无核酸酶氧清除剂原儿茶酸3,4-双加氧酶的表达与纯化

本方案可获得高活性且无可见核酸酶污染的丙酮酸脱羧酶（PCD），该酶可用于任何需去除溶液中溶解氧的实验体系。所采用的技术易于重复，且能确保产物中无核酸酶污染。首先，在离心管中加入1 µL pVP91A-pcaHG PCD表达质粒和20 µL市售的大肠杆菌BL21（E.coli BL21）。

轻轻弹击离心管以混匀，将离心管置于冰上5分钟。为继续转化反应，将离心管放入42°C水浴中30秒，然后再次置于冰上2分钟。加入80 µL SOC培养基，在37°C、225 rpm条件下振荡培养1小时。

接下来，将转化反应混合物倒入LB-氨苄青霉素琼脂平板上，使用涂布棒将混合物均匀涂布。盖上平板盖子，在37摄氏度下孵育16至18小时。之后，从平板上挑取一个单菌落，接种到250毫升锥形瓶中的50微升LB-氨苄青霉素培养基中。

将锥形瓶置于摇床中，225 rpm、37摄氏度培养16至18小时。然后，取20毫升培养后的菌液转移至含有1升LB-氨苄青霉素的4升锥形瓶中。在37摄氏度、225 rpm条件下振荡培养。

每隔一小时，取一毫升培养液加入比色皿中，使用光度计在 600 纳米波长下测定其光密度。当培养液的光密度接近 0.5 时，将测量频率增加至每 15 分钟一次，直至 OD600 达到 0.5。随后，将四升烧瓶转移至盛有冰的容器中。

将烧瓶在冰浴中轻轻旋转，以降低培养物温度。将四升烧瓶转移至17摄氏度、180 rpm的培养箱中。每20分钟继续监测一次OD600。

在 OD600 为 0.7 时，加入 IPTG 和硫酸铁铵六水合物储备液，使其终浓度分别为 0.5 毫摩尔和 10 毫克/升。将培养物在 180 转/分钟、17 摄氏度条件下振荡培养 18 小时。培养结束后，将培养瓶置于冰上 2 分钟。

取1毫升诱导后的细胞，收集至1.5毫升聚丙烯微量离心管中，用于SDS-PAGE分析。接着，将细菌培养物倒入瓶子中，每瓶500毫升，用于离心。在4°C、3,000 × g条件下离心20分钟，收集菌体沉淀。

弃去上清液。用移液器将沉淀重悬，每份沉淀分别加入12.5毫升冷PBS，并将每两份重悬液合并至一个50毫升锥形管中。再次按前述方法离心收集细胞沉淀。

然后，弃去上清液，并用移液器向每根试管中加入10毫升裂解缓冲液以重悬细胞。对含有诱导细胞的试管进行超声处理后，将细菌裂解液倒入预冷的聚碳酸酯瓶中。在4°C条件下以120,000 × g离心60分钟，然后将上清液转移至预冷的50毫升锥形管中。

在准备好装有镍离子螯合树脂的FPLC仪器后，以0.15毫升/分钟的流速将样品上样至柱中。用20毫升含20毫摩尔咪唑的镍缓冲液洗涤柱子。将洗涤液收集于50毫升离心管中用于后续分析。

接下来，用15毫升含125毫摩尔咪唑的镍缓冲液洗涤层析柱。收集洗脱液，共19个组分，每组0.8毫升。再次用15毫升100%镍缓冲液B洗涤层析柱，并额外收集75个组分，每组0.2毫升。

在12% SDS-PAGE凝胶上继续分析收集的组分，以确认PCD的存在。首先，向一个1.5毫升聚丙烯微量离心管中加入35微升反应缓冲液。在该管中，混合5微升峰值层析组分与500纳克的三干碱基对超螺旋质粒pXba。

将试管置于37摄氏度水浴中孵育1小时。根据文稿制备琼脂糖凝胶后，将每种反应液各30微升加入凝胶的加样孔中。在室温下以每厘米10伏电压电泳约1小时。

此时，橙色的G染料已迁移至凝胶末端。立即使用荧光扫描仪对凝胶中的溴化乙锭信号进行成像。利用信号强度与图像像素尺寸功能，测定不同DNA组分（如超螺旋、线性及切口环状DNA）的像素体积。

为确定每种DNA物种的百分比，将单个DNA物种的像素体积除以所有个体物种的总像素体积。SDS-PAGE分析显示，第二个洗脱峰含有极少的蛋白质污染，代表几乎纯净的PCD异源二聚体，且核酸酶活性极低或无法检测。因此，将第二次PCD洗脱的这10个组分合并至一个5毫升的锥形管中，用于进一步分析。

在4°C冷室中对PCD进行尺寸排阻色谱纯化后，于微量离心管中加入适量体积的氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）、氯化镁、二硫苏糖醇（dithiothreitol）、对氯苯胺（PCA）以及超螺旋质粒pXba，配制成5X储存液。将96孔平底板置于冰上，取10微升上述混合的5X溶液加入各孔中。在分析前立即向每孔加入10微升各自的PCD SEC组分。

将酶标仪设置为37摄氏度的内部温度，然后将96孔板转移至板架中。将板架缩回仪器内，在一小时内每隔20秒测量一次290纳米处的吸光度。每次读数前，设置仪器对板进行5秒振荡。

孵育一小时后，向每个孔中加入 10 µL 终止液以终止反应。对 PCD SEC 组分进行凝胶电泳。选择 PCA 氧化活性最强的组分，其特征为吸光度降低且未观察到核酸酶污染。

在280纳米处测定吸光度，并根据吸光度和消光系数计算总PCD浓度。将选出的组分于-80摄氏度长期保存。本实验发现，重组PCD（即带有六组氨酸标签的pcaH与pcaG形成的异源二聚体）在大肠杆菌（E.coli）中成功表达。

首先通过镍亲和层析纯化异源二聚体。吸光度以蓝色显示，镍缓冲液B的百分浓度以红色显示。流穿组分显示了未结合到镍树脂上的可溶性细菌蛋白。

部分PCD在125毫摩尔咪唑存在下洗脱，但大部分蛋白质在250毫摩尔咪唑中洗脱。代表性SDS-PAGE分析表明，洗脱步骤的各组分中无污染物。核酸酶活性检测的琼脂糖凝胶结果显示，与未添加蛋白质的阴性对照以及被DNA核酸酶污染的阳性对照相比，存在污染。

琼脂糖凝胶核酸酶实验中观察到的各种DNA物种的定量结果显示，第29至38组分的核酸酶活性较低，因此选择合并这些组分，浓缩后通过尺寸排阻色谱（SEC）进一步纯化。来自三个代表性SEC组分的数据表明，纯化的PCD可降低290纳米处的吸光度，表明PCA发生了氧化。通过该步骤获得的纯化PCD可用于所需的氧气清除系统，并可进一步优化。

这将确定系统所需的程序性细胞死亡（PCD）的确切数量。该技术已用于延长单分子显微成像实验中荧光染料的寿命，从而允许更长时间的数据采集。所使用的超速离心机具有危险性。

离心前务必确保离心机已正确平衡。溴化乙锭为有害试剂，应穿戴个人防护装备以避免接触，并按规定妥善处理。