Name: 活鼠中多萨尔希波坎卡尔CA1的纵向双光成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学习活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像技术，用于研究记忆形成与神经可塑性机制。该方法可在数周内以微米级分辨率追踪神经元结构变化，为神经科学研究提供重要工具。

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U. A. F. 得到 Schram 基金会的支持；C.-W. T. P. 和 W. G. 得到马克斯·普朗克学会的支持；L.Y. 和 R.Y. 得到马克斯·普朗克学会和美国国立卫生研究院（R01MH080047，1DP1NS096787）的支持；A. C. 得到欧洲研究理事会第七框架计划（FP7）资助、ERANET 和 I-CORE 项目、以色列卫生部首席科学家办公室、德国联邦教育与研究部、Roberto 与 Renata Ruhman、Bruno 与 Simone Lich、Nella 与 Leon Benoziyo 神经疾病研究中心、Henry Chanoch Krenter 生物医学成像与基因组学研究所、以色列科学基金会、Perlman 家族、Adelis 基金会、Marc Besen 基金会、Pratt 基金会以及 Irving I. Moskowitz 基金会的支持；A. A. 得到马克斯·普朗克学会、Schram 基金会和德国研究基金会（DFG）的支持。3P 图像数据是在马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所举办的“神经成像技术高级课程”期间采集的。“神经成像技术高级课程”由马克斯·普朗克学会、佛罗里达州马克斯·普朗克科学奖学金项目以及马克斯·普朗克佛罗里达研究所合作项目资助。我们感谢 Thorlabs、Coherent 和 SpectraPhysics 在课程期间为 2P / 3P 成像系统提供的支持与设备。我们还感谢 Henry Haeberle 和 Melissa Eberle 在课程期间对系统的协助。

所述所有方法均已获得上巴伐利亚政府（许可证号 2016_ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-16-48）以及斯坦福大学和马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所实验室动物护理管理委员会的批准。
1. 成像套管的制备
<ol>
	<li>将精密钻孔机固定在配备可移动标尺台的钻孔架上。</li>
	<li>将一个直径为3.0 mm的不锈钢管夹紧在可移动的标尺平台上。</li>
	<li>将管子切割成一段长度为1.6 mm的金属环。若切割后环的边缘不光滑，需用锉刀将不平整处修整平滑。</li>
	<li>用100%丙酮冲洗金属环和直径为4 mm的圆形玻璃盖玻片，并晾干 &#8776;5 分钟</li>
	<li>将金属环和玻璃盖玻片置于体视显微镜下平整、均匀且洁净的工作面上。</li>
	<li>在光滑表面（如培养皿）上滴一滴紫外光固化光学胶。使用针头或刮刀将胶体铺展成一层薄（&#60;0.5 mm）层。</li>
	<li>使用镊子将金属环的一侧浸入粘合剂中。注意不要将环的内部密封。如果发生内部密封，需用针头将环内的光学粘合剂划破。</li>
	<li>使用立体显微镜，将金属环置于玻璃盖玻片中央，使金属环上涂有黏合剂的一侧接触盖玻片。金属环与盖玻片交界处应形成一圈均匀的薄层黏合剂。避免黏合剂扩散至盖玻片中心区域。</li>
	<li>打开紫外固化LED驱动装置，照射365 nm光线持续1分钟。 
	警告：紫外线可引起皮肤灼伤，且具有致突变性。操作时应佩戴防紫外线护目镜，并穿戴手套和实验服以遮盖双手及手臂，避免皮肤暴露。</li>
	<li>为使胶水均匀固化，请通过改变光源方向，确保环的各个侧面均被均匀照射。</li>
	<li>让粘合剂至少固化 2 小时，最好过夜。</li>
	<li>用止血钳夹住套管开放端的金属环部分。在体视显微镜下，使用装有旋转锉刀的牙科钻，将多余的玻璃盖玻片锉平，使其与金属环侧面齐平（图 1A).</li>
</ol>
2. 在背侧海马上方植入成像套管
<ol>
	<li>设备准备与装置搭建
	<ol>
		<li>确保所有外科手术器械清洁且无菌。若使用玻璃珠灭菌器进行灭菌，请先清洁器械，然后将其放入灭菌器中（温度设定为 250 &#730;C) 10分钟，使用前完成。或者，在使用前对器械进行高压灭菌。</li>
		<li>准备好手术所需的所有材料及手术器械，以便能够方便取用。</li>
		<li>确保备有足够的 freshly prepared 药物，例如镇痛药或抗炎药。</li>
		<li>确保手术全程（约1小时）有足够的异氟烷供应 每 手术）</li>
		<li>打开加热垫并将其设置为37 &#730;C 以在麻醉期间保持动物体温稳定。</li>
		<li>确保异氟烷清除系统正常工作。</li>
		<li>打开氧气流量阀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉诱导与动物固定
	<ol>
		<li>将小鼠放入麻醉诱导舱中，以1 L/min的流速通入3%异氟烷2 并等待其失去意识。通过脚趾夹捏反射测试评估麻醉状态。</li>
		<li>称量动物体重。</li>
		<li>皮下注射抗炎药（美洛昔康，1 mg/kg）和镇痛药（Vetalgin，200 mg/kg）。</li>
		<li>将小鼠放置在加热垫上。确保动物不与加热垫直接接触，以避免热灼伤。</li>
		<li>将头部固定于立体定位装置上，并调整鼻罩覆盖鼻部。为维持麻醉状态，将异氟烷浓度降至1.5–2%。手术过程中，通过观察呼吸频率及检测脚趾夹捏反射来监测小鼠状态，必要时调节异氟烷浓度。</li>
		<li>在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止脱水和可能的失明。 
		注意：麻醉和动物用药可采用其他方法和药物。请参考您的动物使用许可及相关文献。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光学套管植入
	<ol>
		<li>打开光纤光源。</li>
		<li>去除小鼠头部的毛发，并对皮肤进行消毒。</li>
		<li>使用剪刀和镊子去除小鼠的头皮。首先在接近λ点的位置做一小切口，然后向两侧打开头皮。先向耳侧方向横向切开，再向头侧方向切开，直至眼眶方向，形成一个位于矢状轴上、约在前囟前方4 mm处的三角形切口。注意不要过于靠近耳朵和眼睛，但需暴露前囟、λ点、顶骨以及额骨的后半部分。</li>
		<li>滴加一滴（&#8776;10 mg 的利多卡因（酒精中体积分数为 28.9%）涂抹于颅骨。</li>
		<li>用棉签清除颅骨上的骨膜并擦干。</li>
		<li>放置耳杆以固定小鼠头部。</li>
		<li>使用宽度为0.5 mm的钻头微型钻头在额骨上制作一个小颅骨开窗，位置位于待成像海马对侧，距矢状缝约1.5 mm，距冠状缝2 mm。</li>
		<li>将一枚宽0.86 mm的不锈钢颅骨螺钉旋入颅骨孔中。</li>
		<li>如有必要，清理碎屑并干燥颅骨。</li>
		<li>快速粘合剂混合物的制备
		<ol>
			<li>使用一把小勺子（&#8776; 4.5 mm 直径），向混合孔中加入 1–1.5 平勺 L-粉末。</li>
			<li>将 3-4 滴 Quick Base 加入孔中。</li>
			<li>将1滴通用催化剂加入孔中。</li>
			<li>使用精密移液器搅拌混合物 5-10 秒。 
			注：可使用其他替代性粘合剂。请参考其生产商的使用说明。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用精密涂抹工具将速干粘合剂涂抹于颅骨、螺钉及周围皮肤，静置 30 秒至 1 分钟使其干燥。</li>
		<li>使用直径为3.0 mm的环钻在顶骨上钻取颅骨窗。将孔位定位在距离矢状缝约1.5 mm、距离人字缝约2 mm处。</li>
		<li>小心移除骨瓣。</li>
		<li>使用套管检查颅骨开窗的大小，确保其适配。如有必要，使用0.5 mm或0.9 mm宽度的微型钻头扩大颅骨开窗。</li>
		<li>使用Dumont镊子去除脑膜。</li>
		<li>消融皮层组织以暴露外囊。使用连接真空泵的0.9 mm直径（19号）钝头针。用生理盐水灌注，以防止暴露组织脱水，并在止血后冲洗残留血液。缓慢吸除皮层组织， &#8776;50-100 &#181;m 为单位逐步操作，直至皮层与囊膜分离，暴露出纤维束 胼胝体束 或用于 胼胝体频繁更换针头，以防止堵塞。</li>
		<li>纤维主要沿三个方向延伸（图1B）。小心剥离背侧纤维，直至最深层的纤维（白质层 海马体部分暴露。</li>
		<li>用生理盐水冲洗组织。用细镊子夹住底端套管浸入生理盐水，并将其置于颅骨孔上方。套管与组织之间必须用生理盐水密封，以避免在套管与组织之间滞留气泡。</li>
		<li>将套管推入颅骨（图1C)直至玻璃盖玻片与纤维接触。</li>
		<li>使用吸水纸、棉签和/或真空泵将颅骨充分干燥。</li>
		<li>快速粘合剂混合物的制备 （参见步骤 2.3.10）</li>
		<li>使用精密施胶器将速干粘合剂涂抹于颅骨表面，同时将粘合剂涂抹在套管边缘。注意避免粘合剂流入套管内部。静置干燥30秒至1分钟。</li>
		<li>使用立体定位臂将头固定板置于套管上方，并与颅骨接触。</li>
		<li>牙科丙烯酸酯混合物的制备
		<ol>
			<li>使用勺子（&#8776;9 mm 直径），将 1 平勺（1 份）粉末加入混合孔中。</li>
			<li>在同一个孔中加入2-3份液体，确保完全覆盖全部粉末。</li>
			<li>搅拌 &#8776;使用刮勺操作1分钟。 
			注意：可使用其他类型的丙烯酸材料。请参考其制造商的使用说明。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用刮刀或精密涂敷器将牙科丙烯酸树脂涂抹于颅骨表面。将暴露的颅骨、螺钉及开放的皮肤区域完全覆盖，以增强制备的稳定性。注意避免丙烯酸树脂流至颈部、耳朵和眼睛周围。</li>
		<li>让丙烯酸干燥并硬化约15分钟。</li>
		<li>在头固定板上贴一层可移除的粘性薄膜，以防止碎屑进入套管。建议薄膜尺寸与板的尺寸相匹配。</li>
		<li>关闭异氟烷气流，将动物从立体定位仪中取出，并置于加热板上以维持生理体温，直至其从麻醉状态中苏醒。</li>
		<li>持续监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。</li>
		<li>仅在动物完全恢复后，将其放回与其他动物同处的环境中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>手术后连续2天监测小鼠的体重和整体行为，以评估其健康状况。</li>
	<li>手术后连续2天皮下注射抗炎药物（美洛昔康，1mg/kg）和镇痛药物（Vetalgin，200mg/kg）。 
	注意：术后护理可采用其他监测方法、药物及剂量。请参考您的动物使用许可证及相关文献。</li>
</ol>
4. 成像实验的准备
<ol>
	<li>提前开启成像设备，必要时让激光器预热并稳定。</li>
	<li>对小鼠进行麻醉（参见步骤 2.2.1）。</li>
	<li>使用镊子小心地从头固定板上移除粘性薄膜。一手握住小鼠，另一手用手指固定头固定板。轻柔地移除薄膜，避免损伤制备部位。</li>
	<li>将小鼠置于显微镜下，放置在加热垫上，并将头固定板固定到支架上（图 1D）。</li>
	<li>调整鼻罩位置以覆盖口鼻部，并将异氟烷浓度降低至 1.5–2%。</li>
	<li>在小鼠眼睛上涂抹眼膏。</li>
	<li>用去离子水冲洗成像套管以清洁。使用注射器和细针向套管内滴加水，并用真空泵吸出。</li>
</ol>
5. 成像实验
<ol>
	<li>使用低倍率、长工作距离的物镜，目视检查套管是否存在残留水分、污物、完整性以及荧光情况。</li>
	<li>通过调节头部固定装置臂的角度，将套管与光轴对齐。</li>
	<li>切换至25倍、数值孔径1.0、工作距离4 mm，或40倍、数值孔径0.8、工作距离3 mm的水浸物镜。加入足够的去离子水以充满套管，并在套管顶部保持过量的水。避免产生气泡。</li>
	<li>使用双光子激发并采集荧光信号。 
	注意：成像方案高度依赖于所需观测的时间和空间尺度。有关本文所示图像所采用的成像参数详情，请参见结果与讨论部分的代表性示例。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种在活体小鼠背侧 CA1 区进行重复双光子（2P）成像的操作流程。手术后，小鼠通常在 2 天内恢复。该操作仅引起轻微的星形胶质细胞增生26,43。手术后可能出现的出血和水肿通常在 10 至 14 天内被重新吸收。一般而言，自植入后第 14 天起，制备区域已足够清晰，可进行活体成像。手术成功与否并不依赖于无菌环境的操作，但保持高度的卫生条件至关重要，以避免手术相关感染引起的并发症。这可通过在手术前后仔细清洁手术器械，并在每次使用前立即进行高温灭菌来实现（步骤 2.1.1）。光学套管在植入前应保存于洁净且已灭菌的容器中，并用无菌生理盐水冲洗。执行常规的外科操作规范，如手部消毒和手术台清洁，也同样非常重要。该制备方法具有良好的稳定性，可在数周内实现细胞级和亚细胞级分辨率的成像26,35。
关键步骤、改进方法与故障排除。
必须剥离外囊直至最深层的纤维暴露出来。如果未能暴露alveus，在使用工作距离为3或4毫米的商用物镜时，可能无法聚焦到锥体神经元（PNs）的胞体，或导致树突棘成像分辨率降低。为此，可先用直径0.9毫米的针头非常缓慢地消融新皮层，然后改用直径0.3–0.5毫米（24–29号）的针头，以便在去除最背侧纤维时更精确地控制吸力。或者，在纤维暴露后也可使用精细镊子去除残留的皮层组织36。
手术过程中出血可能会造成困扰，因为血液会阻碍视野。建议等待血凝块形成后，用生理盐水冲洗以清除残留血液。必要时可重复操作。
套管与颅骨开孔之间的紧密贴合有助于提高制备的稳定性，尤其是在施加水泥之前固定套管位置，特别是当套管的外缘与颅骨表面齐平时。由于环钻和套管的尺寸是匹配的，若套管侧面存在不规则情况，则可能导致贴合松动，需要稍大的颅骨开孔才能适配（见步骤2.3.14），或者不规则的颅骨开孔也会导致此问题。任何套管表面的不规则部分必须通过锉削去除（步骤1.3和1.12），并且在完成颅骨开孔前，必须保持环钻垂直于颅骨表面（步骤2.3.12）。在颅骨开孔完成前过早将环钻从颅骨上移除，可能导致颅骨开孔不规则。
局限性——制备方法的侵入性与稳定性。
评估皮层切除的影响较为困难，因为难以精确界定直接受影响和间接受影响的脑区。通常，手术会切除部分顶叶皮层以及部分视觉和后肢感觉皮层21。被切除的皮层并不直接投射至海马体，且海马组织本身未被接触或损伤。重要的是，已有研究表明，植入成像套管不会显著改变海马功能，特别是依赖海马的学习能力21,36,37,38,39。尽管如此，通过检测皮质酮血液水平和肾上腺重量，并与未植入的对照小鼠进行比较，来量化套管以及植入物外部结构（头固定板和牙科丙烯酸帽）在多大程度上构成慢性应激源，仍具有重要意义。
该制备通常可保持数周至数月的稳定性26。长期来看，皮肤和骨骼的生长倾向于使丙烯酸树脂帽发生位移，从而增加成像制备的不稳定性。
光学限制。
传统的双光子显微镜可对新皮层组织进行约1毫米深度的成像40,41。与此一致，可通过该技术对位于SR（图&#160;2D-F）或SLM36的树突及树突棘进行成像。然而，通过套管成像会限制有效数值孔径（NA）。为达到最高分辨率，成像套管的直径和深度应与成像NA相匹配，因为较小的直径和较长的深度会截断高NA物镜的光线。例如，使用1.0 NA的水浸物镜并通过1.6 mm长的套管成像时，需要3.65 mm的内径以保持完整的NA。然而，使用此直径的套管会增加对海马体的压迫，可能影响组织健康；因此，我们采用较小直径的套管。当使用0.8 NA的水浸物镜并通过1.6 mm长的套管成像时，2.5 mm的内径即可维持完整的NA。然而，0.8 NA的水浸物镜工作距离（WD）较短（本例中为3 mm），可能导致无法聚焦至SP层。
这些计算适用于导管底部视场中心的位置。然而，若将成像视场横向移动至导管边缘附近，或在组织中更深的层面（即远离导管玻璃表面）进行聚焦，则会进一步降低焦平面上的有效数值孔径（NA），从而降低分辨率。这将导致所成像组织不同区域的分辨率不均一，对于亚细胞分辨率下的定量成像尤其值得关注，特别是在使用2P-STED显微镜等超分辨率技术时42。而在细胞分辨率下成像时，这些问题的影响较小。
组织运动。
组织内的运动——源于麻醉动物的呼吸和心跳——随着与成像套管距离的增加而趋于加剧。这可能是因为成像套管对脑组织施加了机械压力，从而在套管附近区域抵消了部分运动（类似于新皮层制备）。因此，尽管在SR和SLM区域可以实现树突棘的成像，但在我们的实验中，最稳定的成像区域位于SO层背侧直至 &#8776;200 &#181;从套管表面起 m。为补偿运动，我们使用共振扫描仪和离线平均。采集多幅图像（重复 4 至 6 次） 每 z堆栈在最高速度（30帧/秒）下获取的图像平面。每个z平面的所有重复图像随后通过商业软件AutoQuant进行反卷积处理，使用ImageJ进行图像配准，并平均合并为单幅图像26. 对于细胞体的成像，在麻醉状态下运动通常可以忽略不计35 两次平均通常足以补偿运动伪影。
该方法的未来应用或发展方向。
该制备方法可与微内窥镜联合使用26,43微内窥镜是一种刚性光学探针，利用梯度折射率（GRIN）微透镜将光引导至深层组织并从其中返回18使用微内窥镜可采用更小直径的套管，甚至完全无需套管。然而，商用微内窥镜在光学像差校正方面较差，且数值孔径（NA）低于商用物镜。目前的探头可达到的横向和轴向分辨率分别为 &#8776;0.6-1 &#181;米 &#8776;10-12 &#181;m，分别17,18,44使用微内窥镜还可将该制备方法与头戴式集成广视野显微镜相结合45,46,47.
该方法也可用于非麻醉小鼠，并已被用于在清醒且头部固定的动物中利用 Ca2+ 传感器研究细胞活动21,37,48,49。在这些情况下，由于荧光变化的时间尺度较快，建议采用线注册技术50。此外，也可调整该制备方法以实现对海马其他亚区（如齿状回（DG））的成像39,51,52。将该制备方法与3P激发53,54相结合，使用调谐至1400 nm、重复频率为1 MHz的脉冲激光，我们能够更深入地对海马结构进行成像，到达齿状回的分子层、颗粒细胞层以及hilus区域（图4），而无需移除上方的CA1区。
综上所述，我们介绍了一种可实现对背侧海马光学通路访问的方法，能够对海马结构与活动的动力学特征进行长期且相关的研究。该技术拓展了在生理和病理条件下对海马功能分析的可能性。

在哺乳动物中，海马体是编码和回忆情景记忆以及进行空间导航的关键脑区1,2,3,4。正因如此，海马体长期以来一直是研究大脑如何编码和回忆记忆5,6,7，或在环境中导航8,9以获取奖励并规避危险的基本机制的重要模型。此外，海马结构是成年啮齿类动物一生中持续生成新神经元的脑区之一10,11，在人类中也可能存在类似现象12,13。最后，海马结构的退化或功能受损与多种神经和精神疾病相关，包括阿尔茨海默病14。
在小鼠中，海马体位于大脑表面下方约 1 mm 处15。这一位置使得在完整脑组织中难以进行光学观察，因此对海马体动态的纵向研究主要依赖于磁共振（MR）成像、电生理学以及离体成像分析。MR 成像技术能够在同一动物体内连续多天追踪生物学过程（例如基因表达变化16），但其空间分辨率不足以区分单个神经元。经典的活体电生理技术具有极高的时间分辨率，并能极其灵敏地检测膜电位的变化。然而，它们的空间分辨率有限，且无法在较长时间内可靠地追踪同一群细胞。光学成像凭借其高时间和空间分辨率，可用来研究更为多样的生物学过程。然而，离体成像仅能提供正在进行过程的瞬时图像，因此不适合用于动物学习与记忆信息期间的纵向研究。
活体光学成像结合了磁共振成像和电生理学以及光学成像的某些优势，因此非常适用于对小鼠脑部动态和行为进行纵向和相关性分析。这对于研究时间尺度极快（毫秒到秒）或极慢（数天到数周）的生物学过程尤为重要。在神经科学领域，与这些过程相关的例子包括膜电位动态、Ca2+瞬变、细胞可塑性以及结构变化，这些均被认为在记忆形成与回忆中起着至关重要的作用。已有多种方法将活体成像技术拓展至背侧海马体18,19,20,21,22。急性制备模型允许对锥体神经元（PN）的活动及其树突和树突棘进行数小时的追踪观察20,22。然而，这一时间范围尚不足以研究可能与渐进性学习相关的长期结构变化。慢性制备模型——结合微型内窥镜23,24或长工作距离（WD）的标准显微镜物镜21——已实现对背侧海马体持续数周的重复成像。
本文介绍了一种慢性制备方法，通过永久植入的成像套管，可反复对活体小鼠背侧海马CA1亚区进行光学成像。该方法能够在不干扰正常功能的前提下，实现对CA1区域的重复观察，适用于活体双光子（2P）或宽场落射荧光成像。文中详细描述了在活体小鼠背侧CA1区进行双光子深部脑成像的两个应用实例：树突结构及树突棘动态的纵向成像，以及活动诱导可塑性的纵向成像。同时讨论了该技术的主要优势与局限性。

<table><tbody><tr><td>专业钻头/研磨机 IBS/E</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28481</td><td>精密钻孔</td></tr><tr><td>MICROMOT 钻孔机支架 MB 200</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28600</td><td>可移动标尺台</td></tr><tr><td>MICRO 化合物表 KT 70</td><td>Proxxon GmbH</td><td>27100</td><td>可移动标尺台</td></tr><tr><td>机器台钳 MS 4</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28132</td><td>可移动标尺台</td></tr><tr><td>不锈钢管 &amp;Oslash; 3,0 × 0,25 mm（内径） &amp;Oslash; 2.5 mm）L = 500 mm</td><td>Sawade</td><td>R00303</td><td>用于套管金属环的不锈钢管</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片（4 mm 圆形）</td><td>恩格尔布雷希特医疗与实验室技术</td><td></td><td>用于套管玻璃的盖玻片</td></tr><tr><td>6件套钥匙工具组，金属盒包装</td><td>霍夫曼集团</td><td>713750 160</td><td>手动文件</td></tr><tr><td>Pr&amp;auml;zisions-Nadelfeile Gesamtl&amp;auml;140 毫米 4</td><td>霍夫曼集团</td><td>527230 4</td><td>手动文件</td></tr><tr><td>紫外光固化光学胶</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>紫外固化胶</td></tr><tr><td>UV固化LED系统，365 nm</td><td>Thorlabs</td><td>CS2010</td><td>UV固化LED驱动单元</td></tr><tr><td>Stemi 305</td><td>蔡司</td><td></td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>Presto II</td><td>NSK-Nakanishi 德国</td><td>Z307015</td><td>牙科钻头</td></tr><tr><td>FG 钻头（5 件装），平头圆柱形，837-014 细型</td><td>MF Dental</td><td>F837.014.FG</td><td>牙科钻头相关文件</td></tr><tr><td>FG 钻头（5 件装），平头圆柱形，837-014 粗粒</td><td>MF Dental</td><td>G837.014.FG</td><td>牙科钻头的文件</td></tr><tr><td>格劳费镊子 - 直型／带齿</td><td>精细科学工具</td><td>11050-10</td><td>手术用镊子</td></tr><tr><td>微型钻头用磨头</td><td>精细科学工具</td><td>19008-05</td><td>0.5 mm 宽度钻头，用于微型钻孔机</td></tr><tr><td>微型钻头用磨头</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-09</td><td>0.9 mm 宽度钻头，用于微型钻孔机</td></tr><tr><td>手持式微型电机&amp;uuml;ck</td><td>DentaTec</td><td>MM11</td><td>颅骨手术用微型钻</td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>用于手术的杜蒙镊</td></tr><tr><td>精细剪刀 - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>手术用剪刀</td></tr><tr><td>骨髓穿刺活检针</td><td>MW Dental</td><td>229-020</td><td>环钻 - 直径3.0 mm；用于微型钻具</td></tr><tr><td>不锈钢自攻骨螺钉</td><td>Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>0.86 mm 宽骨螺钉</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>科普夫</td><td></td><td>立体定位仪</td></tr><tr><td>3-D关节臂</td><td>霍夫曼集团</td><td>442114</td><td>立体定位仪臂架与载片夹</td></tr><tr><td>2SM 录像</td><td>霍夫曼集团</td><td>442100 2SM</td><td>立体定位仪臂架与载片夹</td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>玻璃珠灭菌器</td></tr><tr><td>异氟烷 CP，安瓿 250 ml</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798932</td><td>用于麻醉的液态异氟烷</td></tr><tr><td>哈佛仪器异氟烷漏斗加液挥发器</td><td>哈佛仪器有限公司</td><td>34-1040</td><td>异氟烷蒸发器</td></tr><tr><td>实验室活性清除剂</td><td>Gropper 医疗技术</td><td>UV17014</td><td>异氟烷废气清除系统</td></tr><tr><td>美达佳 0.5% 注射液（犬/猫），20 ml 瓶装</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798566</td><td>美洛昔康，抗炎药</td></tr><tr><td>Vetalgin 500 mg/ml</td><td>默克动物健康</td><td></td><td>维塔尔金，止痛药</td></tr><tr><td>CMA 450 温度控制器</td><td>Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH</td><td>8003770</td><td>加热毯</td></tr><tr><td>Bepanthen 眼鼻软膏</td><td>拜耳集团</td><td></td><td>眼膏</td></tr><tr><td>KL 1500 LCD</td><td>Schott</td><td></td><td>光纤光源</td></tr><tr><td>Xylocain 喷雾泵</td><td>阿斯利康有限公司</td><td></td><td>利多卡因，局部麻醉剂</td></tr><tr><td>吸收三角片 - 未安装</td><td>Fine Science Tools</td><td>18105-03</td><td>手术用吸收性三角巾</td></tr><tr><td>Parkell C&amp;amp;B Metabond 透明粉末 L</td><td>霍夫迈斯特牙科</td><td>013622</td><td>快速粘合水泥</td></tr><tr><td>Parkell C&amp;amp;B Metabond 快速基质 B</td><td>霍夫迈斯特牙科</td><td>013621</td><td>快速粘合水泥</td></tr><tr><td>Parkell C&amp;amp;B Metabond 通用催化剂 C</td><td>霍夫迈斯特牙科</td><td>013620</td><td>快速粘合水泥</td></tr><tr><td>可调节精度涂布刷</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td>用于手术的精密施用器</td></tr><tr><td>钝针 0.9x23 mm</td><td>牙本质</td><td>0441324</td><td>钝针</td></tr><tr><td>钝针 0.5×42 mm</td><td>牙本质</td><td>0452155</td><td>钝针</td></tr><tr><td>钝针 0.3x23 mm</td><td>牙本质</td><td>0553532</td><td>钝针</td></tr><tr><td>Kallocryl A/C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>丙烯酸液体组分</td></tr><tr><td>Kallocryl</td><td>Speiko</td><td>1609</td><td>丙烯酸粉末</td></tr><tr><td>透明卷状防水膜</td><td>Hartmann</td><td></td><td>粘附膜</td></tr><tr><td>头板</td><td>定制</td><td></td><td>30 mm × 10 mm 尺寸；8 mm 直径孔，钛制</td></tr><tr><td>头部固定夹</td><td>定制</td><td></td><td>头部固定板支架</td></tr><tr><td>基座柱固定架</td><td>Thorlabs</td><td>PH20E/M</td><td>头部固定板支架</td></tr><tr><td>不锈钢柱</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td><td>头部固定板支架</td></tr><tr><td>不锈钢柱</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M</td><td>头部固定板支架</td></tr><tr><td>不锈钢柱</td><td>Thorlabs</td><td>TR150/M</td><td>头部固定板支架</td></tr><tr><td>后连接器夹</td><td>定制</td><td></td><td>头部固定板支架</td></tr><tr><td>铝制光学平台，300 mm × 450 mm × 12.7 mm，M6 螺纹孔</td><td>Thorlabs</td><td>MB3045/M</td><td>显微镜载物台</td></tr><tr><td>7&quot; × 4&quot; 升降平台</td><td>Thorlabs</td><td>L490/M</td><td>显微镜载物台</td></tr><tr><td>低剖面小鼠用面罩</td><td>Emka Technologies</td><td>VetFlo-0801</td><td>麻醉面罩固定架</td></tr><tr><td>RS4000 调谐阻尼高性能光学平台</td><td>纽波特</td><td></td><td>悬浮表</td></tr><tr><td>S-2000A 高性能气动隔振台，带自动复位功能</td><td>纽波特</td><td></td><td>漂浮的桌子</td></tr><tr><td>功率计型号 1918-R</td><td>纽波特</td><td></td><td>功率计</td></tr><tr><td>X-Cite 120Q</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td>荧光灯</td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>Bruker</td><td>Ultima IV</td><td>双光子显微镜</td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>Thorlabs</td><td>贝加莫</td><td>双光子显微镜</td></tr><tr><td>Plan N 4倍/0.10 &amp;infin;/-/FN22</td><td>Olympus</td><td></td><td>目标</td></tr><tr><td>Plan N 10x/0.25 &amp;infin;/-/FN22</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td>目标</td></tr><tr><td>LMPlan FLN 20x/0.40 &amp;infin;/-/FN26.5</td><td>Olympus</td><td></td><td>目标</td></tr><tr><td>XLPlan N 25x/1.00 SVMP &amp;infin;/0-0.23/FN18</td><td>Olympus</td><td></td><td>目标</td></tr><tr><td>用于双光子激发的超快可调谐激光器</td><td>Spectraphysics</td><td>Mai Tai Deep See</td><td>激发激光器</td></tr><tr><td>用于双光子激发的超快可调谐激光器</td><td>Spectraphysics</td><td>InSight DS+ 双束系统</td><td>激发激光器</td></tr><tr><td>用于三光子激发的超快可调谐激光器</td><td>相干的</td><td>摩纳哥</td><td>激发激光器</td></tr></tbody></table>

活体小鼠背侧海马ca1区的纵向双光子成像

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

双光子显微镜是神经科学的一项基本工具，它能够在从亚细胞到神经网络的空间尺度上，以及从毫秒到数周的时间尺度上，对活体动物的大脑进行研究。此外，双光子成像可与多种行为学任务相结合，以探索脑功能与行为之间的因果关系。然而，在哺乳动物中，由于光的穿透深度有限且存在散射，双光子活体成像主要局限于大脑表层区域，从而难以对海马体等深层脑区进行长期纵向研究。海马体参与空间导航和情景记忆，长期以来被用作研究学习与记忆相关细胞及认知过程的模型，无论是在健康状态还是疾病状态下。本文详细描述了一种可在活体小鼠中实现对背侧海马体长期光学访问的制备方法。该方法可与双光子光学成像结合，用于在固定头部、麻醉状态下的活体小鼠中，以细胞及亚细胞分辨率进行持续数周的成像。这些技术使得研究人员能够在背侧海马体CA1区的数十至数百个神经元中，重复观察神经元结构或活动诱导的可塑性变化。此外，这种慢性制备方法还可与其他技术结合使用，例如微型内窥镜、头戴式宽场显微镜或三光子显微镜，从而极大地扩展了研究学习与记忆相关细胞和网络过程的技术工具箱。

由于导管置于CA1背侧，与腹侧相比，CA1的背侧更靠近显微镜。 海马伞 是最靠近的结构，随后依次为 stratum oriens （SO） 锥体细胞层 (SP) 辐射层 (SR) 和 分子层疏松层 （SLM），最远端的一层（图1B，C). 以亚细胞分辨率对神经元结构进行纵向双光子成像，以及以细胞分辨率对活动诱发的可塑性进行成像，作为代表性结果予以展示。为激发荧光蛋白绿色荧光蛋白（GFP）、d2Venus 和 TurboFP635，采用调谐至 920 nm 的飞秒脉冲钛宝石激光器，样品处的平均激光功率调整为 5–25 mW。不同发射波长通过发射滤光片和不同的光电倍增管进行分离。
树突结构及树突棘动态的纵向成像。
为了稀疏标记海马区颗粒神经元并可视化其结构，采用了一种 Thy1-GFP 转基因小鼠品系（M 系）。Thy1-GFP 小鼠在 Thy1 启动子的调控下表达细胞质增强型 GFP。 Thy1 稀疏且随机分布的PN群体中的启动子25. 通常情况下，CA1锥体神经元的主要轴与XY成像平面大致垂直（图1B，图2A 和 补充视频 1）。基底树突从胞体向套管方向延伸进入SO层，而顶端树突和顶端树突簇则朝远离套管的相反方向远端延伸（补充视频 1）。由于制备过程保留了最深层的纤维 海马伞 完整，导管下方视野中应可见少量荧光纤维穿过（图2A 和 视频 1）。该制备方法可实现对浦肯野细胞树突的脊柱分辨率成像（图2 A-C）为了成像树突和树突棘，使用25倍、1.0数值孔径、4 mm工作距离的水浸式商用物镜。
用于纵向追踪时，在首次成像过程中定义套管视野内的多个脑区。每个区域对应约240 x 240 µm 并包含1到7个树突段（图 2B）。这些区域被手动映射到低倍率的三维图像堆栈上，以显示成像套管下方体积中 GFP 表达的分布模式（图2A）。然后， 1 µm 在不同时间间隔（从24小时到3天）对CA1锥体神经元基底树突进行z步进图像采集，持续约14天图2C）。更长的成像持续时间和间隔是可行的26每次成像会话持续约60至90分钟。尽管大多数图像来自SO区的树突棘，但也可对SR区斜向树突中的树突棘进行成像。图 2D-F除了树突棘密度外，该方法还可通过量化树突棘的存活率、新生率和丢失率来研究其动态变化26,27,28,29,30,31,32. 随时间推移对树突棘进行评分与追踪（图 2C），使用一个定制的 MATLAB 界口。该界口可实现对不同时间点获取的图像堆栈进行配准，并支持在追踪树突长度和树突棘位置随时间变化的同时，对手动标记树突和树突棘进行操作26重要的是，该方法可用于区分（每 每个时间点（不包括第一个时间点）之间，预先存在的与新生的树突棘的比例。这一点非常重要，因为不同类型的树突棘被认为在记忆的获取与保持过程中发挥着不同的作用33.
活动诱发可塑性的纵向成像。
为了成像CA1锥体神经元（PNs）中由活动引发的可塑性，将表达绿色荧光不稳定蛋白d2Venus的病毒载体注入背侧CA1海马区，该载体使用Arc增强子/启动子中一种增强型突触活动响应元件（E-SARE）驱动表达，同时使用ePGK启动子驱动表达红色荧光蛋白TurboFP63534。这种方法可在每只动物中对数百个CA1锥体神经元的活动诱发可塑性水平进行成像35。由于锥体神经元标记非常密集，通常无法分辨CA1锥体神经元的树突（补充视频2）。
为成像CA1锥体神经元的胞体，使用40倍、0.8数值孔径、3 mm工作距离的水浸物镜。对于纵向追踪，定义1至9个脑区 每 小鼠在首次成像过程中的每个区域对应约 300 x 300 µm 并且包含 50 到 150 个细胞（图 3A）。这些区域通过低倍镜下可见的局部组织解剖标志进行人工定位。然后， 3 µm 采集包含CA1锥体神经元（PNs）突触后区（SP）的z步进图像序列图3A 和 补充视频 2) 不同时间间隔（从24小时到6天）进行长达约30天的成像。每次成像会话持续约60至90分钟。E-SARE的激活在暴露于新的或富集环境（EE， 图3B) 并在数天内逐渐减弱。因此，我们通常在经历后6至8小时进行成像，并在两次成像会话之间间隔5天。35.
为了定量分析 d2Venus 和 TurboFP635 的荧光值，绘制一个直径为 4.64 µm 的圆形感兴趣区域，该区域小于神经元胞体，中心对准细胞胞体。随后进入下一个时间点，以相同方式对同一细胞的胞体进行评分，并对纵向数据集中的所有时间点及所有可见细胞重复此操作。每个神经元（依赖于活动的）d2Venus 发射光的平均值通过其（不依赖于活动的）TurboFP635 发射光的平均值进行归一化处理。该方法可用于研究 CA1 锥体神经元（CA1 PNs）集合可塑性的长期动态变化35（图 3C）。
<img alt="用于神经科学研究的视窗套管装置示意图，显示皮层各层及实验设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：活体深部脑区光学成像的准备工作。（A）示例成像套管的俯视图（左）和侧视图（右）。成像套管具有透明的玻璃底部，以允许光学通路到达海马体。（B）示意图展示准备工作，重点标明成像套管、CA1区锥体神经元（PN）以及从背侧到腹侧的三层光纤的相对位置。（C, D）成像实验期间的成像装置示意图（C）和动物固定装置示意图（D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用 Thy1-GFP 显微镜进行神经元生长分析，示意图显示树突结构在14天内的发育过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2: 树突结构及树突棘动态的纵向成像。（A）活体 Thy1-GFP 小鼠中由 GFP 标记的神经元和树突的双光子图像堆栈（59 个图像平面的最大强度投影（MIP），z 轴间距为 2 µm）。（B）更高倍数放大（53 个图像平面的最大强度投影，z 轴间距为 1 µm），详细展示位于 SO 层的基底树突。（C）一段树突结构在 14 天内的时间序列成像。箭头指示在 14 天内被追踪的树突棘。（D, E）活体 Thy1-GFP 小鼠中由 GFP 标记的神经元和树突的双光子图像堆栈；（D）ZY 投影（31 个图像平面，z 轴间距为 3 µm）；（E）XY 投影（17 个图像平面，z 轴间距为 3 µm）。（F）高倍放大（单个图像平面），详细展示位于 SR 层的顶端树突及树突棘。箭头指示树突棘。激发光波长：920 nm；发射光峰值：510 nm。比例尺：A，50 µm；B，10 µm；C，2 µm；D 和 E，15 µm；F，4 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="d2Venus/TurboFP635 随时间变化的荧光显微镜比较示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3： 活动诱发可塑性的纵向成像 (A). 来自活体小鼠的双光子图像（单个图像平面），显示基线第0天和丰富环境干预第1天后的相同细胞. (B). 双光子图像序列（4-6个图像平面的最大强度投影， 3 µm z间距），显示环境A（第1、19和25天）与环境B（第7和13天）中特异的E-SARE激活模式。绿色：d2Venus荧光；红色：TurboFP635荧光。激发波长：920 nm；d2Venus发射峰：530 nm；TurboFP635发射峰：635 nm。比例尺：A， 20 µm；B， 10 µm该图已根据 Attardo 等人，2018 年的研究进行了修改35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="三光子成像示意图；小鼠脑内CA1区和齿状回中Thy1-GFP神经元的可见性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：利用三光子（3P）显微镜对海马齿状回（DG）中神经元结构进行成像。（A-H）在活体Thy1-GFP小鼠中，通过GFP标记获得的神经元和树突的三光子图像（单层图像平面），其中（A-E）显示CA1区的锥体神经元（PNs），（F-H）显示DG区的颗粒细胞。激发波长：1400 nm；发射峰：510 nm。比例尺：40 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充视频 1：活体 Thy1-GFP 小鼠中的成像视野。 在活体 Thy1-GFP 小鼠中，从套管底部延伸至 SLM 的神经元和树突（由 GFP 标记，呈白色）的双光子图像序列（共 83 个图像平面，z 轴间距为 7 µm）。为补偿荧光信号随成像深度增加而衰减的情况，我们采用了光电倍增管增益的非线性梯度调节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_1_FINAL.avi">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 2：活动诱发的可塑性成像。 表达 IEG 报告基因 E-SARE 的活体小鼠脑内包含 SP 区域的神经元的双光子图像序列（28 个图像平面，z 轴间距为 3 µm）。绿色：d2Venus 荧光信号。红色：TurboFP635 荧光信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_2_FINAL.avi">请点击此处下载该文件。</a>

本方法描述了一种慢性制备技术，可实现对活体小鼠海马体的光学观察。该技术可用于在数周时间内对神经元结构可塑性以及活动诱导的细胞可塑性进行纵向光学成像。

活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像

双光子显微镜是神经科学的一项基本工具，因为它允许在从……的空间尺度上对活体动物的大脑进行研究

该操作为活体小鼠的背侧海马体提供了可重复的光学通路，以便在小鼠执行学习任务时研究记忆形成与提取的机制。该技术能够在数周的时间内，以微米级的空间分辨率，利用光学显微镜对活体小鼠的背侧海马体进行纵向观察。记忆丧失是阿尔茨海默病等某些脑部疾病的普遍特征。理解记忆形成与回忆的机制，最终可能有助于治疗罹患这些疾病的患者。该方法可应用于其他具有颅骨的动物体系，例如小型哺乳动物。在存活手术期间监测生命体征可能既分散注意力又带来压力。为了更好地关注该操作的关键步骤，建议首先在死亡动物上进行该步骤。准备成像套管时，首先将直径为三毫米的不锈钢管切割成一段长度为1.6毫米的金属环。如果切割后金属环的边缘不够钝，需用锉刀将不平整处修整光滑。接下来，使用一对镊子将金属环的一侧浸入紫外光固化光学胶中。然后将金属环放置在玻璃盖玻片的中心位置，使涂有胶的环面与盖玻片接触。打开紫外光固化LED驱动装置，用波长为365纳米的光照射胶体1分钟，使胶体固化。通过调整光源方向，确保环状结构的各个侧面均被均匀照亮。待粘合剂固化至少两小时后，用止血钳牢固夹住金属环开口端的套管。使用装有旋转锉的牙科钻，将多余的玻璃盖玻片锉平，直至其与环的侧面齐平。按照随附的文字实验方案准备所需的仪器并对小鼠进行麻醉。然后去除小鼠头部皮肤上的毛发并进行消毒。接着，使用剪刀和镊子在接近人字缝的位置对头皮进行小切口。向耳部方向横向移动，然后向眼眶方向向前移动，在矢状轴上形成一个位于前囟前方约四毫米的三角形区域。在颅骨上滴加一滴利多卡因。两分钟后，用棉签清除骨膜并擦干颅骨。然后调整耳杆位置以固定小鼠头部。使用带有0.5毫米宽磨头的微型钻，在成像侧海马对应的额骨上钻一个小孔，位置大约位于矢状缝外侧1.5毫米、冠状缝后方2毫米处。随后将一枚0.86毫米宽的不锈钢骨螺钉旋入颅骨孔中。使用粘合剂水泥将其固定到位，静置30秒至1分钟使水泥干燥。接着，使用直径为3毫米的环钻在顶骨上钻一个小孔。将孔定位在矢状缝远端约 1.5 毫米处，以及人字缝远端 2 毫米处。小心移除骨瓣，然后使用杜蒙镊子去除脑膜。消融皮层组织以暴露外囊。使用连接真空泵的19号钝针，并用生理盐水冲洗，以防止暴露的组织脱水，并在出血停止后清除残留血液。每次缓慢吸除约50至100微米的皮层组织，直至皮层与囊膜分离，暴露出扣带回或胼胝体的纤维。然后小心剥离背侧纤维，直至暴露最深层的纤维，即海马的海马伞。操作完成后，用生理盐水冲洗组织。接着，用细镊子夹住底部导管浸入生理盐水，并将其置于颅骨孔上方。然后将套管推入颅骨，直至玻璃盖玻片与纤维接触。干燥颅骨表面，并在颅骨上涂抹速干粘合水泥以固定套管位置。务必同时在套管边缘涂抹粘合剂，但需小心避免粘合剂流入套管内部。干燥后，使用立体定位臂将头固定板置于套管上方，并使其与颅骨接触。制备牙科丙烯酸树脂混合物，然后将其涂抹至整个颅骨表面。用牙科丙烯酸树脂覆盖所有暴露的颅骨、螺钉及开放的皮肤区域，以固定装置。15分钟后，将一层可移除的粘性薄膜贴在头固定板上，以防止碎屑进入套管。准备进行脑部成像时，请参照随附的文字版实验方案，了解麻醉相关的详细步骤。待动物充分镇静后，用镊子小心地从头固定板上移除粘性薄膜。轻轻移除薄膜，避免损坏制备样本。接着，将小鼠置于显微镜下的加热垫上，并将头板固定至固定架。为动物的眼睛涂抹眼膏。然后使用注射器和细针向成像套管内滴加去离子水，再用真空泵抽吸以清洗套管。使用低倍率、长工作距离物镜，目视检查套管内是否有残留水分、污物、结构完整性以及是否存在荧光。随后通过调节头部固定装置臂的角度，将套管与光轴对齐。切换至数值孔径为1.0、工作距离为四毫米的25倍物镜。然后向套管中加入足够的去离子水，使其充满套管，并在套管顶部保持过量的水。最后，使用双光子激发成像荧光信号。图中显示的是来自 Thy1-GFP 转基因小鼠脑组织的双光子图像序列。Thy1-GFP 小鼠在锥体神经元的稀疏随机群体中，由 Thy1 启动子驱动表达细胞质增强型 GFP。通常情况下，背侧海马 CA1 区锥体神经元的长轴大致垂直于 XY 成像平面。这些区域被手动映射到低倍率的三维图像堆栈上，以显示成像套管下方体积中 GFP 表达的模式。对于纵向追踪，定义了套管视野内的多个脑区。每个区域对应约 240 乘以 240 微米的面积，包含一至七个树突片段。此处显示的成像序列是CA1锥体神经元及其基底树突在14天内不同时间间隔采集的1微米z步长图像堆栈。然而，也可以进行更长时间的成像以及更长的时间间隔。尽管大多数图像来自辐射层中的树突棘，但同样可以在辐射层的斜向树突中对树突棘进行成像。该技术的另一种延伸应用是通过向背侧CA1海马区注射病毒载体，对CA1锥体神经元中由活动诱发的可塑性进行成像。这使得可在每只动物中测量数百个CA1锥体神经元的可塑性，如图中所示的双光子图像序列。在移除覆盖组织时，必须避免对海马体造成损伤。此外，应正确放置套管，以确保制备的稳定性。所述的制备方法可用于多种光学成像技术，例如可植入动物头部的微型显微镜，从而使研究人员能够追踪自由活动动物中的神经元活动。最初，该技术用于研究海马神经元的结构可塑性。如今，它也被应用于研究其他脑区的神经元活动。

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活鼠中多萨尔希波坎卡尔CA1的纵向双光成像

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活体小鼠第2/3层双光子钙成像

来源： Maruoka, H., et. al. 清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。J. Vis. Exp. (2022)...

在清醒小鼠中同步成像小胶质细胞动态与神经元活动

来源： Ulivi, A. F., et. al. 活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像. J. Vis. Exp. (2019)...

活体小鼠海马中荧光标记神经元的纵向双光子成像

来源： Kamei, R. 等, 体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像 视频实验杂志 (2022)该视频展示了活体海马体CA1区（Cornu ammonis...

活体双光子成像观察小鼠海马区小胶质细胞动态

神经元中依赖于经验的分子变化对于大脑应对行为挑战时的适应能力至关重要。 体内...

体内 双光子成像技术观察皮层神经元中由经验引起的相关分子变化

本文描述了在虚拟现实环境中对小鼠行为期间进行皮层双光子成像所涉及的实验步骤。...

小鼠在虚拟现实环境中导航时的双光子钙成像

在活体动物中进行延时成像可为完整大脑内的结构重组提供重要信息。本文介绍一种颅骨减薄制备方法，该方法可通过双光子显微镜对活体小鼠大脑皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像。...

双光子 体内 使用颅骨变薄制备法对小鼠皮层树突棘进行成像

本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠压后皮层神经元的长期成像 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠中进行双光子显微成像，并结合向背侧海马注射表达 mCherry...

双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

本文演示了定制成像窗口的制备方法，该窗口配有灌注套管，并展示了其在小鼠海马CA1区的植入过程。...

行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作

本文介绍了一种通过精确控制的手术和双光子显微镜技术，对小鼠海马CA1区静息态小胶质细胞进行慢性体内观察的方法。...

体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

学习活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像技术，用于研究记忆形成与神经可塑性机制。该方法可在数周内以微米级分辨率追踪神经元结构变化，为神经科学研究提供重要工具。

活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像

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