测定小鼠肝脏中胆管密度

本方案使研究者能够定量分析肝病小鼠模型中胆管的发育情况，还可用于评估遗传修饰因素对胆管发育的影响。该技术的优势在于，它是一种简单、灵敏且定量的方法，可直接评估胆管发育。

首先，用镊子拉紧安乐死小鼠的皮肤，使用小剪刀在肋骨下方约一英寸处做一横向切口。暴露肝脏的整个腹侧面。使用小剪刀小心剪断连接肝脏与腹腔内其他器官的韧带。

然后，切断胆总管以将肝脏与肠道分离。抓住胆囊，小心地取出肝脏。立即将其放入一个50毫升的离心管中，管内装有三分之四体积的4%多聚甲醛。

为了固定肝组织，将组织在4%多聚甲醛中于4摄氏度孵育48小时。经过一系列乙醇洗涤后，在室温下用透明剂洗涤肝组织，每次30分钟，共洗涤三次。开始包埋时，将组织包埋盒在组织模具中用预热至60摄氏度的石蜡洗涤三次，每次30分钟。

然后，将石蜡倒入组织包埋模具中，至模具高度的四分之三处，并将其置于60摄氏度的加热板上。将肝脏放入模具中，腹面朝上。小心地将模具从加热板上取下后，将包埋盒的盖子盖在模具上。

用热的液体石蜡覆盖至满，静置过夜使其冷却至室温。将肝组织块从模具中取出后，使用切片机从肝脏背侧表面开始切片，切片厚度为五微米。在解剖显微镜下检查表层切片，确保切片无撕裂或折叠。

进行免疫组织化学切片处理时，为每种基因型选择一张待分析的切片，依次在二甲苯、100%乙醇、95%乙醇和70%乙醇中各洗涤15分钟。切片经去离子水洗涤后，浸入基于Tris的高pH值抗原修复液中，随后在压力锅中于10 psi压力下加热3分钟。

将切片冷却至室温后，使用PAP笔在切片上标记出组织区域。用PBS Tween洗涤后，每张切片加入100 µL封闭液，覆盖后在4°C下孵育1小时以封闭组织切片。每张切片加入100 µL含三种一抗的稀释抗体溶液，在4°C下孵育过夜。

洗涤玻片后，加入100微升含有两种二抗的二抗溶液，在室温下孵育一小时。最后，向玻片上加封片剂并加盖盖玻片。使用荧光显微镜对每个切片在1倍缩放倍数下拍摄20倍物镜的图像。

确保对肝脏内每一条门静脉进行成像。创建一个包含以下列的电子表格：动物/样本编号、图像编号、门静脉数量和胆管数量。针对每幅图像，识别并记录其中的门静脉数量。

然后，通过可见的胆管上皮细胞围绕一个明确管腔的特征，在每张图像中识别出开放的胆管。这些结构应清晰可辨，并由间充质与其他广谱细胞角蛋白阳性的细胞分隔开。该技术的主要挑战之一在于准确识别开放的胆管。

确定何为开放的胆管，需要分析胆管的形态及其管腔周围细胞的特征。对每个开放的胆管进行计数，并将其数量记录在与图像编号对应的同一列中，对每张门静脉图像重复此操作。最后，计算肝样本中所有门静脉和所有胆管的总数，并计算该肝样本的胆管与门静脉之比。

对30天龄小鼠肝脏进行切片，并使用CK8和CK19以及血管标志物alpha-SMA进行共染色，以确定胆管（BD）与门静脉（PV）的比例。当每叶肝脏中的所有门静脉均被成像后，门静脉被定义为具有相邻广谱细胞角蛋白染色的alpha-SMA阳性血管。无广谱细胞角蛋白染色的alpha-SMA阳性结构为中心静脉，不在分析范围内。

开放性导管具有明确可辨的管腔，其周围环绕着广谱细胞角蛋白阳性的胆管上皮细胞，且通常由间充质组织与邻近的导管或胆管上皮细胞分隔开。那些无明确管腔的广谱细胞角蛋白阳性细胞，不计入胆管总数。野生型动物的肝组织切片显示门静脉伴随一条完全开放的导管，以及多个未整合的细胞。

来自JAG1杂合型动物的代表性肝脏切片显示，在三条门静脉周围均无开放的胆管。此处所有广谱细胞角蛋白阳性的细胞均为未整合状态，因此不应计入。对三只野生型和三只JAG1杂合型动物的胆管与门静脉比例进行分析，结果表明可根据胆管数量明确区分两种基因型。

必须评估所有门脉血管中的胆管。如果肝脏内表型存在变异性，则此步骤对于确定胆管密度尤为重要。该技术已被用于在Helgason小鼠模型中鉴定胆道表型的遗传抑制因子。

因此，它可能在评估胆道疾病动物模型的治疗方式方面具有应用价值。