Name: 使用微蒂特萝卜无线电标签进行多维欧大肠杆菌测量 (p) ppGpp,然后是薄层色谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学习使用微孔板放射性标记和薄层色谱法测量细菌中全局调控因子ppGpp的水平。该方法支持高通量分析，适用于研究革兰氏阳性和阴性细菌在生理应激与恢复过程中的核苷酸调控机制。

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本研究得到了美国国立卫生研究院尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发育研究所院内研究计划的支持。

1. 培养基制备
<ol>
	<li>对于MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）培养基25，使用1/10体积的10倍浓缩MOPS盐溶液、1/100体积的100倍浓缩微量元素溶液、用于过夜培养的3 mM磷酸钠或用于32P均匀标记的0.2 mM磷酸钠、0.2%葡萄糖以及1 µg/mL硫胺素（维生素B1）。如需要，添加氨基酸至终浓度40 µg/mL。
	<ol>
		<li>配制MOPS盐溶液时，使用以下成分：400 mM MOPS、40 mM Tricine、0.1 mM FeSO4、95 mM NH4Cl、2.6 mM K2SO4、5 µM CaCl2、10.56 mM MgCl2和500 mM NaCl。按上述顺序依次加入各组分，以避免沉淀。用KOH调节pH至7.4，并通过过滤除菌。</li>
		<li>配制100倍浓缩微量元素溶液时，使用以下成分：3 µM (NH4)6(MO7)24、0.4 mM H3BO4、30 µM CoCl2、10 µM CuSO4、80 µM MnCl2和10 µM ZnSO4。通过高压灭菌除菌。</li>
		<li>葡萄糖（20%）和磷酸钠（300 mM）溶液应分别作为100倍浓缩液高压灭菌。硫胺素和氨基酸混合物的100倍浓缩液则通过过滤除菌。每次实验均需使用无菌储备液新鲜配制培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用 32P 标记
<ol>
	<li>在含有 3 mM 磷酸钠的 MOPS 培养基中培养过夜菌液。</li>
	<li>在 24 孔板中，每孔加入 550 µL 含有 0.2 mM 磷酸钠载体的 MOPS 培养基和 30 µL 细菌接种物（1/20 稀释度），使初始接种量的 OD600nm 达到 0.1。设一孔仅含新鲜培养基作为空白无菌对照。</li>
	<li>将 24 孔板置于 37 °C 摇床培养箱中，以 900 rpm 振荡培养 30 分钟。培养过程中由底部加热，振荡提供通气。需用胶带将板固定牢固，防止倾斜或洒漏。可通过平行设置另一块不含 32P 的培养基板，在相同条件下使用酶标仪监测菌液生长情况。</li>
	<li>向每孔加入 100 µCi 的 32P 正磷酸盐（取自 5 mCi/mL 储液的 20 µL）。 
	注意：放射性活度可根据实验需求进行调整。对于低基础水平的检测，使用 100 µCi 放射性标记物配合 0.2 mM 载体磷酸盐效果良好；但若需测量预计与 GTP 池相当的 (p)ppGpp 水平，可将标记量降至 25 或 50 µCi。不建议将载体磷酸盐浓度降至 0.2 mM 以下，以免磷酸盐浓度限制细菌生长。 
	警告： 32P 为 β 射线发射同位素，操作时应采用符合安全规范的适当屏蔽。所有放射性物质必须按照相关规定妥善处理，并采取一切可能的预防措施。</li>
	<li>在摇床培养箱中继续培养 1 至 2 个倍增时间（1 小时或更长），使外源标记物与细胞内核苷酸池基本达到平衡，随后再施加应激处理。</li>
</ol>
3. 诱导应激或饥饿
<ol>
	<li>根据所研究的应激类型，选择适当的方法诱导应激，例如添加代谢通路抑制剂、改变温度、耗尽必需营养物质、改变渗透压、诱导氧化应激、添加毒素等。
	<ol>
		<li>例如，添加 100 µg/mL L-缬氨酸以诱导异亮氨酸饥饿 E. coli K-12 菌株。诱导 5 分钟后将观察到 ppGpp 水平升高。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 取样与ppGpp提取
<ol>
	<li>取每种标记的细胞样品 20 µL，加入含有 20 µL 冰冷 6 M 甲酸的 0.2 mL PCR 管中。</li>
	<li>立即将样品置于干冰中。</li>
	<li>通过三次冻融循环以提高细胞提取效率。</li>
	<li>在点样 PEI 纤维素薄层色谱板前，将样品在最大转速下离心 1 分钟，使细胞碎片沉淀，避免将其点样到色谱板上。</li>
</ol>
5. 薄层色谱法
<ol>
	<li>用软铅笔在20 cm × 20 cm的PEI-纤维素薄层色谱板上距离边缘1 cm处划出起始线，该色谱板顶部已用剪刀剪去5 cm。将每个样品5 µL以液滴形式点样于PEI表面。点样后立即开始上行展开，不要让斑点干燥，以减少拖尾现象，提高分辨率。</li>
	<li>在展开槽中进行上行展开，槽内加入1.5 M KH2PO4（pH 3.4）溶液，液层深度应足够浅，确保液体不会接触起始线上的样品点。用密封盖封闭展开槽，使液体沿剪裁后的色谱板上升至顶端（15 cm）。为获得pH 3.4的1.5 M KH2PO4溶液，需通过添加H3PO4调节pH值。</li>
	<li>取出完全展开的色谱图，在室温下空气中干燥。</li>
	<li>将色谱图顶部含有游离32P的区域（即pH前沿部分）剪下并作为放射性废物处理。该部分在图2中以黄色表示，并可在紫外光下清晰观察。若仅检测迁移速度慢于GTP的(p)ppGpp核苷酸，建议同时运行紫外-可见光GTP标准品，然后剪除更大的上部区域（即GTP以上的全部部分，如图2所示）。</li>
	<li>将自显影胶片与磷屏一起曝光过夜。</li>
	<li>显影胶片，并使用磷屏成像仪捕获和定量磷屏信号。</li>
</ol>
6. (p)ppGpp 的定量分析
<ol>
	<li>使用 Image J26,27 对放射性斑点进行定量。 
	注意： (p)ppGpp 的量可归一化为每个样品中观察到的总 G 核苷酸量（图 2）。如果背景信号均匀，可通过减去一个空白区域（图 2 中的 4 号框）来校正背景。总 G 为检测到的 GTP、ppGpp 和 pppGpp 的总和。该归一化方法假设 GMP 和 GDP 水平可忽略不计，这在 E. coli 中成立。将特定核苷酸的量与总 G 量相比，可有效校正加样体积的差异。</li>
</ol>
7. ppGpp降解速率的测定
注意：对该方案进行修改后，可用于测量 ppGpp 的降解速率。
<ol>
	<li>在施加胁迫或饥饿处理一段时间以使 ppGpp 积累（步骤 3）后，逆转胁迫条件以阻断 ppGpp 的持续合成，从而检测其水解速率。逆转方法取决于所用胁迫类型。例如，加入 200 µg/mL 氯霉素以逆转氨基酸饥饿。</li>
	<li>ppGpp 的衰减速率通常较快，但可能有所差异，因此每 20–30 秒取样一次，持续至 2 分钟。样品处理方法同步骤 4。</li>
	<li>TLC 展开后（如步骤 5 所述），根据时间进程获得 ppGpp 水平，将残余 ppGpp 含量对时间作半对数图，可直观呈现为直线形式的零级衰减速率，并据此估算 ppGpp 的半衰期。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

实现细胞的近乎均匀标记是本实验方案的关键步骤。因此，使用成分明确的培养基（如MOPS或Tris培养基）至关重要，以便调控载体磷酸盐浓度和比活性。不能使用磷酸盐缓冲培养基，例如M9或培养基A。大多数成分未明确的培养基含有可变含量的磷酸盐，例如LB、胰蛋白胨和酪蛋白氨基酸。磷酸同位素33P是一种较弱的放射性发射体，可替代32P。这种替代的优点在于安全性更高，且半衰期为25天，而32P的半衰期为14天。然而，32P能量更高的辐射显著提高了检测灵敏度。必须强调操作同位素时的危险性，以及采取适当屏蔽防护和规范处置的重要性。最近发现一种能够特异性识别ppGpp28的核糖开关，未来可能为在体外和体内检测ppGpp提供更安全的方法。如引言中所述，尽管存在其他检测方法，磷酸标记法仍是检测细菌（p）ppGpp以及其他磷酸化化合物（如核糖或脱氧核糖-NTP池、PRPP、PPi或糖磷酸盐）的一种灵敏、直接且快速的高通量检测手段。
另一个关键步骤是确保平行培养物（摇床培养箱...

（p）ppGpp 是一种全局性调控的第二信使，可调节大量基因的表达，包括核糖体和氨基酸合成相关基因1,2。尽管最初在Escherichia coli中被发现3，（p）ppGpp 也存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，以及植物叶绿体中4,5。对于大肠杆菌（E. coli）及其他革兰氏阴性菌而言，（p）ppGpp 可在两个不同位点直接与RNA聚合酶相互作用6,7,8。在革兰氏阳性菌中，（p）ppGpp 抑制GTP的丰度，而GTP的变化可被CodY蛋白感知；CodY是一种GTP结合蛋白，具有特异性的DNA识别基序，从而介导基因表达调控9,10。（p）ppGpp 在多种营养缺乏和应激条件下会积累，导致生长减缓，并通过调节基因表达帮助细胞适应压力环境11,12。
ppGpp 的净积累量反映了合成酶与水解酶活性之间的平衡。E. coli 中，RelA 是一种强效合成酶，而 SpoT 具有双重功能，兼具强效水解酶和弱效合成酶活性，这两种酶可能在不同应激条件下以不同方式受到调控。当核糖体 A 位点上与密码子匹配的氨酰-tRNA 供应不足，无法满足蛋白质合成需求时，强效 RelA 合成酶即被激活13,14,15。弱效 SpoT (p)ppGpp 合成酶则在其他应激条件下被激活，同时其强效 (p)ppGpp 水解酶活性受到抑制。在某些情况下，ACP 或 Rsd 等蛋白质可与 SpoT 结合，从而改变水解与合成之间的平衡16,17。在革兰氏阳性菌中，(p)ppGpp 的合成与水解反映了一种更为复杂的平衡，涉及一种兼具强效合成与水解活性的单一 RelA/SpoT 同源蛋白（RSH），以及若干较小的水解酶和/或合成酶12。
（p）ppGpp核苷酸最初是在氨基酸饥饿诱导的严谨反应过程中，通过薄层色谱（TLC）自显影图上出现的异常32P标记斑点被发现的3。更详细的标记方法已有综述18。本文所述方案（图1）是对这些方法的改进，可在微孔板上同时监测多个样品的生长情况。该方法便于对（p）ppGpp丰度变化进行多次生物学和实验技术上的重复测定，最初是为双相生长转换的研究&#160;而开发的19。使用32P标记（p）ppGpp并结合TLC检测，还可用于测定（p）ppGpp的降解速率。此外，已有其他方法被开发用于测定（p）ppGpp水平，如质谱法、&#160;HPLC20、荧光化学传感器21,22，以及将GFP基因融合至受ppGpp影响的启动子上进行检测23,24。目前荧光化学传感器的应用仍受限，因其在结合ppGpp后光谱位移较小，且难以区分ppGpp与pppGpp21。该方法适用于体外检测（p）ppGpp，但不适用于细胞提取物中的检测。基于HPLC的方法虽已有改进20，但需要昂贵的设备，且难以适用于高通量分析。最后，GFP融合方法可估计ppGpp依赖性的激活或抑制效应，但并不能直接测量ppGpp本身。尽管上述替代方法各有价值，但它们或需昂贵设备，或需要大量手动操作时间，或难以实现多次动力学取样及后续处理。而本文所述方法可在约20分钟内将96个样品点样至6块TLC板上（每板18个样品），在数小时内完成TLC展开，定量数据则可在数小时或过夜曝光后获得，具体时间取决于标记强度。

<table><tbody><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;(MO&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;24&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔科技公司</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>放射自显影胶片</td><td>丹维尔科学公司</td><td>E3218</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.贝克公司</td><td>1-1309</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>RPI公司</td><td>C61000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔科技公司</td><td>C-371</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.贝克公司</td><td>1843</td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔科技公司</td><td>I-146</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>费舍尔生物科技公司</td><td>BP1215-500</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Macron公司</td><td>4912-12</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Macron公司</td><td>2549-04</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.贝克公司</td><td>0260-02</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛公司</td><td>P9458-250G</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔生物科技公司</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>L-缬氨酸</td><td>西格玛公司</td><td>V-6504</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔科技公司</td><td>FL-06-0303</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读数仪 Synergy HT</td><td>伯腾公司</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛公司</td><td>M-9522</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>西格玛公司</td><td>M1254-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>马林克罗特公司</td><td>7892</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T.贝克公司</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>马林克罗特公司</td><td>7917</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>西格玛公司</td><td>A0171-500G</td><td></td></tr><tr><td>P-32 放射性核素，1 mL 水中的正磷酸（5 mCi）</td><td>珀金埃尔默公司</td><td>NEX053005MC</td><td></td></tr><tr><td>储存式磷屏</td><td>柯达公司</td><td>So230</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>艾本德公司</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>硫胺素</td><td>西格玛公司</td><td>T-4625</td><td></td></tr><tr><td>TLC PEI 纤维素 F</td><td>默克-密理博公司</td><td>1.05579.0001</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>RPI公司</td><td>T2400-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400 成像仪</td><td>GE 医疗集团</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔科技公司</td><td>Z-68</td><td></td></tr></tbody></table>

使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（escherichia coli）的(p)ppgpp水平

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

(p)ppGpp 核苷酸在细菌中作为全局性调控因子，响应多种物理和营养胁迫。其响应迅速，可在数秒内启动，导致其浓度迅速积累至接近甚至超过 GTP 池的水平。当胁迫解除时，(p)ppGpp 会迅速降解，半衰期通常不足一分钟。(p)ppGpp 的存在会引起细胞基因表达和代谢的改变，从而抵消胁迫带来的损伤。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有不同的响应机制，但二者均依赖于 (p)ppGpp 的浓度。因此，在关键的胁迫转换期，有必要在从10秒到数小时不等的时间间隔内，同时监测多个放射性标记的细菌培养物。本实验方案旨在解决这一技术难题。该方法利用温度和摇床可控的微量滴定板培养箱，可并行监测生长情况（吸光度）并快速取样均一磷酸盐放射性标记的培养物，随后通过聚乙烯亚胺-纤维素薄层色谱法分离并定量核苷酸池。该方法仅需少量样品，即可完成多次技术重复和生物学重复分析。诸如双相生长及快速 (p)ppGpp 转换速率等复杂的生长转换过程，均可通过此方法进行定量评估。

在 E. coli K-12 菌株中，添加缬氨酸会引发异亮氨酸的内源性饥饿，导致在 5 分钟后 ppGpp 水平升高3。在 MOPS 培养基中培养的细胞（除 ILV 外含有所有氨基酸）按 图 1 所示用 32P 进行标记。标记后，加入 6 µL 的 10 mg/mL L-缬氨酸（终浓度为 100 µg/mL），以诱导异亮氨酸饥饿。在添加缬氨酸后 0 和 5 分钟分别取样。5 分钟后（图 3A），ppGpp 和 pppGpp 的水平分别增加了 2 倍和 2.5 倍。作为阴性对照，使用无细胞标记样品以检测 32P 来源中可能存在的非正磷酸盐化合物。此外，使用 ppGpp 缺陷型菌株（ΔrelA ΔspoT）作为阴性对照有助于更准确地鉴定斑点。
通过添加蛋白质合成抑制剂氯霉...

在微量滴定板中培养放射性标记的细菌，可实现高通量取样，从而对核苷酸池含量（包括(p)ppGpp）进行多次技术重复和生物学重复检测。可监测由生理应激源引发的生长转换及其从应激中恢复过程中的效应。

使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（Escherichia coli）的(p)ppGpp水平

(p)ppGpp 核苷酸作为一种全局性调控因子，在细菌中响应多种物理和营养胁迫。其作用迅速启动，在……

该方法用于检测在不同生长条件和应激状态下全局调控因子 ppGpp 的含量水平。ppGpp 存在于革兰氏阳性菌和阴性菌中，也存在于叶绿体中。当产生应激时，ppGpp 可在数秒内迅速生成，从而快速引发后续的调控反应。同时，它的半衰期较短，最多为30秒。因此，需要在10秒至数小时不等的时间间隔内监测大量培养物，包括处于应激转变状态的样本。我们还通过在微孔板中对细菌培养物进行放射性标记，以实现高通量取样，从而支持多次技术重复和生物学重复。操作放射性物质时，务必遵守适当的安全措施。开始本实验前，按照文本方案中所述配制所有培养基。在含有3毫摩尔磷酸钠的MOPS培养基中培养过夜菌液。向24孔板的各孔中加入550微升MOPS培养基，其中含有0.2微摩尔的磷酸钠载体以及每种细菌接种物30微升。这将使初始接种物的OD600达到0.1。另取一孔加入新鲜培养基作为无菌对照。将培养板置于37摄氏度的摇床培养箱中，以900转/分钟（RPM）振荡培养30分钟。在相同条件下，可使用另一块在不含p32的培养基中平行培养的培养板，通过酶标仪监测细胞生长情况。随后，向培养板的每孔中加入100微居里（microcuries）的p32正磷酸盐。将培养物置于摇床培养箱中培养一至两个倍增周期，以使胞外标记物与胞内核苷酸池基本达到平衡。为便于演示，本视频中未使用任何放射性物质。在真实实验中，必须采取适当的屏蔽防护，并使用巡测仪持续监测污染情况。首先，采用适合所研究应激类型的方法诱导应激。然后，将每份标记的细胞样品各20微升加入到单独的0.2毫升PCR管中，每管预先含有20微升冰上预冷的6摩尔甲酸。立即将样品置于干冰上。通过三次冻融循环提高细胞提取效率。在点样PEI纤维素薄层色谱前，将样品在最大转速下离心一分钟，以沉淀细胞碎片。首先，准备一块20厘米×20厘米的PEI纤维素TLC板。使用剪刀剪去顶部五厘米，并用软铅笔在距边缘一厘米处画一条起始线。将每个样品五微升（5 µL）的液滴点在PEI表面上。在斑点干燥之前，将层析板转移至含有1.5摩尔磷酸二氢钾溶液的层析缸中，液层应足够浅，以免接触点样原点。用密封盖将层析缸密闭，使液体上升至15厘米裁剪后的层析纸顶端。随后取出完全展开的层析图谱，在室温下空气中干燥。将含有游离P32的色谱图顶部切下，并作为放射性废物丢弃。使用磷屏使放射自显影胶片过夜曝光。次日，显影胶片，并使用磷屏成像仪捕获并定量磷屏的绿色信号。然后，使用 ImageJ 软件对放射性斑点进行定量分析。在施加胁迫或饥饿处理足够长的时间以允许 ppGpp 积累后，采用适当方法解除胁迫。每 20 至 30 秒取样一次，持续两分钟，样品按先前所述方法进行处理。薄层色谱（TLC）展开并获得时间过程中ppGpp的含量后，将残余的ppGpp含量对时间作半对数坐标图。本研究中，在含有除异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸（ILV）以外所有氨基酸的MOPS培养基中培养的细胞用P32进行标记。标记完成后，加入L-缬氨酸以诱导异亮氨酸饥饿。五分钟后，鸟苷四磷酸和五磷酸的水平升高了两到两倍半。使用无细胞的标记样品作为阴性对照，以检测P32源中可能存在的非正磷酸盐化合物。通过氯霉素可逆转异亮氨酸饥饿状态，氯霉素是一种蛋白质合成抑制剂，可减少带电荷的异亮氨酸tRNA的消耗，进而恢复带电荷与不带电荷tRNA的高比例。强rela介导的ppGpp合成酶的激活被消除，从而可以准确测量ppGpp的降解，而不受残余合成的干扰。在此情况下，ppGpp的半衰期约为64秒。在诱导任何应激或饥饿条件之前，必须让细胞生长数代，以实现均匀标记。由于ppGpp在细菌中广泛存在，该方法可应用于其他生物体。对薄层色谱展开方法进行改进，可实现所有调控性核苷酸（如ppApp）的有效分离。P52是一种更强的放射性发射同位素，因此必须使用适当的屏蔽措施，并妥善处理所有残留物。

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科研

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Biology

生物学

使用微蒂特萝卜无线电标签进行多维欧大肠杆菌测量 (p) ppGpp,然后是薄层色谱

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

来源： Fernández-Coll, L. 和 Cashel, M. 利用微量滴定板放射性标记结合薄层色谱法对大肠杆菌（Escherichia coli）中 (p)ppGpp 进行多项活体测定。J. Vis. Exp. (2019)本视频介绍了一种利用薄层色谱法（TLC）高通量检测细菌应激反应核苷酸 ppGpp 和 pppGpp 水平及其动态变化的实验方案。该方法能够快速、经济且高效地定量分析在不同应激条件下细菌培养物中的 (p)ppGpp...

基于薄层色谱法分离应激诱导细菌中提取的(p)ppGpp核苷酸

本视频演示了一种基于薄层色谱的酶活性测定方法，通过使用放射性标记的核苷酸来检测焦磷酸激酶活性。该方法可深入了解核苷酸合成及磷酸转移反应。...

基于薄层色谱的酶活性检测法：利用薄层色谱测定体外焦磷酸激酶活性的技术

本视频展示了配体检测的差分径向毛细管作用——一种用于系统性高通量筛选细胞内核苷酸第二信使结合蛋白的技术。该技术可实现第二信使直接与细胞裂解液中过表达的目标蛋白结合，从而无需进行蛋白质纯化。...

配体差异径向毛细管作用分析：一种高通量筛选细菌核苷酸第二信使结合蛋白的细胞内靶标蛋白技术

本文介绍了一种用于在大体积农业用水中对食源性病原体进行一体化浓缩、富集及终点比色检测的方案。该方法通过改良莫尔棉签（Modified Moore Swabs,...

基于比色法的纸质检测 大肠杆菌, 沙门氏菌 和 spp. 单核细胞增生李斯特菌 从大量农业用水中

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本文描述了一种利用荧光标记的DNA探针对单个信使RNA（mRNA）转录本进行标记的方法，用于大肠杆菌（E.

单个细胞中转录本标记方法 大肠杆菌 用于单分子荧光的细胞 原位 杂交实验

本文介绍了一种纯化组氨酸标签焦磷酸激酶酶的方法，并利用放射性标记底物及产物的薄层色谱分析来检测其酶活性。...

一种纯化与 体外 一种(p)ppGpp合成酶的活性检测 艰难梭菌

本文介绍了一种在单分子水平上评估复杂蛋白质样品中每种蛋白质组分标记均一性的实验方案。...

单分子水平下蛋白质组范围内的标记均一性定量分析

利用ORFeome文库，差异径向毛细管配体结合分析法（DRaCALA）可用于鉴定生物体中的小分子配体结合蛋白。...

利用配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）鉴定小分子配体的结合蛋白

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扩增 大肠杆菌 在连续流动PCR微流控芯片中的扩增及其通过毛细管电泳系统的检测

学习使用微孔板放射性标记和薄层色谱法测量细菌中全局调控因子ppGpp的水平。该方法支持高通量分析，适用于研究革兰氏阳性和阴性细菌在生理应激与恢复过程中的核苷酸调控机制。

使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（Escherichia coli）的(p)ppGpp水平

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