Name: 向外观察:分离氰化物释放的碳水化合物聚合物和蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学习从蓝细菌中分离高纯度胞外碳水化合物聚合物和外蛋白质组的方法。这些方案可根据不同菌株和应用需求进行调整，适用于微生物学和生物技术研究。

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本工作由欧洲区域发展基金（FEDER）通过“2020竞争力与国际化运营计划”（COMPETE 2020-POCI）、葡萄牙2020计划，以及葡萄牙科学技术基金会/科学、技术和高等教育部（FCT）通过项目编号POCI-01-0145-FEDER-028779和资助号SFRH/BD/99715/2014（CF）提供资金支持。

1. 蓝细菌释放的碳水化合物聚合物的分离
<ol>
	<li>聚合物的分离与杂质去除
	<ol>
		<li>在标准条件下培养蓝藻菌株 [例如，30 °C，12 小时光照（50 μE m−2s−1）/12 小时黑暗，150 rpm 摇床培养]。使用标准方法测定生长情况 [例如，730 nm 处的光密度（OD730nm）、叶绿素 a、干重等]，然后根据苯酚-硫酸法16测定释放的多糖产量。</li>
		<li>将培养物转移至透析膜（截留分子量为 12–14 kDa）中，在持续搅拌下，用至少 10 倍体积的去离子水透析 24 小时。 
		注意：根据待透析培养物体积和培养基成分，可能需要更换透析用水。</li>
		<li>在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 15 分钟。将上清液转移至新离心管中，弃去沉淀（细胞）。</li>
		<li>再次在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 15 分钟，以去除细胞壁碎片或脂多糖（LPS）等污染物。</li>
		<li>将上清液转移至玻璃烧杯中，弃去沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚合物的沉淀
	<ol>
		<li>向上清液中加入 2 倍体积的 96% 乙醇。</li>
		<li>将悬浮液在 4 °C 下孵育，至少过夜。</li>
		<li>聚合物回收
		<ol>
			<li>对于沉淀量较少或不可见的情况：在 4 °C 下以 13,000 × g 离心 25 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 或 2 mL 灭菌去离子水中。将水相悬浮液转移至离心管中。 
			注意：弃去上清液时应小心操作，避免沉淀重新悬浮。</li>
			<li>对于可见或大量沉淀的聚合物：使用无菌金属镊子将沉淀聚合物转移至离心管中。挤压聚合物以去除多余乙醇。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可选步骤：根据所需聚合物纯化程度，在将聚合物重悬于去离子水后，可使用 96% 乙醇重复沉淀步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚合物的冷冻干燥
	<ol>
		<li>将含有沉淀聚合物的离心管置于 -80 °C 下，至少过夜。</li>
		<li>对聚合物进行冷冻干燥（冻干）至少 48 小时（在冻干前切勿让悬浮液解冻）。</li>
		<li>将干燥后的聚合物在室温（RT）下保存，直至后续使用。 
		注意：建议将聚合物保存在干燥器中，因其可能随时间推移吸收水分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蓝细菌胞外蛋白质组的分离
<ol>
	<li>培养基浓度
	<ol>
		<li>在标准条件下培养蓝细菌［例如，30 °C，12 h 光照（50 μE m⁻² s⁻¹）/12 h 黑暗光周期］−2s−1)/12 小时黑暗循环，150 rpm 转速下振荡培养]。采用标准方法监测蓝细菌生长情况（例如., 光密度730 nm叶绿素 a干重等.).</li>
		<li>将培养物在 4,000 x 克， 室温下孵育10分钟。</li>
		<li>将上清液转移至烧瓶中，弃去细胞沉淀。</li>
		<li>通过孔径为0.2 μm的滤器过滤上清液。 
		注意：如果将培养基保持在 4 °C，此处可暂停实验流程一段时间。</li>
		<li>使用截留分子量为3 kDa的离心浓缩器，将滤过培养基浓缩约500倍（基于滤过培养基的初始体积）。离心操作应在4,000 x g （每次离心时间最长1小时）在15 °C条件下离心。 
		注意：对于大多数浓缩器品牌，使用前需通过超纯水离心冲洗滤膜装置。一旦滤膜润湿后，切勿使其干燥。当装置不使用时，应保留足够液体于储液端。 
		注意：如果目的是研究蛋白质活性，将离心温度降低至 4 °C 可能更有利，但这会延长样品浓缩所需的时间。若培养基保持在 4 °C，可在离心步骤之间短暂暂停本实验方案。</li>
		<li>用浓缩后的样品冲洗滤器装置样品储液室的管壁，并将内容物转移至微量离心管中。</li>
		<li>使用经高压灭菌的培养基对滤膜装置的样品储液池进行额外的洗涤步骤，以确保最大限度回收外泌蛋白质组。 
		注意：为量化恢复百分比，请遵循特定制造商的说明。</li>
		<li>将外分泌蛋白质组样品于 -20 °C 保存，直至后续使用。 
		注意：建议添加蛋白酶抑制剂以用于长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外分泌蛋白质组分析
	<ol>
		<li>使用BCA蛋白检测试剂盒，按照生产商说明书在96孔板中定量蛋白质含量。</li>
		<li>采用标准染色方法（如考马斯亮蓝、银染），通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质。</li>
		<li>切下目标条带或凝胶区域，并将其收集到含有适量超纯水的不同微量离心管中。</li>
		<li>通过质谱法对蛋白质进行鉴定和分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides%3A+composition%2C+structures%2C+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li>
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<li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li>
<li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li>
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<li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li>
<li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了更好地理解细菌分泌机制并研究其释放的产物，高效分离和分析细菌胞外环境中存在的生物分子（如释放的碳水化合物聚合物和蛋白质）具有极其重要的意义。
蓝藻的胞外多糖极为复杂，主要原因是构成其结构的不同单糖的种类和比例各异1。目前用于分离这些聚合物的传统方法基于一个简单的原理：这些富含糖类的物质可溶于水溶液，并可通过加入有机溶剂（如丙酮或乙醇）使其沉淀9,17,18。该过程的发生是由于有机溶剂提取了聚合物水合层中的水分子，其效率本质上取决于聚合物的分子量（分子量较高的组分沉淀效率更高）、化学结构以及浓度9,18。除了沉淀步骤外，本文所述方法还包括透析和离心这两个关键步骤。透析可有效去除培养基中的盐类和其他化合物，这些杂质在冻干后可能形成粉末...

蓝细菌被广泛认为是具有潜在生物技术/生物医学应用价值的天然产物的重要来源。因此，了解蓝细菌的分泌机制并优化其提取/回收方法，对于将蓝细菌应用于高效的微生物细胞工厂至关重要。
许多蓝藻菌株能够产生胞外聚合物（EPS），其主要成分为杂多糖，可附着在细胞表面或释放到培养基中。1这些释放的碳水化合物聚合物与其他细菌产生的聚合物具有明显差异，因此适用于多种应用（如抗病毒剂）2，免疫刺激性3抗氧化剂4金属螯合5，乳化6和药物递送剂7,8）。这些聚合物的分离方法在很大程度上促进了&#160;不仅提高了产率，还增加了所得聚合物的纯度及其特定的物理性质9绝大多数用于分离这些聚合物的方法依赖于从培养基中沉淀析出的策略，由于该聚合物具有强阴离子特性，此类沉淀操作易于实现。9,10此外，沉淀步骤中使用的溶剂可通过蒸发和/或冷冻干燥迅速去除。根据预期应用，可在聚合物沉淀之前或之后连接不同的步骤，以定制最终产物，这些步骤包括三氯乙酸（TCA）处理、过滤或尺寸排阻色谱（SEC）柱纯化。10.
蓝细菌还能够通过依赖膜转运蛋白的途径（经典途径）11 或由囊泡介导的途径（非经典途径）12 分泌多种蛋白质。因此，蓝细菌胞外蛋白质组的分析是一项重要工具，既可用于理解与调控蓝细菌的蛋白质分泌机制，也可用于研究这些蛋白质特定的胞外功能。由于分泌蛋白的丰度相对较低，可靠的胞外蛋白质组分离与分析需要对胞外环境进行浓缩。此外，其他物理或化学步骤（如离心、过滤或蛋白质沉淀）可能优化所获得胞外蛋白质组的质量，富集蛋白质含量13，并避免污染物（如色素、碳水化合物等.）14,15 或胞内蛋白质在样品中占主导。然而，其中某些步骤也可能限制可检测蛋白质的范围，导致分析出现偏差。
本研究描述了从蓝细菌培养基中高效分离释放的碳水化合物聚合物和胞外蛋白质组的实验方案。这些方案可根据研究的具体目标和用户需求进行简便调整，同时保留本文所述的基本步骤。

<table><tbody><tr><td>透析膜</td><td>Medicell Membranes Ltd&amp;nbsp;</td><td>DTV.12000.07</td><td>Visking Tubing Size 7，直径 23.8 mm，宽度 39–41 mm，30 m 卷装&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>96% 乙醇</td><td>AGA - &amp;Aacute;lcool e G&amp;eacute;neros Alimentares, S.A.</td><td>4.000.02.02.00</td><td>AGA 发酵乙醇 96%</td></tr><tr><td>PES 滤膜 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific, Lda</td><td>15206869</td><td>聚苯乙烯注射器滤器，33 mm，0.2 &amp;micro;m，直孔&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15，Ultracel-3K</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>UFC900324</td><td>截留分子量为 3 kDa 的离心过滤器</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Fisher Scientific, Lda</td><td>10741395</td><td>由绿变蓝、精确、兼容去垢剂的总蛋白浓度测定试剂</td></tr><tr><td>胶体金 Brilliant Blue G 浓缩液&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Qu&amp;iacute;mica SL</td><td>B2025-1EA</td><td>Coomassie 蓝&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

向外探索：蓝细菌释放的碳水化合物聚合物与蛋白质的分离

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

蓝藻能够主动向胞外环境分泌多种生物分子，例如杂多糖和蛋白质。对这些生物分子进行鉴定和表征，有助于深入了解其分泌途径并实现有效调控。此外，其中一些生物分子在生物技术应用方面也具有重要意义。本文描述了两种简便快速分离蓝藻释放的碳水化合物聚合物和蛋白质的实验方案。分离释放型碳水化合物聚合物的方法基于在水溶液中使用有机溶剂沉淀多糖的传统技术。该方法可保持聚合物的原有特性，同时避免细胞碎片和培养基成分等污染物的混入。在流程结束时，所得冻干聚合物可直接使用或进行表征，也可根据最终用途进一步纯化。关于蓝藻胞外蛋白质组的分离，该技术通过离心和过滤去除主要污染物后，对无细胞培养基进行浓缩。该策略可有效分离通过膜转运蛋白或外膜囊泡途径进入胞外环境的蛋白质。这些蛋白质随后可通过标准的质谱技术进行鉴定。本文所述方案不仅适用于多种蓝藻，也可应用于其他细菌菌株。此外，这些操作步骤可根据产物的最终用途、所需纯度以及具体细菌菌株进行灵活调整。

图 1 展示了从集胞藻培养物中提取释放的碳水化合物聚合物方法的示意图。图 2 显示了中等胞外多糖（EPS）产生菌集胞藻 Synechocystis sp. PCC 6803 和高效 EPS 产生菌 Cyanothece sp. CCY 0110 的沉淀聚合物。图 3 展示了不同程度污染的冻干聚合物，突出了离心步骤对最终产物纯度的重要性。图 4 描述了蓝细菌胞外蛋白质组的分离方法。图 5 显示了不同来源的浓缩无细胞培养基样品（即来自不同生长阶段的培养物以及类胡萝卜素产量较低的蓝细菌菌株）。通过 SDS-PAGE 分离的两种形态不同的蓝细菌菌株——单细胞蓝细菌 Synechocystis sp. PCC 6803 和丝状蓝细菌 Anabaena sp. PCC 7120 的胞...

本文描述了分离蓝细菌释放的碳水化合物聚合物及其胞外蛋白质组的实验方案。这两种方法均包含获得高纯度聚合物或蛋白质的关键步骤，所得产物可用于进一步分析或应用。此外，这些方案也可根据用户的特定需求轻松进行调整。

蓝细菌能够主动将多种生物分子分泌到胞外环境中，例如异多糖和蛋白质。

我们开发的这些方案对于研究蓝细菌的分泌机制及其释放的产物（即胞外多糖和蛋白质）具有重要意义。所获得的知识将使我们能够针对多种应用（特别是生物技术和生物医学应用）对这些产物进行定制化改造。这些方案非常简便易行。可根据生产生物体、用户需求以及产品的最终应用进行定制。这些方案的主要优势在于能够轻松地适用于其他生物系统，特别是其他细菌。这些方案操作简便。然而，根据细菌菌株或所需纯度的不同，可能需要进行一些调整。首先，在标准条件下培养蓝细菌菌株，并采用标准方案测定其生长情况。接下来，将培养物转移至透析膜中，并用至少10倍体积的去离子水在4°C条件下持续搅拌透析24小时。在4°C、15,000 × g 条件下离心15分钟。将上清液转移至新的小瓶中，弃去沉淀。再次在4 °C、20,000 × g 条件下离心15分钟，以去除污染物（如细胞壁碎片或脂多糖）。离心后，将上清液转移至玻璃烧杯中，弃去沉淀。为沉淀聚合物，向上清液中加入两倍体积的96%乙醇，并将悬浮液在4 °C下孵育过夜。对于少量或不可见的沉淀聚合物，将悬浮液在4°C条件下以13,000 × g离心25分钟。轻轻弃去上清液，并将沉淀物重悬于1至2毫升经高压灭菌的去离子水中。将该水相悬浮液转移至样品瓶中。对于可见的大量沉淀聚合物，使用无菌金属镊子将沉淀的聚合物收集至小瓶中。挤压聚合物以去除多余的乙醇。为进行冻干（即冷冻干燥）过程，将含有沉淀聚合物的小瓶于–80 °C下放置过夜。将聚合物冻干至少48小时。然后将干燥的聚合物置于室温下的干燥器中保存，直至后续使用。为浓缩培养基，首先在标准条件下培养蓝细菌。使用标准方法监测蓝细菌的生长。然后在室温下以 4,000 × g 离心培养物 10 分钟。将上清液转移至烧瓶中，并弃去细胞沉淀。接下来，将倾析后的培养基通过孔径为0.2微米的滤膜过滤。为将培养基浓缩约500倍，使用标称截留分子量为3千道尔顿的离心浓缩装置，在4,000 × g、15 °C条件下离心，每轮离心时间最长不超过1小时。离心后，用浓缩后的样品冲洗滤器装置样品储液池的管壁，并将内容物转移至微量离心管中。用高压灭菌的培养基对滤器装置的样品储液池进行额外的洗涤步骤，以确保最大限度地回收胞外蛋白质组。然后将胞外蛋白质组样品储存在负20摄氏度，直至后续使用。必须剧烈加入乙醇，以优化聚合物沉淀效果和产量。离心沉淀聚合物后，弃去上清液时应小心操作，以避免重新悬浮可能松散附着在烧瓶壁上的沉淀物。若进行手动过滤，操作应轻柔，以防止滤膜破损。某些沉淀的聚合物仅在离心后才可见，主要附着在烧瓶壁上，例如集胞藻（Synechocystis）产生的胞外多糖（EPS）。在其他情况下，例如聚球藻（Cyanothece）聚合物，可在沉淀后直接观察到聚合物团块漂浮在玻璃烧杯中。某些污染物在聚合物冻干后可轻易通过肉眼检测，因为它们会改变聚合物的颜色，正常情况下聚合物应为白色或浅棕色。呈橙色的聚合物表明被类胡萝卜素或含有此类色素的结构污染。例如，绿色聚合物会受到细胞碎片和叶绿素的污染。不同细菌菌株的胞外蛋白质组可能存在显著差异。例如，单细胞蓝细菌的胞外蛋白质组与丝状菌株的胞外蛋白质组。外分泌蛋白质组浓缩样品中高含量的多糖可能会阻碍外分泌蛋白质组的分析。例如，它可能延缓蛋白质分离，并掩盖丰度较低的蛋白质。用户可对聚合物进行表征，包括其组成、理化性质，检测聚合物的生物活性，或修饰聚合物组分。对于蛋白质鉴定，可进行凝胶电泳分离蛋白质并结合质谱分析。而对于囊泡的分离，应对外分泌组分进行超速离心。在我们课题组中，这些实验方案已为揭示蓝细菌的分泌机制，以及胞外多糖在不同领域的应用（如生物修复、抗肿瘤或药物递送载体）奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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