Name: 对比度增强记录 (PrAnCER) 的爪打印分析:用于评估电机缺陷的低成本、开放访问自动步态分析系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 了解PrAnCER步态分析系统，利用半透明地板和对比度增强技术自动量化大鼠步态特征。该系统成本低、易于设置，可准确评估帕金森病等多种损伤和疾病模型中的运动功能，为神经科学研究提供可靠工具。

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本工作由布朗大学卡尼脑科学研究所资助。

所有操作均遵循布朗大学机构动物护理和使用委员会的指导方针。
1. 步态分析装置
<ol>
	<li>准备步态分析跑道，该跑道由一个透明的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）封闭通道（长 36 英寸 × 宽 3 英寸 × 高 4.5 英寸）组成，放置在一块透明的 PMMA 地板上（图 2A）。通过在 PMMA 地板上覆盖一张与跑道宽度相同的 16 磅棉纤维绘图纸，使其呈现半透明状态。&#160; 
	注意：使地板呈现半透明状态的方法还有其他多种。</li>
	<li>在跑道正下方放置一台帧率至少为每秒 30 帧（fps）的相机，用于捕捉跑道中段区域（图 2B）。</li>
	<li>在跑道地板上方约 1 英寸、距离地板约 2 英寸处固定一条 12 V LED 灯带，每英尺含 18 个 LED，用于照亮跑道。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>让动物在开始操作前于动物房适应至少1周时间。在实验开始前，对大鼠进行至少5天的抓取操作训练。本研究使用了8只约3月龄的雄性Long Evans大鼠。</li>
	<li>适应&#160;将动物带入测试房间和步态行走通道，同时关闭房间灯光
	<ol>
		<li>将大鼠的家笼置于步态行走道末端的同一水平面上，作为目标箱。需注意，如果家笼较深，老年或运动功能受损的大鼠可能需要借助斜坡或台阶，以更方便地进入家笼。</li>
		<li>让大鼠从实验者的手上沿步道行走，返回其居住笼。</li>
		<li>大鼠在走道末端常会停下观察周围环境，然后才跳回居住笼。若大鼠超过1分钟仍未离开走道，可用轻柔推动的方式促使其进入居住笼。</li>
		<li>如果大鼠转身，使用一小块有机玻璃挡住跑道的“起点”端。重复操作，共进行3次运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>至少适应2天，或直至大鼠能够以稳定的速度舒适地穿过走道而无僵直现象。</li>
</ol>
3. 步态检测流程
<ol>
	<li>调整网络摄像头软件的设置，以获得最清晰的足印图像。所有步态测试期间均需关闭室内灯光。</li>
	<li>每次运行单独录制，并进行适当标注，以便后续使用自动分析程序。</li>
	<li>确保羊皮纸表面无污点或碎屑。在大鼠进入步道前数秒开始录制，待其离开步道并进入居住笼后停止录制。</li>
	<li>重复上述操作，直至完成三次合格的运行，或累计时间达到10分钟为止。</li>
	<li>每只大鼠测试结束后，用乙醇擦拭步道，并根据需要更换羊皮纸。 
	注意：合格的测试定义为动物在运行的前四步中持续行走且无停顿。若难以实现此标准，可调整判定标准，将运行过程中任意时段出现的连续四步无停顿或突然加速的情况也纳入合格测试范围。</li>
</ol>
4. PrAnCER 自动化分析
<ol>
	<li>将所有待分析的视频放入一个文件夹中。</li>
	<li>运行 Python 脚本 PrAnCER 启动 PrAnCER 程序。PrAnCER 将根据 图3 和 图4 所示的步骤对视频进行分析。</li>
	<li>在弹出菜单中，点击 Choose a folder 按钮选择指定文件夹。如有需要，可自定义分析选项。每个参数的详细说明可通过点击其旁边的问号查看。完成后点击 Continue。</li>
	<li>在出现的步道图像上定义感兴趣区域（ROI）。具体操作为：单击鼠标左键定义上边缘，单击鼠标右键定义下边缘。如果出现的框选区域正确，按 N 继续；否则按 Z 撤销操作。一旦按下 N，程序将自动运行。</li>
	<li>PrAnCER 分析完成后，在终端中按下 Enter 键终止程序。</li>
	<li>如需手动复查 PrAnCER 输出的结果&#160;，运行&#160;Python 脚本 GaitEditorGUI，并为每个视频选择&#160;相应的 .mp4 文件。如有必要，修正任何误识别或合并的足印。</li>
	<li>为提取空间和时间步态参数，运行 Python 脚本 ParameterAnalyzer。选择要分析的后肢足印数量以及待分析的视频文件夹，然后点击 Continue。该操作将为每个视频生成一个包含多个常用步态参数的 .csv 文件，这些参数在 Table 2 中有详细描述，并在 Figure 5 中进行了图示。 
	注意：完整的脚本以及数据读取与分析的说明可在作者的 GitHub 页面获取（www.github.com/hayleybounds）。本算法使用免费开源的 Python 库 OpenCV21 实现。GitHub 上还提供了构建步态分析步道的详细说明。</li>
</ol>

<ol><li>Lakes, E. H., Allen, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gait+analysis+methods+for+rodent+models+of+arthritic+disorders%3A+reviews+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).</li>
<li>Lee, H. Y., Hsieh, T. H., Liang, J. I., Yeh, M. L., Chen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+video-based+gait+pattern+analysis+for+hemiparkinsonian+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Quantitative video-based gait pattern analysis for hemiparkinsonian rats.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 50 (9), 937-946 (2012).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gait+analysis+in+three+different+6-hydroxydopamine+rat+models+of+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease.</a> Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).</li>
<li>Batka, R. J., Brown, T. J., Mcmillan, K. P., Meadows, R. M., Jones, K. J., Haulcomb, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+speed+in+rodent+locomotion+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The need for speed in rodent locomotion analyses.</a> Anatomical Record. 297 (10), 1839-1864 (2014).</li>
<li>Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmill+gait+analysis+does+not+detect+motor+deficits+in+animal+models+of+Parkinson%E2%80%99s+disease+or+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Motor+Behavior%22%5BJournal%5D)">Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson’s disease or amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).</li>
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<li>Nakamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+three-dimensional+gait+analysis+system+for+mice+with+an+infrared+depth+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor.</a> Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).</li>
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<li>De Ryck, M., Schallert, T., Teitelbaum, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+versus+haloperidol+catalepsy+in+the+rat%3A+a+behavioral+analysis+of+postural+support+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Morphine versus haloperidol catalepsy in the rat: a behavioral analysis of postural support mechanisms.</a> Brain Research. 201 (1), 143-172 (1980).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本研究中，我们测试了PrAnCER——一种新型的自动化步态分析系统。该系统利用通过半透明地板生成的对比增强视频，以遮蔽动物身体并获得清晰的足印，从而实现简单、自动化的检测。PrAnCER能够准确识别足印，并对运动功能的变化具有敏感性。我们使用PrAnCER评估了在急性氟哌啶醇帕金森病（PD）模型中的步态改变。尽管氟哌啶醇未诱导出典型帕金森病模型所预期的明显运动功能障碍，但我们仍成功证明PrAnCER能够准确检测步态模式的变化。最后，我们量化了PrAnCER的准确性，并证实其对关键步态参数的测量结果与人工评分相当。
在两种氟哌啶醇处理条件下，我们均观察到动物出现高频率的僵直行为（运动不能），随后表现出奔跑或向前跳跃的逃避反应。尽管在多个研究中已报道相似剂量（0.25 mg/kg）的氟哌啶醇可引发运动不能16,23，但这种跳跃行为与典型的帕金森病症状并不一致3,14,19,24。值得注意的是，我们发现高剂量氟哌啶醇处理显著增加了步幅长度。这一结果最初令人意外，因为其他帕金森病氟哌啶醇模型均报道步幅长度减少3,19。然而，该现象可结合De Ryck等人（1980年）描述的“支撑-逃避”行为模式加以解释：大鼠在运动不能阶段后会奔跑以逃避，而奔跑和跳跃等高速步态与步幅长度增加相关4,25（图8C）。高剂量处理还导致后肢爪子的最大接触面积显著增加。低剂量氟哌啶醇处理则引起更具帕金森病特征的步态改变，包括支撑时相持续时间及最大接触面积的显著增加（图8A-B）。这些结果可能是氟哌啶醇诱导的运动不能所伴随的肌肉强直的反映。
尽管存在异常的支撑-逃避行为，我们仍能够证明PrAnCER确实可以检测步态的改变。结果表明，在合适的光照条件下，半透明地板能够产生高对比度且细节清晰的足部图像。在本研究中，我们通过在透明地板上覆盖描图纸使其变为半透明。相同的效果也可通过在透明地板上放置其他半透明覆盖物（如聚酯薄膜）来实现。或者，地板本身可采用磨砂有机玻璃等半透明材料制成。这种半透明地板和简单的有机玻璃行走通道成本低廉，可在半天内完成搭建。我们基于边缘检测的分析系统对设备的多种变化具有较强的适应性，并提供可调节的阈值，以便将系统适配于不同的实验装置、疾病模型或小鼠等体型更小的动物。
由于步道的某些特性，一些步态参数分析方法对传统公式进行了调整。例如，我们计算速度的方法与其他步态研究不同；由于透明地板与LED照明相结合会遮挡身体的视野，因此无法像通常那样通过追踪身体位置来计算速度。在本研究中，速度是通过将同一爪子两次触地之间的行进距离除以从第一次触地到第二次触地的时间来计算的。当然，也可以使用其他公式。例如，如果需要整体速度的测量值，可以将运行开始和结束时前爪位置平均值之间的距离除以运行的持续时间。
我们的分析证实，尽管与人工评分并不完全相同，但我们的自动化系统具有很高的准确性，能够生成可靠的步态测量结果。本文所述装置经过优化，可用于简单且低成本的运动功能分析。然而，还可进行若干改进以扩展PrAnCER的实用性。本系统的一个局限性在于，半透明地板虽然有利于足印的清晰检测，但会遮挡动物的身体轴线。尽管我们尚未发现此问题具有实际影响，但可通过在系统中增加一个顶部摄像机来解决。另一项改进是使用帧率更高的视频摄像机。虽然我们已能获得稳定的时间参数估计值，但在帧率低于100 fps8时，这些测量值的准确性会受到影响。增加高速视频摄像机无需更改分析软件，同时可提高时间参数测量的准确性和精确性。此外，其他一些步态分析系统采用镜面装置，以同时记录大鼠的侧面和腹面视图2,8,13。将此功能加入本装置，将有助于更准确地量化运动速度，并在动物跑动过程中实现更佳的行为观察。
本研究中，我们证明了使用半透明地板可有效隔离脚印，通过遮挡未与步道地板接触的物体的可见性，从而实现清晰的脚印成像。我们开发了一种自动化评分系统，利用这种高对比度的脚印准确识别各个脚爪。我们证实，该系统PrAnCER在量化步态参数方面的准确性与商用系统相当。我们发现，与生理盐水处理相比，高剂量氟哌啶醇给药会增加步长和最大接触面积。尽管这一变化与我们的预期相反，但对现有文献的进一步分析表明，这可能是急性给予氟哌啶醇后所观察到的逃避行为的一部分。低剂量氟哌啶醇处理则导致更典型的帕金森病（PD）症状，例如站立时长增加和最大接触面积增大。我们得出结论：尽管急性高剂量氟哌啶醇给药作为研究与PD相关步态障碍的模型并不理想，但本研究仍证明了PrAnCER能够准确检测运动功能的变化。未来，我们希望通过对其他疾病模型中运动行为变化的研究，进一步验证PrAnCER的适用性。

啮齿类动物常被用作研究多种疾病和损伤的模型，包括关节炎1、帕金森病（PD）2,3、神经肌肉疾病4,5、脑积水6以及脊髓损伤7。在这些疾病状态下，可通过研究动物的步态模式来评估疼痛、平衡和运动功能等症状。这些步态模式通过一组时空步态参数进行量化，这些参数可总结出足印的位置和时序，以及足部与地面接触的面积。
尽管步态分析的方法有多种，但现有系统仍存在若干缺陷。在传统的墨水纸张检测中，需先将动物的足爪涂上墨水，然后让其走过一张白纸（图1A）。由此获得的足印可用于测量步长和站立宽度，但无法评估速度或步态持续时间等关键的时间参数。基于视频的现代系统更为可靠，但除非使用合适的自动化系统，否则视频分析需要耗费大量人力进行逐帧评分8。目前市面上有许多商用自动化评分系统，但这些系统价格昂贵，难以普及。此外，这些系统依赖透明地板，或在某些情况下依赖跑台，而这两种设置均会改变动物的自然运动行为。已有研究表明，跑台可能掩盖某些疾病模型中的运动功能缺陷9，而透明地板（图1B）会导致小鼠在开放场的边缘区域停留更长时间，提示其焦虑水平升高10。理想的步态分析装置应不依赖上述任一条件，以在最小化动物应激的前提下，获得最自然的运动模式。
现有的开源和商业方案采用了多种方法，以克服在光照条件变化、动物体色差异以及足印形状多样的情况下，从动物身体中分离出足印的困难。一些方法通过使用在受压时会发光的表面来增强接触地面的足垫的对比度7,11,12，但这些装置成本高昂且技术上难以构建。其他系统则采用多角度成像，从而能够观察全身的协调运动8,13。尽管这些方法在测量步态以外的其他运动参数方面具有优势，但对于简单的步态分析而言，其结构过于复杂。此外，所有这些技术都依赖于透明的地面，而这会改变动物的自然行为。
PrAnCER 基于我们称之为“增强对比记录”（Contrast-Enhanced Recordings）的技术，该技术结合照明和半透明地面，以增强足印的检测效果。从下方观察时，这种方法可生成高对比度的图像（即足印），同时遮蔽未接触表面的物体（如动物身体）的视野（图 1D）。从上方观察时，地面则呈现为不透明。在我们的方法中，足部特征因此变得显著，使得新开发的自动化系统能够准确识别多种步态和运动特征。在本研究中，我们描述了实验装置、步态分析方案以及自动化评分系统 PrAnCER。该装置易于组装，PrAnCER 可用于评估多种疾病和损伤模型中的运动功能缺陷。
为了证明PrAnCER可用于检测异常步态模式，我们采用了氟哌啶醇诱导的帕金森病（PD）模型，这是一种用于短暂诱导运动功能改变的简单模型14。氟哌啶醇是一种多巴胺受体拮抗剂，广泛用作抗精神病药物1。它通过改变纹状体中的多巴胺信号传导来影响运动系统，而纹状体是基底神经节运动通路中的重要组成部分14。即使单次给予氟哌啶醇，也会迅速降低纹状体中的细胞外多巴胺水平，导致类似帕金森病的运动功能缺陷15。其行为学表现包括肌肉强直、运动不能以及僵住状态（catalepsy），后者定义为在被置于异常体位后无法恢复至正常姿势11,16。急性剂量的氟哌啶醇可引起运动功能障碍，这些障碍可在转棒实验（rotarod test）中被识别17。我们推测，氟哌啶醇介导的运动障碍也会在多种可通过自动化步态分析获取的特征中表现出来。
尽管不同研究中对氟哌啶醇的反应存在广泛差异，但氟哌啶醇的强直效应通常在剂量达到0.5 mg/kg及以上时出现，而在较低剂量（0.1 – 0.3 mg/kg）下即可检测到反应性降低和运动功能受损16,17。为了尽量避免氟哌啶醇引起的强直效应，我们决定测试两种剂量的氟哌啶醇：高剂量（0.30 mg/kg）和低剂量（0.15 mg/kg）。如表1所示，实验1考察了高剂量氟哌啶醇的作用，而实验2则测试了低剂量氟哌啶醇的影响。我们采用被试内设计，即每只大鼠均在高剂量、低剂量和对照（生理盐水）条件下进行测试，条件顺序在不同大鼠间进行平衡。我们预测，急性给予氟哌啶醇将导致步态障碍，类似于其他帕金森病（PD）模型中观察到的表现，例如速度降低、步幅缩短以及支撑相持续时间延长3,14,18,19。我们观察到，在两种剂量下给予氟哌啶醇后均出现了包括运动不能在内的行为改变。在低剂量条件下，大鼠的支撑相持续时间显著增加，后爪接触面积也增大，符合预期。这些步态变化类似于帕金森病患者常见的缓慢、拖步行走特征2,20。然而，在高剂量条件下，我们发现步幅长度和爪子接触面积均有所增加。尽管步幅延长出乎意料，但进一步查阅文献表明，这可能是氟哌啶醇诱发的“支撑-逃避”反应的一部分。我们得出结论：PrAnCER确实能够检测到与使用神经阻滞剂一致的、类似帕金森病的啮齿类动物步态改变。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;步态行走道装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; 透明聚甲基丙烯酸甲酯板</td><td>RISD 3D Store，普罗维登斯，RI</td><td></td><td>约 50 美元&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;1块裁剪至3½&quot; W × 36&quot; L；2块裁剪至4 1/2&quot; W × 36&quot; L &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 注：我们制作的跑道为36&quot; 基于我们实验室现有的亚克力板桌，该装置可轻松加长以满足需求。</td></tr><tr><td>1/4&quot; 透明聚甲基丙烯酸甲酯板</td><td>RISD 3D Store，普罗维登斯，RI</td><td></td><td>约 10 美元&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;4块，切成1&quot; W 乘以 4&quot; L &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 这些将用于固定隧道的位置</td></tr><tr><td>10 根 80/20 型材，1 根&quot; 1 × 1&quot; T型槽型材</td><td>80/20 公司</td><td>1010-S</td><td>约 16 美元&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;2块裁剪至36&quot; L&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>12V 柔性 LED 灯带，16.4 英尺 / 5 米 LED 灯条，日光白色</td><td>亚马逊</td><td></td><td>约 10 美元</td></tr><tr><td>Bostik Blu-Tack 粘合剂</td><td>亚马逊</td><td></td><td>约 8 美元</td></tr><tr><td>Clearprint 1000H 绘图用牛皮纸，16 磅棉纤维</td><td>Dick Blick 美术用品</td><td>11101-1046</td><td>约50美元&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;剪切至 4&quot; W × 36&quot; L &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 注意：这种特定的犊皮纸以卷状形式提供；我们将其保持在卷状，并裁剪至4&quot; W.&lt;br/&gt; 聚酯薄膜或磨砂有机玻璃也可替代牛皮纸，但需要调整相机软件的检测设置。</td></tr><tr><td>罗技 HD Pro 网络摄像头 C920，1080p</td><td>亚马逊</td><td></td><td>约 50 美元</td></tr><tr><td>移动式笔记本电脑桌推车，高度可调</td><td>亚马逊</td><td></td><td>约 40 美元&lt;br/&gt; 用于放置动物在跑道路程结束后居住笼具的小型桌台。</td></tr><tr><td>塑料斜坡</td><td>宠物仓库</td><td></td><td>约 6 美元&lt;br/&gt; 可选：用于辅助动物返回笼舍的斜坡</td></tr><tr><td>RetiCAM 台式三脚架，带三维平移/倾斜云台</td><td>亚马逊</td><td></td><td>约30美元</td></tr><tr><td>SCIGRIP #16 丙烯酸溶剂胶 - 透明，中等粘度</td><td>亚马逊</td><td></td><td>约 8 美元</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;有机玻璃桌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>约 价格：$</td></tr><tr><td>15 根 80/20 型材，1.5&quot; ×1.5&quot; T型槽型材</td><td>80/20 公司</td><td>1515</td><td>约 110 美元&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;6块裁剪至36&quot; L，裁剪成12段的2块&quot; 两端均采用标准的 5/16-18 螺纹攻丝 &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 亚克力桌面框架及桌腿</td></tr><tr><td>15系列三通 - 光导方角连接器</td><td>80/20 公司</td><td>14177</td><td>约 24 美元&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;4 个连接器 &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 连接桌面与桌腿</td></tr><tr><td>1/4&quot; 透明聚甲基丙烯酸甲酯板</td><td>RISD 3D Store，普罗维登斯，RI</td><td></td><td>约 50 美元&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;15处切割&quot; W × 39&quot; L&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5/16-18 x 1&quot; 内六角圆柱头螺钉</td><td>80/20 公司</td><td>3118</td><td>约 5 美元&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;数量 = 12&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>加长型调平脚，5/16-18 × 2&quot;</td><td>80/20 公司</td><td>2194</td><td>约 50 美元&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;数量 = 4 &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 用于桌腿</td></tr><tr><td>&amp;ldquo;T&amp;rdquo; 3/16 英寸内六角球头扳手&quot;</td><td>80/20 公司</td><td>6000</td><td>约 5 美元</td></tr></tbody></table>

基于对比增强记录的足印分析（prancer）：一种低成本、开放获取的自动化步态分析系统，用于评估运动功能障碍

Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings (PrAnCER): A Low-Cost, Open-Access Automated Gait Analysis System for Assessing Motor Deficits

步态分析被广泛用于量化多种啮齿类疾病模型中运动功能的变化。尽管在多个研究领域中评估步态和运动功能至关重要，但现有的商业解决方案存在若干局限性，例如成本高昂且缺乏开放、可访问的代码。为解决这些问题，我们开发了PrAnCER（增强对比记录的足印分析），用于步态参数的自动化定量分析。该方法通过使用半透明地板生成增强对比的录像，该地板可遮蔽未接触表面的物体，从而有效分离大鼠行走时的足印。利用此类视频，我们开发的简易软件程序能够可靠地测量多种时空步态参数。为验证PrAnCER能否准确检测运动功能的变化，我们采用了氟哌啶醇诱导的帕金森病（PD）模型。实验中对大鼠施以两种剂量的氟哌啶醇：高剂量（0.30 mg/kg）和低剂量（0.15 mg/kg）。在低剂量条件下，氟哌啶醇显著延长了站立时长并增加了后肢足印接触面积，这与PD模型的预期表现一致。在高剂量条件下，我们同样观察到接触面积增加，但同时还出现了步长意外增加的现象。通过进一步研究发现，这种步长的增加与高剂量氟哌啶醇常引发的“支撑-逃避”现象相符。因此，PrAnCER能够检测出啮齿类动物步态模式中预期之内和预期之外的变化。此外，我们还证实，与人工评分相比，PrAnCER在步态参数测量方面具有良好的一致性与准确性。

氟哌啶醇操作步骤
我们开发了该步态分析系统，用于比较对照组大鼠与预期表现出多种运动、步态及平衡功能障碍的实验组大鼠之间的步态参数。本研究采用被试内设计，每只大鼠均在生理盐水、高剂量氟哌啶醇和低剂量氟哌啶醇三种条件下进行测试。大鼠被分为两组（A组和B组），以实现交叉平衡；步态测试在一天中的不同时段和条件顺序上进行了交叉平衡。每次测试间隔为48小时。在腹腔（IP）注射生理盐水或氟哌啶醇前，大鼠先接受异氟烷轻度麻醉。注射后1小时进行步态测试，此时氟哌啶醇浓度应达到峰值15,16,17。
行为学结果
我们观察到经氟哌啶醇处理的动物表现出显著的行为变化。在高剂量条件下，8只大鼠中有5只在跑道起点出现一段时间的静止状态，在此期间它们对实验人员的触碰无反应，并且抗拒被移动。在某些情况下，这种状态持续数分钟，直到大鼠被移出跑道。在其他情况下，静止的大鼠会突然快速移动或“跳跃式”跑过跑道，然后在末端附近再次进入静止状态。在低剂量条件下，8只大鼠中有3只出现了类似的静止期。在此剂量下，仅观察到一次跳跃式行为。当动物接受生理盐水处理时，未观察到任何跳跃式行为。
我们分析了氟哌啶醇对以下步态参数的影响：支撑基底、步长、步速、站立时长、站立与摆动时相比值、最大接触面积以及肢体间距离。由于前肢和后肢的许多步态参数相同，且氟哌啶醇对所有肢体的影响通常具有一致性，因此我们仅计算后肢的参数，并未区分左肢和右肢的数据。对于每只大鼠，我们计算了每次测试日所有可用运行中各步态参数的平均值。所有参数（速度变异性除外）均以一次运行中前4个可用步态的平均值进行计算。为评估氟哌啶醇各剂量是否对步态产生显著影响，我们采用配对样本t检验。在实验1中，高剂量氟哌啶醇处理的动物表现出步长的显著增加（图6A；t(7) = -2.962，p = 0.021）和最大接触面积的显著增加（图6A；t(7) = -2.51，p = 0.04）。支撑基底、速度、站立时长及站立与摆动时相比值均无显著差异。在实验2中，接受低剂量氟哌啶醇处理的动物与生理盐水对照组相比，站立时长显著增加（图6B；t(7) = -2.444，p = 0.044）且最大接触面积显著增加（图6B；t(7) = -3.085，p = 0.018）。其他步态参数均无显著差异。此外，高剂量与低剂量氟哌啶醇处理条件之间在支撑基底（图6C；t(7) = 2.651，p = 0.033）、最大接触面积（图6C；t(7) = 4.635，p = 0.002）以及肢体间距离（图6C；t(7) = 3.098，p = 0.017）方面也存在显著差异。
自动系统中的位置准确性和误差
为评估 PrAnCER 的准确性，我们将其实验分析结果与另外一组6只对照大鼠中随机选取的21个视频的手动评分结果进行了比较。为进行手动评分，先将视频转换为一系列图像，再通过这些图像手动标记足迹位置。为提高效率，我们仅针对后肢足迹测得的空间数据进行分析。从每个视频中提取平均步长和支撑基底宽度（BOS），并与自动分析结果进行比较。结果显示，平均步长在手动评分与 PrAnCER 分析之间无显著差异（图7B；t(20) = -0.01，p = 0.99），但支撑基底宽度存在显著差异（图7A；t(20) = -2.21，p = 0.038）。尽管自动分析与手动评分总体相关性良好，但自动系统平均报告的 BOS 值高出5%。该差异可能源于质心选取方式的不同，而非检测错误所致。在手动评分中，足迹位置通过在每个后肢足迹基部周围绘制椭圆来标记，因为手动复制 PrAnCER 所采用的质心估算方法较为困难。总体趋势显示，PrAnCER 倾向于高估 BOS，这可能是因为某些动物的脚趾呈非对称性外展，导致 PrAnCER 检测到的质心位置比手动评分更为极端。其他系统也报告了在步长测量一致的情况下，手动与自动评分之间的 BOS 存在显著差异17。考虑到观察到的差异较小，且与其他系统的结果具有一致性，我们认为 PrAnCER 是一种可靠的步态参数测量方法。
需要注意的是，所有准确性分析均在使用 PrAnCER 的图形用户界面（GUI）对自动化输出结果进行人工校正后进行。与现有的商业系统一样，此步骤对于纠正评分错误以及剔除不符合标准的数据片段均属必要22。我们将 PrAnCER 的参数设置为倾向于产生假阳性错误，因为这类错误在事后更易于修正。在人工校正超过五百个视频的过程中，我们从未观察到 PrAnCER 漏检真实足迹的情况。然而，其他类型的错误确实存在，主要包括三类：错误检测（将非足迹误判为足迹）、分类错误（将足迹错误标记为前足/后足或左足/右足）以及错误合并（将两个足迹错误地合并为一个）。这些错误均可通过配套的图形用户界面轻松修正，且在正常拍摄条件下，仅在极小比例的视频中出现。即便考虑此类修正，PrAnCER 仍显著减少了步态分析所需的人工工作量。我们估计，每个视频运行 PrAnCER 并校正输出错误（如有必要）约需 3 分钟，而完全手动评分和分析相同视频则需要近 10 分钟。
<img alt="动物运动分析；脚印追踪；延时序列；行为研究；研究成果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59596/59596fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1. 步态分析方法的比较。（A） 传统的墨水与纸张方法产生的脚印形状和位置不够精确。（B） 使用透明地板进行视频记录可提供详细的脚印图像，但大鼠身体的显著特征较多，使自动化评分变得复杂。（C） 在透明地板上覆盖轻质纸张会生成噪声较多的图像，并丢失细节。（D） 使用牛皮纸构建半透明地板可产生高度清晰的脚印图像，同时在视觉上消除身体干扰。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59596/59596fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="动物行为追踪装置示意图，包含跑道和摄像头；啮齿类动物路径检测结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59596/59596fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 步态行走装置与视频记录的示意图。 (A) 大鼠穿过一条透明的跑道，跑道底部为半透明材质，通向作为目标箱的家园笼，同时由下方的摄像头进行记录。在此情况下，描图纸覆盖在透明地板上以使其变为半透明。LED灯带沿跑道长度方向安装，位置介于动物足部与身体之间，用于照亮跑道。 (B) 视频记录的截图，展示了半透明地板的效果。两只足垫清晰可见，但大鼠的身体基本无法被检测到。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59596/59596fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图像处理流程：示意图展示背景减除、边缘检测和轮廓形成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59596/59596fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 足印单帧图像的检测过程。（A） 原始图像经过去噪处理后进行背景减除 （B）。（C） 应用边缘检测算法，并将结果转换为一系列称为轮廓的 X、Y 坐标 （D）。（E） 根据邻近性对轮廓进行分组，并取该组的凸包（边界框），生成一个包含整个足印的单一轮廓。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59596/59596fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="晶体生长示意图；形态变化分析；光子学研究方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59596/59596fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4. 将单个检测结果转化为分类足迹图。（A）首先在一组帧中识别出足迹。（B）每个独立的对象检测被赋予一个编号，用以标识其为一次足迹，代表单个脚掌的一次着地（C）。（D）最后，根据其相对于动物行进路径中线的位置将其分类为左或右，并根据其相对于先前足迹的位置将其分类为前肢或后肢。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59596/59596fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示步态分析中步幅、支撑相、摆动相及 limbs 间距离的示意图，路径以不同颜色标示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59596/59596fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5. 所分析步态参数的示意图。 (A) 一个输出示例，显示了足印的识别与定位结果。原始检测到的边缘以黑色显示，最终检测到的足部位置及其近似区域以不同颜色标示，用以区分足部分类。本图中，黄色代表前左足，绿色代表后左足，青色代表前右足，洋红色代表后右足。然而，用户可根据偏好在 Python 脚本中更改颜色。 (B) 一幅图表，展示两个主要的时间参数：每只足与地面接触的时间（支撑相）以及处于空中的时间（摆动相）。彩色块表示支撑相，白色区域表示摆动相。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59596/59596fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="步态指标（如步长和接触面积）的柱状图比较；统计分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59596/59596fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 氟哌啶醇对步态的影响。（A）实验1的结果：与生理盐水组（Sal）相比，高剂量氟哌啶醇（HalH）显著增加了步长和最大接触面积。（B）实验2中观察到更典型的帕金森样症状；低剂量氟哌啶醇（HalL）显著延长了站立时相持续时间并增加了最大接触面积。（C）比较两个实验中的氟哌啶醇处理组发现，与低剂量组相比，高剂量氟哌啶醇增加了支撑基底宽度、最大接触面积和肢体间距离。数据表示为均值 ± 标准误（SEM），n = 8。配对样本t检验差异如下：# p &lt; 0.05，## p &lt; 0.01。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59596/59596fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较手动评分与PrANCER在BOS和步长测量上的柱状图；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59596/59596fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 自动分析的准确性。（A） 在测量步宽（BOS）时，自动系统与手动评分存在显著差异，但该差异可能源于手动选择质心时的变异，而非检测错误。（B） 在步长测量方面，自动系统与手动评分之间无显著差异。这些准确性结果与其他现有系统的结果一致。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示，n = 21。配对样本t检验差异如下：# p &lt; 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59596/59596fig7v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="步态分析时序图，显示研究中肢体运动随时间的变化序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59596/59596fig8v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8. 时间参数的比较 经生理盐水处理动物的步态时相模式 （A） 低剂量氟哌啶醇 （B）。（C） 高剂量氟哌啶醇处理大鼠的僵直-逃避反应示意图。如图所示 图5，彩色块表示爪子接触地面的时间（支撑相），白色区域表示爪子在空中的时间（摆动相）。缩写： 荧光， 左前 HL, 左后肢 FR, 右前 HR, 右后方 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59596/59596fig8v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">实验 1</td>
			<td colspan="4">实验 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>测试 1</td>
			<td>测试 2</td>
			<td>测试 3</td>
			<td>测试 4</td>
			<td>测试 5</td>
			<td>测试 6</td>
			<td>测试 7</td>
			<td>测试 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组 A</td>
			<td>HalH</td>
			<td>Sal</td>
			<td>HalH</td>
			<td>Sal</td>
			<td>Sal</td>
			<td>HalL</td>
			<td>Sal</td>
			<td>HalL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组 B</td>
			<td>Sal</td>
			<td>HalH</td>
			<td>Sal</td>
			<td>HalH</td>
			<td>HalL</td>
			<td>Sal</td>
			<td>HalL</td>
			<td>Sal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 实验设计。 本表展示了本研究中采用的实验设计。我们采用被试内设计，每只大鼠均接受高剂量氟哌啶醇（HalH）、低剂量氟哌啶醇（HalL）和生理盐水（Sal）三种条件的测试。大鼠被分为两组；测试的时间段和条件顺序进行了交叉平衡。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>定义</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步长</td>
			<td>同一爪子连续两次接触地面之间的距离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>跨步长度</td>
			<td>沿运动方向轴线上，对侧前爪或后爪连续两次接触地面之间的距离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>支撑基底宽度（BOS）</td>
			<td>垂直于运动方向轴线上，对侧前爪或后爪连续两次接触地面之间的距离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最大接触面积</td>
			<td>后爪印迹检测到的最大面积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>同侧肢体间距</td>
			<td>同侧前爪与后爪之间的距离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>支撑时相持续时间</td>
			<td>爪子与地面接触的持续时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>摆动时相持续时间</td>
			<td>爪子未接触地面的持续时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>支撑-摆动时相比（SSR）</td>
			<td>支撑持续时间 / 摆动持续时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>离散速度</td>
			<td>单个爪子的步长 /（支撑持续时间 + 摆动持续时间）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均速度</td>
			<td>分析时间段内所有离散速度的平均值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>速度变异性</td>
			<td>一次运行过程中离散速度的变化百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>运行速度</td>
			<td>通过隧道所需时间 / 隧道长度</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 步态参数说明。 本表描述了最常用的步态参数；本研究中使用的参数以粗体标出。

我们介绍一种新型步态分析系统——增强对比录像的足印分析（Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings，PrAnCER），该系统是一种开放获取的自动化系统，通过创新的半透明地板自动量化大鼠的步态特征。本系统已利用氟哌啶醇帕金森病模型进行了验证。

基于对比增强记录的足印分析（PrAnCER）：一种低成本、开放获取的自动化步态分析系统，用于评估运动功能障碍

步态分析被用于量化多种啮齿类疾病模型中运动功能的变化。尽管评估步态和运动功能具有重要意义……

我们介绍一种新型步态分析系统，该系统操作简便、价格实惠，且可作为商用步态分析系统的准确替代方案。在适当光照条件下使用半透明地面，可产生高对比度的足印，同时遮蔽动物身体。本系统可用于评估多种损伤和疾病模型中的运动功能，例如脊髓或神经损伤、神经退行性疾病以及神经肌肉疾病。我们的步态装置和自动化程序 PrAnCER 均可轻松调整，以适应不同的实验设置或动物模型。要搭建步态分析跑道，请将一个透明的聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）封闭式跑道放置在透明的聚甲基丙烯酸甲酯地板上，并用一张与跑道宽度相同的 16 磅绘图纸覆盖地板表面。然后，在跑道正下方安装一台帧率至少为每秒 30 帧的摄像机，用于捕捉跑道中段的图像；同时，在距离跑道地板约两英寸远、一英寸高的位置固定一条 12 伏、每英尺含 18 个发光二极管的灯带，以消除跑道上的阴影。为了使动物适应步态走道，将大鼠的饲养笼置于步态走道末端的同一水平面上，作为目标箱，并让大鼠从手中沿走道行走至饲养笼。大鼠在跳入饲养笼前，通常会在走道末端停下并环顾四周。如果大鼠超过一分钟仍未离开走道，可用轻柔推动的方式鼓励其进入饲养笼。如果大鼠转身，可用一小块有机玻璃挡住跑道的起始端。当大鼠能够以稳定的速度从容通过跑道而不出现僵直时，调整网络摄像头软件的设置，以获得最清晰的足印图像，并分别记录每一次运行过程，对各次运行进行适当标注，以便后续使用自动化分析程序。在确认羊皮纸表面无任何污点或碎屑后，于大鼠进入跑道前数秒开始录制，待大鼠离开跑道并进入居住笼后停止录制。为准确反映动物的运动功能，必须确保所录制的视频至少包含四个连续且无停顿或加速的步态周期。每次实验后，需用乙醇擦拭步道，并根据需要更换牛皮纸。进行步态记录分析时，将所有待分析的视频放入同一个文件夹中，然后运行用于分析对比度增强录像的爪印分析 Python 脚本（PrAnCER）。在弹出菜单中，单击“选择文件夹”以选定视频所在的文件夹，并根据需要选择适当的自定义分析选项。完成后单击“继续”。要在步道图像上定义感兴趣区域，使用鼠标左键单击以确定上边缘，右键单击以确定下边缘。如果出现的对话框正确无误，请按 N 键继续。程序将自动运行。PrAnCER 完成后，在终端中按回车键以终止程序。然后，通过运行 Python 脚本 Gait Editor 图形用户界面，手动审查 PrAnCER 输出的图像，并为每个视频选择相应的 MP4 文件。根据需要校正任何误识别或合并的足迹。为提取空间和时间步态参数，运行 Python 脚本 Parameter Analyzer，选择要分析的后肢足迹数量以及要分析的视频文件夹。然后，单击继续，为每个视频输出一个包含多个常见步态参数的 csv 文件。尽管与手动评分不完全相同，PrAnCER 具有高准确性，可生成可靠的步态测量结果。此处展示了对照组视频的结果，以供比较。PrAnCER 对步长的分析结果与手动评分相比无显著差异，但在支撑基底的测量中观察到显著差异。这可能是由于中心点选择的差异所致，而非检测错误。在高剂量氟哌啶醇处理的动物中，观察到步长和最大接触面积显著增加。接受低剂量氟哌啶醇的动物也表现出站立时长和最大接触面积的显著增加。此外，在支撑基底、最大接触面积和肢体间距离等步态参数方面，高剂量与低剂量氟哌啶醇处理条件之间存在显著差异。尽管PrAnCER已能分析许多常见的时空步态参数，但其代码可被修改以评估用户所需的任何其他步态特征。我们希望我们的系统能够使步态分析对研究人员更加便捷，为那些希望以简单且经济的方式测量运动功能的研究者提供支持。

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对比度增强记录 (PrAnCER) 的爪打印分析:用于评估电机缺陷的低成本、开放访问自动步态分析系统

在本视频中，我们介绍了用于评估小鼠步态和运动协调能力的足迹测试方法及相关分析流程。...

通过足迹分析评估步态：一种检测小鼠运动协调能力的方法

在神经病理性动物模型中精确评估疼痛反应对于研究疼痛性疾病的病理生理机制以及开发新型镇痛药物至关重要。本文介绍一种利用自动化步态分析系统客观、灵敏地测定啮齿类动物后肢足底感觉功能的方法。...

慢性缩窄性损伤小鼠的自动化步态分析

本研究中，我们展示了基于腹侧平面成像的运动学步态分析方法，用于监测小鼠模型（例如，内吞蛋白突变小鼠品系）随年龄增长出现的运动协调细微变化以及神经退行性病变的进展。...

神经退行性小鼠模型中年龄依赖性运动障碍的步态分析

本文介绍了一种用于临床前研究的啮齿类动物四足运动三维运动学数据采集与分析方案。...

用于啮齿类动物临床前研究的三维运动学步态分析

足迹分析是一种低成本的替代方法，可用于研究人员量化小鼠运动异常，替代数字化步态分析程序。由于其速度快、操作简单且具有纵向研究潜力，该方法非常适合小鼠模型的行为表型分析。...

低成本步态分析用于神经肌肉疾病小鼠模型的行为表型鉴定

自动步态分析是评估周围神经损伤和脊髓挫伤动物模型功能恢复的可行工具。尽管只需一次设置即可评估多种实验模型的运动功能，但对动物进行精细的硬件和软件调整及训练至关重要。...

用于评估外周神经或脊髓挫伤损伤啮齿类动物功能恢复的自动化步态分析

本文介绍了RatWalker系统，该系统通过重新设计MouseWalker装置，以适应大鼠更大的体型和体重。该系统采用全内反射失配（FTIR）技术、高速视频采集以及开源分析软件，用于追踪并量化步态参数。...

应用 RatWalker 系统对帕金森病遗传性大鼠模型进行步态分析

我们提供了一种通过行为测试组合对大鼠坐骨神经 crush...

大鼠单侧坐骨神经 crush 损伤后运动行为的多因素评估

提供了一种利用 MouseWalker（MW）工具箱对自由行走小鼠的运动模式进行定量描述的实验流程，该流程涵盖从初始视频录制和追踪到后期定量分析的各个环节。采用小鼠脊髓挫伤模型以展示 MW...

利用MouseWalker量化脊髓损伤小鼠模型中的运动功能障碍

本方案建立了一种利用无标记跑台实验结合深度学习驱动的多关节轨迹自动标注技术的大鼠后肢运动学评估流程，可实现可重复的运动量化分析。...

基于深度学习的多关节同步追踪用于大鼠后肢运动学的客观量化

我们介绍一种基于DeepLabCut的低成本、无标记物工作流程，用于量化自由活动小鼠的自发步态和运动行为。该方案结合单摄像头视频采集、解剖学标志点的无标记追踪以及时空运动参数的提取，提供了一种无需特殊设备的非侵入性且易于实施的运动行为分析框架。...

一种基于低成本无标记DeepLabCut的小鼠自由运动自发步态与运动分析工作流程

了解PrAnCER步态分析系统，利用半透明地板和对比度增强技术自动量化大鼠步态特征。该系统成本低、易于设置，可准确评估帕金森病等多种损伤和疾病模型中的运动功能，为神经科学研究提供可靠工具。

基于对比增强记录的足印分析（PrAnCER）：一种低成本、开放获取的自动化步态分析系统，用于评估运动功能障碍

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