发挥其效应的机制，并评估其疗效。在确认一只22周龄C57黑六雌性小鼠对脚趾挤压无反应后，剃除其右侧后肢的毛发，并将动物固定于加热垫上，呈仰卧位。将动物置于解剖显微镜下。

使用11号外科手术刀片，在右后肢大腿处做一厘米长的皮肤切口。钝性分离皮下脂肪，暴露神经血管束。使用尖头镊子、弹簧剪和眼科持针器打开膜性髂股鞘，暴露远端髂外动脉和股血管。

分离动脉和静脉与神经后，使用七根0号不可吸收聚丙烯缝线结扎远端股动脉和静脉以及远端髂外动脉和静脉。明确识别远端髂外动脉，并对远端髂外动脉、静脉及股动脉、静脉进行结扎和切除，是手术成功的关键步骤。使用弹簧剪在远端与近端结扎线之间的位置横断髂股动脉和静脉的节段。

使用可吸收缝线缝合切口。然后，向动物腹腔内注射镇静拮抗剂溶液，并将小鼠放回其饲养笼中，密切监测直至完全恢复。为采集腓肠肌，需剥离双侧后肢的皮肤。

用棉签将皮肤与肌肉分离。捏住跟腱，使用弹簧剪从胫骨和腓骨上分离肌肉，直至膝关节。并将股二头肌与腓肠肌分离。

使用弹簧剪在膝关节水平处切断腓肠肌的附着点。然后用10%明胶将获取的肌肉以横向排列固定在小软木片上。随后，将标本置于液氮冷却的异戊烷中速冻，保存于零下80摄氏度。

进行毛细管显微切割激光捕获时，先获取肌肉标本的12微米切片，然后将组织置于50毫升预冷的纯丙酮中，在零下20摄氏度固定5分钟。空气干燥后，用疏水笔圈出每个标本。随后在4摄氏度条件下，使用含2摩尔氯化钠的PBS溶液对样本进行再水化。

复水结束后，在4°C条件下用相应的一抗对样本过夜孵育标记。随后用新鲜的2摩尔氯化钠PBS溶液进行两次洗涤，每次三分钟。第二次洗涤后，在4°C条件下用合适的二抗孵育30分钟，然后按照前述方法用PBS中的氯化钠溶液再进行两次洗涤。

接着，在4°C条件下，用链霉亲和素偶联的过氧化物酶复合物标记样品30分钟。随后进行洗涤，并用DAB过氧化物酶底物标记5分钟。孵育结束后，将组织依次浸入冰冻的90%乙醇和100%乙醇中进行脱水处理。

然后，使用较新型的显微切割系统，该系统配备脉冲式固态355纳米激光器，用于分离每只小鼠的10,000根毛细血管，并将分离的毛细血管弹射至微量离心管粘性管盖中。如图所示，在诱导后肢缺血后，立即观察到后肢灌注完全丧失。血流的定量评估以缺血侧肢体（ISC）与非缺血侧肢体（NISC）血流比值表示，结果显示，在后肢缺血（HLI）后第15天和第45天，接受促血管生成刺激的小鼠其肢体血流灌注显著增强。

对腓肠肌组织切片的组织学切片中 CD31 阳性毛细血管的定量显示，缺血肢体的毛细血管密度高于非缺血肢体。正如预期的那样，但经促血管生成剂治疗后，这一效应进一步增强。

缺血肢体的侧支血管密度也持续增加，且在暴露于促血管生成刺激后，这种增加更为显著。对CD31阳性内皮细胞中促血管生成基因表达进行的逆转录聚合酶链式反应分析显示，接受或未接受促血管生成剂处理的小鼠之间，基因表达存在明显差异。在分离血管时，为避免动脉和静脉撕裂，必须使用钝头眼科针头来打开膜性髂股鞘。

通过基于激光多普勒的灌注测量可轻松评估后肢缺血时血管的反应，而毛细血管密度的组织学定量则使我们能够评估血管生成情况。