使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（Escherichia coli）的(p)ppGpp水平

该方法用于检测在不同生长条件和应激状态下全局调控因子 ppGpp 的含量水平。ppGpp 存在于革兰氏阳性菌和阴性菌中，也存在于叶绿体中。当产生应激时，ppGpp 可在数秒内迅速生成，从而快速引发后续的调控反应。

同时，它的半衰期较短，最多为30秒。因此，需要在10秒至数小时不等的时间间隔内监测大量培养物，包括处于应激转变状态的样本。我们还通过在微孔板中对细菌培养物进行放射性标记，以实现高通量取样，从而支持多次技术重复和生物学重复。

操作放射性物质时，务必遵守适当的安全措施。开始本实验前，按照文本方案中所述配制所有培养基。在含有3毫摩尔磷酸钠的MOPS培养基中培养过夜菌液。

向24孔板的各孔中加入550微升MOPS培养基，其中含有0.2微摩尔的磷酸钠载体以及每种细菌接种物30微升。这将使初始接种物的OD600达到0.1。另取一孔加入新鲜培养基作为无菌对照。

将培养板置于37摄氏度的摇床培养箱中，以900转/分钟（RPM）振荡培养30分钟。在相同条件下，可使用另一块在不含p32的培养基中平行培养的培养板，通过酶标仪监测细胞生长情况。随后，向培养板的每孔中加入100微居里（microcuries）的p32正磷酸盐。

将培养物置于摇床培养箱中培养一至两个倍增周期，以使胞外标记物与胞内核苷酸池基本达到平衡。为便于演示，本视频中未使用任何放射性物质。在真实实验中，必须采取适当的屏蔽防护，并使用巡测仪持续监测污染情况。

首先，采用适合所研究应激类型的方法诱导应激。然后，将每份标记的细胞样品各20微升加入到单独的0.2毫升PCR管中，每管预先含有20微升冰上预冷的6摩尔甲酸。立即将样品置于干冰上。

通过三次冻融循环提高细胞提取效率。在点样PEI纤维素薄层色谱前，将样品在最大转速下离心一分钟，以沉淀细胞碎片。首先，准备一块20厘米×20厘米的PEI纤维素TLC板。

使用剪刀剪去顶部五厘米，并用软铅笔在距边缘一厘米处画一条起始线。将每个样品五微升（5 µL）的液滴点在PEI表面上。

在斑点干燥之前，将层析板转移至含有1.5摩尔磷酸二氢钾溶液的层析缸中，液层应足够浅，以免接触点样原点。用密封盖将层析缸密闭，使液体上升至15厘米裁剪后的层析纸顶端。随后取出完全展开的层析图谱，在室温下空气中干燥。

将含有游离P32的色谱图顶部切下，并作为放射性废物丢弃。使用磷屏使放射自显影胶片过夜曝光。次日，显影胶片，并使用磷屏成像仪捕获并定量磷屏的绿色信号。

然后，使用 ImageJ 软件对放射性斑点进行定量分析。在施加胁迫或饥饿处理足够长的时间以允许 ppGpp 积累后，采用适当方法解除胁迫。每 20 至 30 秒取样一次，持续两分钟，样品按先前所述方法进行处理。

薄层色谱（TLC）展开并获得时间过程中ppGpp的含量后，将残余的ppGpp含量对时间作半对数坐标图。本研究中，在含有除异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸（ILV）以外所有氨基酸的MOPS培养基中培养的细胞用P32进行标记。标记完成后，加入L-缬氨酸以诱导异亮氨酸饥饿。

五分钟后，鸟苷四磷酸和五磷酸的水平升高了两到两倍半。使用无细胞的标记样品作为阴性对照，以检测P32源中可能存在的非正磷酸盐化合物。通过氯霉素可逆转异亮氨酸饥饿状态，氯霉素是一种蛋白质合成抑制剂，可减少带电荷的异亮氨酸tRNA的消耗，进而恢复带电荷与不带电荷tRNA的高比例。

强rela介导的ppGpp合成酶的激活被消除，从而可以准确测量ppGpp的降解，而不受残余合成的干扰。在此情况下，ppGpp的半衰期约为64秒。在诱导任何应激或饥饿条件之前，必须让细胞生长数代，以实现均匀标记。

由于ppGpp在细菌中广泛存在，该方法可应用于其他生物体。对薄层色谱展开方法进行改进，可实现所有调控性核苷酸（如ppApp）的有效分离。P52是一种更强的放射性发射同位素，因此必须使用适当的屏蔽措施，并妥善处理所有残留物。