Name: 确定小鼠肝脏中的胆汁密度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 了解小鼠肝脏疾病模型中胆管密度的定量评估方法。该技术通过免疫组织化学染色和显微镜成像，精确计算胆管与门静脉比例，为研究遗传修饰因子对胆管发育的影响以及评估胆道疾病治疗策略提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）（R01 GM084135 和 R01 DK109982）、德克萨斯医学中心消化疾病中心在 NIH P30 DK56338 项目下提供的试点/可行性奖励，以及来自医学基金会的阿拉吉尔综合征加速奖。

所有动物均按照机构动物护理和使用委员会指南及经批准的动物实验方案，饲养于贝勒医学院的屏障级动物设施中。
1. 小鼠肝脏组织的采集
<ol>
	<li>小鼠肝脏采集前的准备
	<ol>
		<li>使用异氟烷对小鼠实施安乐死。</li>
		<li>进行颈椎脱位以确认小鼠死亡。</li>
		<li>在肋骨下方约一英寸处做横向切口。</li>
		<li>充分暴露肝脏的整个腹侧表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠肝脏的采集
	<ol>
		<li>使用小剪刀小心剪断肝脏与腹腔内其他器官相连的韧带。</li>
		<li>剪断共同胆管（common BD），使肝脏与肠道分离。</li>
		<li>握住胆囊小心取出肝脏，并立即放入装有四分之三体积4%多聚甲醛（PFA）的50 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肝脏的固定及石蜡包埋
<ol>
	<li>固定
	<ol>
		<li>将肝组织在4% PFA中于4 °C固定48小时。</li>
		<li>用70% EtOH在4 °C洗涤组织1小时。</li>
		<li>用95% EtOH在4 °C各洗涤两次，每次1小时。</li>
		<li>用100% EtOH在4 °C各洗涤两次，每次1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透明
	<ol>
		<li>用透明剂（材料表）在室温下洗涤肝组织三次，每次30分钟。 
		注意：第三次洗涤后，肝脏应感觉坚硬。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>石蜡包埋
	<ol>
		<li>将组织包埋盒置于石蜡包埋模具中，进行三次洗涤，每次30分钟。石蜡应预热至60 °C。</li>
		<li>向组织模具中加入石蜡至四分之三高度，并置于60 °C加热板上。</li>
		<li>将肝脏置于模具中，腹面朝上。</li>
		<li>小心将模具从加热板上取下。</li>
		<li>将包埋盒盖放在模具上，并用热的液态石蜡加满。</li>
		<li>让模具和组织块在室温下过夜冷却。 
		注意：组织块现在可在室温下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肝组织切片
<ol>
	<li>切片前组织块的准备
	<ol>
		<li>在取出组织块之前，将模具置于冰上5分钟。</li>
		<li>将组织块放置在冰上，组织块与冰之间垫一张实验室用纸巾。</li>
		<li>在不进行切片时，应将组织块保持在冰上，以获得最佳的组织切片效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝脏组织块的切片
	<ol>
		<li>使用切片机，从肝脏的浅层背侧开始切片，切片厚度应为5 µm。</li>
		<li>在解剖显微镜下检查浅层切片，确保切片无撕裂或折叠现象。</li>
		<li>取包含尾状叶的肝脏切片。 
		注意： 对于某些组织块，左叶、中叶、右叶和尾状叶可能位于同一组织切片上。</li>
		<li>对于无法在同一张切片上同时显示四个叶的组织块，应继续切片，直至左叶、中叶和右叶同时出现在同一张切片上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. wsCK 和 αSMA 的免疫组织化学染色
<ol>
	<li>免疫组织化学切片处理
	<ol>
		<li>为每种基因型选择一张待分析的切片。</li>
		<li>将切片依次在二甲苯、100% 乙醇、95% 乙醇和70% 乙醇中各洗涤一次，每次15分钟（每种溶液中浸泡3次，每次5分钟）。</li>
		<li>在去离子水（H2O）中洗涤切片5分钟。</li>
		<li>将切片浸入抗原修复液（Tris缓冲液，高pH值）中。</li>
		<li>在压力锅中加压加热3分钟，压力为10 psi。</li>
		<li>让切片自然冷却至室温（约35分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织切片封闭
	<ol>
		<li>使用Pap Pen在切片上标记出组织区域的轮廓。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）+ 0.1% Tween覆盖切片，洗涤两次，每次5分钟。</li>
		<li>配制封闭缓冲液：将正常山羊血清（NGS）以1:50比例加入PBS + 0.3% Triton中。为确保封闭和一抗孵育均有足够缓冲液，每张切片准备100 µL即可。</li>
		<li>每张切片上加100 µL封闭液。</li>
		<li>将加有封闭液的切片在4 °C下孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wsCK 和 αSMA 染色
	<ol>
		<li>使用封闭缓冲液将抗CK8和抗CK19抗体16（Developmental Studies Hybridoma Bank，分别为TROMA-I和TROMA-III）按1:20稀释，用于wsCK染色；在同一缓冲液中将抗αSMA抗体17（材料表）稀释至1:200。</li>
		<li>每张切片上加100 µL含上述三种抗体的稀释液。</li>
		<li>将加有抗体溶液的切片在4 °C下孵育过夜。</li>
		<li>用PBS + 0.1% Triton洗涤切片三次，每次5分钟。</li>
		<li>将二抗（抗大鼠-Alexa488和抗小鼠-Cy5）以1:200比例溶于PBS + 0.3% Triton中进行稀释。</li>
		<li>每张切片上加100 µL含两种二抗的稀释液。</li>
		<li>在室温下孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DAPI 核染色与封片
	<ol>
		<li>用PBS洗涤切片三次，每次5分钟。</li>
		<li>每张切片加100 µL DAPI（1:3000），染色10分钟。</li>
		<li>向切片上加抗荧光淬灭封片剂（材料表），并在组织区域上加盖玻璃盖玻片。将切片置于4 °C过夜，次日进行封固。</li>
		<li>将切片存放在4 °C，封片后一周内完成成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. BDs 的成像与定量分析
<ol>
	<li>肝脏切片成像
	<ol>
		<li>成像前，在实验室成员的协助下对样本的基因型进行盲化处理。确保所有成像文件中均不包含基因型或其他特定识别信息，仅保留动物/样本编号。</li>
		<li>使用荧光显微镜以20倍物镜、1倍缩放拍摄每个切片的图像，并确保每个PV&#160;对肝脏进行成像，包括左叶、方叶、右叶和尾状叶。 
		注意： 每只动物通常可发现60至90个门管区，具体数量取决于肝脏大小。</li>
		<li>为了鉴定门静脉支，需观察αSMA与wsCK的共染色情况。仅呈αSMA阳性而无wsCK染色的结构不属于门管区结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BDs的鉴定与计数
	<ol>
		<li>创建一个包含以下列的电子表格：动物/样本编号、图像编号、PV数量和BD数量。</li>
		<li>逐张检查图像，识别并记录每张图像中PV的数量。</li>
		<li>通过观察每个图像中是否存在围绕明确管腔的胆管上皮细胞（wsCK+）来识别专利性胆管结构（BDs）。这些结构应清晰可辨，并由间质组织与其他wsCK+细胞分隔开。</li>
		<li>统计每个有专利的BD，并将其填入与图像编号相同的列中。</li>
		<li>对每张拍摄的PV图像都进行此操作。</li>
		<li>计算肝样本中所有PV和BD的总和。</li>
		<li>计算肝组织样本的BD与PV比值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+liver+development+by+regulating+biliary+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation.</a> Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).</li>
<li>Clotman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+liver+cell+fate+decision+by+a+gradient+of+TGF%CE%B2+signaling+modulated+by+Onecut+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors.</a> Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).</li>
<li>Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+etiologies+and+management+of+neonatal+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis.</a> Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).</li>
<li>Roskams, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+the+finer+branches+of+the+biliary+tree%3A+canals%2C+ductules%2C+and+ductular+reactions+in+human+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.</a> Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).</li>
<li>Oda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+human+Jagged1+gene+are+responsible+for+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome.</a> Nature Genetics. 16 (3), 235(1997).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alagille+syndrome+is+caused+by+mutations+in+human+Jagged1%2C+which+encodes+a+ligand+for+Notch1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1.</a> Nature Genetics. 16 (3), 243(1997).</li>
<li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+Notch+ligand+Jagged1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li>
<li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+%28Rumi%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).</li>
<li>Hadchouel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paucity+of+interlobular+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Paucity of interlobular bile ducts.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).</li>
<li>Emerick, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Alagille+syndrome+in+92+patients%3A+frequency+and+relation+to+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis.</a> Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).</li>
<li>Poncy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+SOX4+and+SOX9+cooperatively+control+development+of+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts.</a> Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).</li>
<li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged1+in+the+portal+vein+mesenchyme+regulates+intrahepatic+bile+duct+development%3A+insights+into+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome.</a> Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).</li>
<li>McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+Alagille+syndrome%3A+Notch2+as+a+genetic+modifier+of+Jag1+haploinsufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency.</a> Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).</li>
<li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Model+of+Alagille+Syndrome+and+Mechanisms+of+Jagged1+Missense+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations.</a> Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).</li>
<li>Loomes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+duct+proliferation+in+liver-specific+Jag1+conditional+knockout+mice%3A+effects+of+gene+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage.</a> Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).</li>
<li>Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+trophectoderm-specific+markers+during+mouse+blastocyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).</li>
<li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+against+alpha-smooth+muscle+actin%3A+a+new+probe+for+smooth+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation.</a> J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).</li>
<li>Kamath, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+to+identify+laboratory+predictors+of+liver+disease+outcome+in+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526(2010).</li>
<li>Mouzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+life+predictive+markers+of+liver+disease+outcome+in+an+International%2C+Multicentre+Cohort+of+children+with+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome.</a> Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).</li>
<li>Shiojiri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+differentiation+of+bile+ducts+in+the+mammalian+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver.</a> Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).</li>
<li>Crawford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+intrahepatic+biliary+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">Development of the intrahepatic biliary tree.</a> Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).</li>
<li>Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+remodeling+of+the+biliary+architecture+underlies+liver+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis.</a> Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).</li>
<li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGFbeta-mediated+hepatocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li>
<li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).</li>
<li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. (68), e4272(2012).</li>
<li>Popper, H., Kent, G., Stein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductular+cell+reaction+in+the+liver+in+hepatic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mt+Sinai+Hosp+N+Y%22%5BJournal%5D)">Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury.</a> J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).</li>
<li>Yimlamai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+activity+influences+liver+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway activity influences liver cell fate.</a> Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

分析小鼠胆管（BD）的发育与修复是研究胆汁淤积性疾病发病机制和病理机制的重要工具。此外，新疗法的开发在一定程度上依赖于建立可重复且尽可能可量化的表型。目前在小鼠模型中的表型分析通常包括血清生化检测、肝脏组织学检查以及细胞类型特异性标志物的免疫染色。尽管这些技术能够提供有关胆道系统结构与功能的宝贵信息，但它们无法直接衡量特定基因操作对胆管数量的影响。在解剖病理学中，人类患者的胆管稀少症是通过活检切片中胆管与门静脉（PV）比例的分析来确定的9。虽然临床医生常采用血清生化分析来评估Alagille综合征（ALGS）及其他胆汁淤积性疾病中胆汁淤积和肝病的严重程度18,19，但在小鼠模型中进行组织学评估对于理解疾病修饰因子对胆管发育的影响以及评估治疗手段恢复正常胆管发育的效果至关重要。部分原因在于，小鼠即使出现开放性胆管数量严重减少，其血清胆红素水平也可能仅呈现轻度升高8，这可能是由于小鼠肝脏具有高效的胆汁引流能力所致。我们先前的研究表...

胆道系统是哺乳动物肝脏的重要组成部分，负责将胆汁从肝细胞输送至肠道。肝内胆管（BDs）由胆管细胞构成，这些胆管细胞通过Notch和TGFβ信号通路从双潜能的肝母细胞分化而来1,2。胆管细胞的正确特化、命运决定及其组装形成成熟的胆管结构，对于肝内胆道系统的发育至关重要。在肝脏发育或器官再生过程中，随着肝脏的生长，胆道系统也必须相应发育，以确保胆汁的正常引流。此外，多种综合征性和非综合征性疾病会导致肝内胆管数量减少3。同时，许多急性和慢性肝病可引发所谓的胆管样反应（ductular reactions），其特征是肝脏中出现大量表达胆管标志物的细胞，但这些细胞并不一定来源于胆管细胞，也不一定形成通畅的胆管结构4。在多系统受累的Alagille综合征（ALGS）中，Notch配体Jagged1（JAG1）基因的单倍剂量不足会导致胆管发育不良和胆汁淤积5,6。我们实验室近期证实，先前构建的Jag1杂合小鼠品系7可作为ALGS中胆管稀少的动物模型8。在该ALGS小鼠模型中，胆管细胞仍然存在，但无法正常定植并整合为成熟、通畅的胆管结构8。因此，在胆管稀少模型中对肝脏进行分析时，仅观察胆管细胞的表观存在与否是不够的，准确评估肝脏中成熟胆管的存在程度尤为重要。
在解剖病理学中，存在公认的定量方法用于评估是否存在胆管稀少（BD paucity）9。例如，针对人类患者中阿拉杰里综合征（ALGS）的研究通常通过分析每例肝活检样本中至少10个门静脉结构来量化胆管（BD）与门静脉（PV）的比值9,10。结合血清生化指标，对开放性胆管的形态及其整体存在与否进行分析，可为小鼠胆管发育情况提供有价值的信息11,12,13。然而，小鼠可能在血清胆红素水平仅有轻度升高时即丢失大量胆管8。因此，一种能够评估每根门静脉所对应的胆管数量的定量方法，可更直接地反映小鼠胆管稀少的程度。在最近的一项研究中，我们量化了所有肝叶中每根门静脉对应的胆管数量，并报道了Jag1+/–动物中胆管与门静脉的比值显著降低8。在分析过程中我们注意到，尽管炎症反应和胆管样反应的程度存在显著差异，但胆管与门静脉的比值变异较小8。此外，通过对胆管与门静脉比值的定量分析，我们得以证明：在Jag1+/–动物中敲除一个拷贝的糖基转移酶基因Poglut1可显著改善其胆管稀少表型8。在Jag1+/+遗传背景下，血管平滑肌细胞中条件性缺失Poglut1会导致胆管数量进行性增加，该变化在出生后第7天（P7）时较为轻微（20–30%），但在成年个体中变得显著8。同样，该技术使我们能够证明，即使在P7阶段，这些动物中胆管密度的增加也具有统计学意义。值得注意的是，该基因型在四月龄时胆管密度的增加也通过树脂铸型分析得到了验证8。这些观察结果以及其他报道中对不同ALGS小鼠模型胆管密度的测量结果14,15促使我们将该方法纳入整体策略，用于分析多种突变型和转基因小鼠中的胆道缺陷。
本文详细介绍了一种简单的方法，可用于评估肝病小鼠模型中胆管（BD）缺失的程度（图1）。该方法通过使用胆管细胞标志物——细胞角蛋白（CK）8 和 CK19（下文简称广谱CK，wsCK）进行共染色，以可视化小鼠肝脏中的胆管及未整合的胆管细胞。染色过程中同时加入抗α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体，用于标记血管。通过对涵盖所有肝叶的组织切片进行系统性分析，计算BD与门静脉（PV）的比例，从而确保每种基因型均分析足够数量的PV。由于本方法依赖于在二维图像中对BD和PV进行定量，因此不适用于研究特定突变对胆管树三维结构或细小胆管完整性的影响。尽管如此，该方法仍为研究人员提供了一种简便且客观的策略，用于评估小鼠胆管系统的发育情况。

<table><tbody><tr><td>异氟烷（Isoflurane）</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Bel-Art</td><td>16-800-552</td><td></td></tr><tr><td>10% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15712</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>ThermoScientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2401</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HistoChoice</td><td>VWR Life Sciences</td><td>H103-4L</td><td>透明剂</td></tr><tr><td>Omnisette 组织包埋盒</td><td>Fisher HealthCare</td><td>15-197-710E</td><td></td></tr><tr><td>Macrosette</td><td>Simport</td><td>M512</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>McCormick Scientific</td><td>39503002</td><td>石蜡</td></tr><tr><td>组织包埋模具</td><td>Fisher Scientific</td><td>62528-32</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Microm</td><td>HM 325</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>Tris 基抗原修复液</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>高压锅</td><td>Instant Pot</td><td>Lux Mini</td><td></td></tr><tr><td>小型 Pap Pen</td><td>Life Technologies</td><td>8877</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯 20 山梨醇单月桂酸酯（Tween-20）</td><td>J.T. Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>辛基苯基聚氧乙烯醚（Triton-X-100）</td><td>J.T. Baker</td><td>X198-07</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>抗-CK8 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>TROMA-I</td><td>抗体注册号 AB531826</td></tr><tr><td>抗-CK19 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>TROMA-III</td><td>抗体注册号 AB2133570</td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;SMA 抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547, 克隆号 1A4</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠-Alexa488 二抗</td><td>ThermoFisher</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠-Cy5 二抗</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>22 × 50 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 微型盖玻片</td><td>VWR Life Sciences</td><td>48393 059</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>Kimtech Science</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>抗荧光淬灭封片剂</td></tr></tbody></table>

测定小鼠肝脏中胆管密度

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

小鼠被广泛用作研究胆道疾病的模式生物。为了评估胆道系统的发育和功能，研究人员常采用多种技术，包括血清生化分析、组织学分析以及特定标志物的免疫染色。尽管这些技术能够提供有关胆道系统的重要信息，但它们通常无法全面呈现突变体或转基因小鼠整个肝脏中胆管（BD）发育缺陷的整体情况。部分原因在于，即使在胆道发育存在显著障碍的小鼠中，其肝脏仍具有较强的胆汁引流能力。本文介绍一种简便的方法，用于计算突变体或转基因小鼠肝脏各叶切片中每个门静脉（PV）所关联的平均胆管数量。该方法以标准化的方式对肝脏进行固定和切片，便于不同基因型和实验条件下样本之间的比较。通过细胞角蛋白染色后在光学显微镜下识别胆管上皮细胞来定位胆管，随后统计其数量，并除以肝组织切片中门静脉的总数。作为示例，我们展示了该方法如何清晰地区分野生型小鼠与Alagille综合征小鼠模型。本文所述方法不能替代用于可视化胆道树三维结构的技术，但它为定量评估小鼠胆管发育状况及胆管反应形成程度提供了一种简单而直接的手段。

我们先前已报道了Jag1+/–动物中存在胆道缺陷，这是一种ALGS的小鼠模型8。为了确定胆管（BD）与门静脉（PV）的比例，我们对P30小鼠肝脏进行切片，并使用CK8和CK19（wsCK）以及血管标志物αSMA进行共染色。随后，我们对每个肝叶中的所有门静脉进行了成像。如图2A所示，我们将门静脉定义为具有相邻wsCK染色的αSMA阳性血管结构（箭头所示）。仅有αSMA染色而无wsCK染色的结构为中心静脉，不应纳入分析（箭头所示）。
确定门静脉（PV）后，我们根据其特征性形态识别出开放的胆管（BD）。如图3所示，开放的胆管具有清晰可辨的管腔，周围被细胞角蛋白广谱抗体阳性（wsCK+）的胆管上皮细胞所包绕。这些胆管通常由间充质组织与邻近的胆管或胆管上皮细胞分隔开（箭头所示）。...

我们介绍一种相对简单且灵敏的方法，用于精确量化小鼠肝脏中的胆管密度。该方法有助于评估遗传和环境因素的影响，以及潜在疗法在胆道疾病小鼠模型中的有效性。

小鼠被广泛用作研究胆道疾病模型的模式生物。为评估胆道系统的发育与功能，已开发多种技术……

本方案使研究者能够定量分析肝病小鼠模型中胆管的发育情况，还可用于评估遗传修饰因素对胆管发育的影响。该技术的优势在于，它是一种简单、灵敏且定量的方法，可直接评估胆管发育。首先，用镊子拉紧安乐死小鼠的皮肤，使用小剪刀在肋骨下方约一英寸处做一横向切口。暴露肝脏的整个腹侧面。使用小剪刀小心剪断连接肝脏与腹腔内其他器官的韧带。然后，切断胆总管以将肝脏与肠道分离。抓住胆囊，小心地取出肝脏。立即将其放入一个50毫升的离心管中，管内装有三分之四体积的4%多聚甲醛。为了固定肝组织，将组织在4%多聚甲醛中于4摄氏度孵育48小时。经过一系列乙醇洗涤后，在室温下用透明剂洗涤肝组织，每次30分钟，共洗涤三次。开始包埋时，将组织包埋盒在组织模具中用预热至60摄氏度的石蜡洗涤三次，每次30分钟。然后，将石蜡倒入组织包埋模具中，至模具高度的四分之三处，并将其置于60摄氏度的加热板上。将肝脏放入模具中，腹面朝上。小心地将模具从加热板上取下后，将包埋盒的盖子盖在模具上。用热的液体石蜡覆盖至满，静置过夜使其冷却至室温。将肝组织块从模具中取出后，使用切片机从肝脏背侧表面开始切片，切片厚度为五微米。在解剖显微镜下检查表层切片，确保切片无撕裂或折叠。进行免疫组织化学切片处理时，为每种基因型选择一张待分析的切片，依次在二甲苯、100%乙醇、95%乙醇和70%乙醇中各洗涤15分钟。切片经去离子水洗涤后，浸入基于Tris的高pH值抗原修复液中，随后在压力锅中于10 psi压力下加热3分钟。将切片冷却至室温后，使用PAP笔在切片上标记出组织区域。用PBS Tween洗涤后，每张切片加入100 µL封闭液，覆盖后在4°C下孵育1小时以封闭组织切片。每张切片加入100 µL含三种一抗的稀释抗体溶液，在4°C下孵育过夜。洗涤玻片后，加入100微升含有两种二抗的二抗溶液，在室温下孵育一小时。最后，向玻片上加封片剂并加盖盖玻片。使用荧光显微镜对每个切片在1倍缩放倍数下拍摄20倍物镜的图像。确保对肝脏内每一条门静脉进行成像。创建一个包含以下列的电子表格：动物/样本编号、图像编号、门静脉数量和胆管数量。针对每幅图像，识别并记录其中的门静脉数量。然后，通过可见的胆管上皮细胞围绕一个明确管腔的特征，在每张图像中识别出开放的胆管。这些结构应清晰可辨，并由间充质与其他广谱细胞角蛋白阳性的细胞分隔开。该技术的主要挑战之一在于准确识别开放的胆管。确定何为开放的胆管，需要分析胆管的形态及其管腔周围细胞的特征。对每个开放的胆管进行计数，并将其数量记录在与图像编号对应的同一列中，对每张门静脉图像重复此操作。最后，计算肝样本中所有门静脉和所有胆管的总数，并计算该肝样本的胆管与门静脉之比。对30天龄小鼠肝脏进行切片，并使用CK8和CK19以及血管标志物alpha-SMA进行共染色，以确定胆管（BD）与门静脉（PV）的比例。当每叶肝脏中的所有门静脉均被成像后，门静脉被定义为具有相邻广谱细胞角蛋白染色的alpha-SMA阳性血管。无广谱细胞角蛋白染色的alpha-SMA阳性结构为中心静脉，不在分析范围内。开放性导管具有明确可辨的管腔，其周围环绕着广谱细胞角蛋白阳性的胆管上皮细胞，且通常由间充质组织与邻近的导管或胆管上皮细胞分隔开。那些无明确管腔的广谱细胞角蛋白阳性细胞，不计入胆管总数。野生型动物的肝组织切片显示门静脉伴随一条完全开放的导管，以及多个未整合的细胞。来自JAG1杂合型动物的代表性肝脏切片显示，在三条门静脉周围均无开放的胆管。此处所有广谱细胞角蛋白阳性的细胞均为未整合状态，因此不应计入。对三只野生型和三只JAG1杂合型动物的胆管与门静脉比例进行分析，结果表明可根据胆管数量明确区分两种基因型。必须评估所有门脉血管中的胆管。如果肝脏内表型存在变异性，则此步骤对于确定胆管密度尤为重要。该技术已被用于在Helgason小鼠模型中鉴定胆道表型的遗传抑制因子。因此，它可能在评估胆道疾病动物模型的治疗方式方面具有应用价值。

determining-bile-duct-density-in-the-mouse-liver

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

确定小鼠肝脏中的胆汁密度

本视频介绍了胆道系统树脂铸型的操作流程，以帮助理解胆道系统的三维结构。该技术可提供胆道系统内径大小及网络连接情况的信息，可用于肝脏再生分析。...

胆道系统树脂铸型：利用不透射线树脂注射分析小鼠模型胆道系统三维结构的技术

关键词：胆道系统，树脂铸型，三维结构，小鼠模型，不透射线树脂，放射成像

胆汁流的中断会导致严重的炎症性胆汁淤积性肝损伤，并伴随特征性的时间依赖性形态学改变序列。本文介绍了一种在小鼠中进行总胆管结扎的手术方案，可在21至28天后诱导出显著的纤维化反应。...

小鼠胆管结扎术：通过阻塞性胆汁淤积诱导炎症性肝损伤及纤维化

诊断胆汁酸吸收不良及测量胆汁酸转运的工具 体内...

使用多氟化胆汁酸及 在体 内 磁共振成像测量胆汁酸转运

本文介绍了部分胆管结扎术，作为一种用于啮齿类动物肝脏损伤与再生研究的外科模型。...

小鼠部分胆管结扎：一种局部梗阻性胆汁淤积的可控模型

本文详细描述了一种基于银纳米颗粒的方法，用于改善实验性胆道闭锁小鼠模型中的胆道闭锁综合征。充分掌握试剂制备过程及新生小鼠注射技术，将有助于研究人员熟悉在新生小鼠模型研究中所采用的这一方法。...

一种利用银纳米颗粒改善小鼠胆道闭锁综合征的方法

我们提出一种稳健、经济且灵活的方法，用于检测固定或冷冻保存的组织样本中肝细胞数量和细胞核倍性的变化，该方法无需流式细胞术。本方法可提供理想的全样本肝脏细胞学特征，适用于追踪肝损伤和肝脏疾病的进展过程。...

一种用于评估小鼠肝细胞核多倍性的高通量原位方法

双重树脂铸型微计算机断层扫描，即 DUCT，可实现对两种管状系统的同步可视化、数字化和分割，从而促进器官结构的三维分析。DUCT 结合了 离体 注射两种造影树脂，随后进行显微计算机断层扫描及断层数据的分割。...

DUCT：双重树脂铸型结合显微计算机断层扫描用于肝脏三维分析

为了观察小鼠新生仔鼠的胆管异常，需要保持胆管的完整性和高效的制备方法。因此，我们成功建立了一种新的方法，可在维持胆管完整性的前提下，分离出小鼠新生仔鼠的整个肝外胆管系统。...

九日龄小鼠幼崽的肝外胆管和胆囊解剖

我们建立了一种小鼠慢性肝纤维化模型，该模型为胆道闭锁（BA）相关的病毒诱导肝纤维化机制研究提供了合适的动物模型，同时也为未来BA的治疗提供了一个研究平台。...

用于胆道闭锁研究的慢性肝纤维化小鼠模型

本文介绍一种简单且经济的实验方案，利用Isolectin...

量化小鼠不同肺小叶中的肺微血管密度

了解小鼠肝脏疾病模型中胆管密度的定量评估方法。该技术通过免疫组织化学染色和显微镜成像，精确计算胆管与门静脉比例，为研究遗传修饰因子对胆管发育的影响以及评估胆道疾病治疗策略提供可靠工具。

测定小鼠肝脏中胆管密度

探索更多视频