Name: 无核酸酶的表达和纯化原氧基质 3，4-二氧酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习在大肠杆菌中表达和纯化原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD）的方法，用于去除水溶液中的氧气污染。该方案可获得高活性且无核酸酶污染的PCD酶，适用于单分子显微镜等生化实验。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为GM121284和AI126742，授予KEY。

1. 在大肠杆菌（E. coli）中诱导PCD表达
<ol>
	<li>在离心管中混合1 μL pVP91A-pcaHG PCD表达质粒（20 ng/μL，图1A）和20 μL E.coli BL21（20 μL市售菌株，&#62; 2 x 106 cfu/μg质粒）。轻弹管壁混匀，将离心管置于冰上5分钟。</li>
	<li>将转化体系在42 °C下热激30秒，随后立即置于冰上2分钟。</li>
	<li>加入80 μL SOC培养基（含分解代谢抑制的超优肉汤：2.5 mM KCl、10 mM NaCl、2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10 mM MgSO4、10 mM MgCl2、20 mM葡萄糖），在37 °C下以225转/分钟（rpm）振荡培养1小时。</li>
	<li>将转化反应液涂布于LB氨苄琼脂平板（1 L LB琼脂：10 g NaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g琼脂、50 μg/mL氨苄青霉素；每10 cm直径培养皿使用25 mL）。</li>
	<li>将平板倒置，在37 °C下培养16–18小时。</li>
	<li>从平板上挑取单菌落接种至250 mL锥形瓶中的50 mL LB氨苄液体培养基（1 L LB：10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母提取物、50 μg/mL氨苄青霉素），在37 °C下以225 rpm振荡培养16–18小时。</li>
	<li>将20 mL种子液转移至含1 L LB氨苄培养基的4 L锥形瓶中，在37 °C下以225 rpm振荡培养。</li>
	<li>每小时测定一次菌液OD600（600 nm处的光密度值）。当OD600接近0.5时，将测量频率提高至每15分钟一次。目标菌液密度为0.5 OD600。</li>
	<li>将4 L锥形瓶置于冰浴中，轻轻摇动以降低菌液温度。 
	注意： 冰浴时间应尽可能短，以保持细胞的代谢活性。理想情况下，冰浴时间应少于10分钟。</li>
	<li>程序性细胞死亡（PCD）的成功诱导可通过变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析进行观察。取1 mL未诱导的菌液置于离心管中，在室温下以14,000 × g离心1分钟，弃去上清液。
	<ol>
		<li>用150 μL PBS（磷酸盐缓冲盐水）重悬菌体沉淀。</li>
		<li>加入等体积的2×上样缓冲液（1.2% SDS、30%甘油、150 mM Tris-HCl，pH 6.8、0.0018%溴酚蓝、15% β-巯基乙醇），涡旋混匀。</li>
		<li>将样品煮沸3分钟，随后立即置于冰上。样品可于-20 °C冰箱中保存以备后续分析。 
		注意： PBS市售产品可能含或不含CaCl2和MgCl2。许多实验室在细胞培养方法中使用不含CaCl2和MgCl2的PBS。我们发现使用含或不含CaCl2和MgCl2的PBS对实验结果无显著差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将4 L锥形瓶转移至17 °C、180 rpm振荡的培养箱中继续培养，每20分钟监测一次OD600。</li>
	<li>当OD600达到0.7时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM（使用0.25 M储存液），并加入硫酸亚铁铵（六水合物）至终浓度10 mg/L（使用10 mg/mL储存液，Fe(NH4)2(SO4)2）。PCD基因pcaH和pcaG通过添加IPTG从T5启动子诱导表达（图1A）。硫酸亚铁被PCD结合，并在儿茶酚开环反应中通过配位氧分子发挥催化作用所必需。</li>
	<li>在17 °C、180 rpm条件下继续振荡培养18小时。</li>
	<li>参照步骤1.2将菌液锥形瓶置于冰浴中，参照步骤1.3取1 mL诱导后的菌液进行SDS-PAGE分析。</li>
	<li>将菌液转移至适合离心的瓶子中。1 L菌液可分装至4个250 mL锥形离心瓶中，在4 °C、3000 × g条件下离心20分钟，弃去上清液，并妥善处理细菌液体废弃物。</li>
	<li>用移液器将每升菌液的沉淀重悬于25 mL冷PBS中（CaCl2和MgCl2可选添加）。</li>
	<li>将重悬液转移至50 mL锥形管中（每升菌液使用1个50 mL管），在4 °C、3000 × g条件下离心20分钟，弃去上清液并妥善处理。</li>
	<li>用移液器将细胞重悬于10 mL裂解缓冲液（300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、20 mM咪唑、10%甘油、800 ng/mL抑肽酶、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽、87.1 μg/mL苯甲基磺酰氟（PMSF））中。使用液氮在杜瓦瓶中速冻重悬液，将样品管储存于-80 °C冰箱中。我们曾使用储存于-80 °C长达一年的菌体沉淀纯化PCD，未见明显活性损失。</li>
	<li>通过SDS-PAGE比较未诱导和诱导后的菌体蛋白表达情况。 
	注意： 我们在PCD异源二聚体的诱导方面未遇到困难，但仍建议在继续纯化前先测试诱导效果，以防某些试剂意外失效。
	<ol>
		<li>准备SDS-PAGE凝胶板（尺寸：7.3 cm × 8.3 cm × 0.75 mm厚）。浓缩胶为1.5 mL 6%聚丙烯酰胺（6%丙烯酰胺、125 mM Tris-HCl，pH 6.8、0.1% SDS、0.1%过硫酸铵、0.001% TEMED）。分离胶为3.5 mL 12%聚丙烯酰胺（12%丙烯酰胺、375 mM Tris-HCl，pH 8.8、0.1% SDS、0.1%过硫酸铵、0.001% TEMED）。在浓缩胶层插入10孔梳子。</li>
		<li>每孔上样10 μL未诱导和诱导的细菌样品，另取4 μL预染蛋白分子量标准品上样（图1B）。</li>
		<li>以约16.5 V/cm的电压进行电泳，持续约1小时，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部。</li>
		<li>将凝胶放入塑料容器中的考马斯亮蓝染色液（10%乙酸、40%甲醇、0.1%考马斯亮蓝染料）中，确保染色液完全浸没凝胶。室温染色20分钟，可选择轻柔摇动。</li>
		<li>更换为脱色液（10%乙酸、40%甲醇），室温孵育并可选择轻柔摇动，直至蛋白条带清晰可见。</li>
		<li>用去离子水替换脱色液。在细菌总蛋白中，诱导后的PCD亚基应在诱导样品中可见。六组氨酸标签的PCD亚基pcaH分子量为28.3 kDa，pcaG亚基为22.4 kDa。若未观察到明显的PCD亚基条带，应重新挑取新菌落进行诱导。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PCD 的镍亲和层析纯化
<ol>
	<li>将一管50 mL的诱导细胞置于冰上解冻。样品完全解冻可能需要2-3小时。</li>
	<li>保持试管在冰上，以30%的振幅对样品进行1分钟超声处理，工作周期为开1秒、关1秒。使用锥形微头（直径0.125英寸）超声破碎仪。最大功率为400 W，频率为20 kHz，适用于每升培养物沉淀。</li>
	<li>超声处理后，加入溶菌酶至终浓度0.2 mg/mL（使用10 mg/mL的储存液），并在冰上于4 °C孵育30分钟。</li>
	<li>将细菌裂解物倒入预冷的聚碳酸酯瓶中（尺寸：25 mm × 89 mm）。该瓶子应与固定角转子超速离心机兼容。可使用其他试管和/或转子替代，但最终离心力必须保持一致。</li>
	<li>在4 °C下以120,000 × g离心60分钟。细胞碎片将形成沉淀，上清液可能呈黄色。
	<ol>
		<li>可在后续SDS-PAGE分析中包含该沉淀，以确定PCD的溶解性（图1B）。通过在10 mL PBS中涡旋振荡溶解沉淀，转移150 μL至1.5 mL离心管中。按步骤1.3的方法制备样品用于SDS-PAGE。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将上清液转移至预冷的50 mL锥形管中，记录体积。若上清液被细菌DNA污染，样品可能变得黏稠，细菌基因组DNA可能堵塞层析柱流速。此时应重复步骤2.2的超速离心以沉淀细菌DNA。第二次离心所得沉淀可能不易观察或呈透明状。</li>
	<li>配制500 mL Ni Buffer A（300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、10%甘油、800 ng/mL抑肽酶、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽和87.1 μg/mL PMSF）和500 mL Ni Buffer B（300 mM NaCl、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、10%甘油、800 ng/mL抑肽酶、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽和87.1 μg/mL PMSF、250 mM咪唑，pH 8.0）。将两种Ni缓冲液均通过0.2 μm孔径滤器过滤。</li>
	<li>样品、缓冲液及FPLC（快速蛋白液相色谱）系统均置于4 °C冷藏室内。使用Ni Buffer A冲洗泵A，使用Ni Buffer B冲洗泵B。用含20 mM咪唑的缓冲液（8% Ni Buffer B，92% Ni Buffer A）冲洗系统，直至紫外吸收值和电导率稳定。常规操作中流速为5 mL/min，压力上限为1.0 MPa。流速和压力上限应根据所用FPLC仪器的规格确定。</li>
	<li>准备一根装有1.5 mL镍离子负载树脂的层析柱（尺寸：长110 mm × 直径5 mm）。树脂结合能力为50 mg/mL，可耐受1 MPa压力。可在纯化前将柱子装好并储存于4 °C。 
	注意： 若需要处理超过一管50 mL的诱导细胞以获得更多的蛋白，可按比例增大柱体积。我们通常每次纯化均使用新柱，以确保目标蛋白不被残留蛋白污染。然而，镍树脂可根据制造商说明进行回收再利用。</li>
	<li>将镍离子负载树脂柱连接至FPLC系统。以0.5 mL/min流速、0.5 MPa压力上限，用20 mL含20 mM咪唑的缓冲液（92% Ni Buffer A和8% Ni Buffer B）过柱平衡。FPLC系统应实时监测A280（280 nm紫外吸收值）和电导率。若在20 mL缓冲液通过后这些数值仍未稳定，则继续冲洗直至稳定。</li>
	<li>以0.15 mL/min流速将样品（约10 mL）上样至柱中，设定压力上限为0.5 MPa，收集穿流液。</li>
	<li>用20 mL含20 mM咪唑的Ni缓冲液（92% Ni Buffer A和8% Ni Buffer B）洗涤层析柱，将洗脱液保留在50 mL管中用于分析。再用15 mL含125 mM咪唑的缓冲液（50% Ni Buffer A和50% Ni Buffer B）洗涤柱子，收集洗脱液为19个组分，每管0.8 mL。随后用15 mL 100% Ni Buffer B洗涤柱子，额外收集75个组分，每管0.2 mL。部分PCD异源二聚体将在50% Ni Buffer B洗脱时出现，但大部分异源二聚体将在100% Ni Buffer B洗脱时被洗出。</li>
	<li>在12% SDS-PAGE凝胶上分析所收集的各组分，确认PCD的存在。向穿流液、洗涤液及A280峰组分中加入等体积的2×上样缓冲液，煮沸3分钟，然后置于冰上。倒入两块12% SDS-PAGE凝胶（如步骤1.7所述），重复1.7中描述的凝胶方法。</li>
</ol>
3. 核酸酶活性检测
<ol>
	<li>根据 SDS-PAGE 分析，确定含有近乎纯的 PCD 的镍亲和层析组分。将 5 μL 层析组分与 500 ng 3 kb 超螺旋质粒 pXba+ 加入反应缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.1 mM DTT）中，总体积为 50 μL。
	<ol>
		<li>在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
		<li>设置阴性对照（不加蛋白）和阳性对照（商用 PCD）。加入 10 μL 终止液（150 mM EDTA，pH 8.0，0.6% SDS，18% 甘油，0.15% 橙 G）终止反应。</li>
		<li>样品可保存于 -20 °C 冰箱中，待后续分析。在核酸酶活性检测中可使用任何超螺旋质粒，只要超螺旋和松弛环状的反应产物可通过琼脂糖凝胶电泳分辨即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在凝胶模具（尺寸：15 × 10 cm）中倒入 120 mL 含 1% 琼脂糖的 1× TAE 溴化乙锭缓冲液（40 mM Tris-乙酸盐，1 mM EDTA，0.5 µg/mL 溴化乙锭）。使用 15 孔梳子（孔尺寸：5 mm × 1.5 mm）。待凝胶凝固后，将其浸入 1× TAE 溴化乙锭缓冲液中。</li>
	<li>取 30 μL 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。在室温下以 10 V/cm 的电压电泳约 1 小时，橙 G 染料前沿应迁移至凝胶末端。</li>
	<li>立即使用荧光扫描仪成像凝胶中的溴化乙锭信号。若使用 3 kb 质粒，则最慢条带为约 3.5 kb 的松弛环状 DNA，线性 DNA 迁移在 3 kb 处，而超螺旋质粒迁移最快，位于约 2 kb 处。
	<ol>
		<li>使用图像分析软件计算每条带的总像素体积。</li>
		<li>测定不同 DNA 形式（如超螺旋、线性及切口环状）的像素体积，并据此计算各 DNA 形式的百分比。例如，与阴性对照相比，若某组分中切口环状 DNA 的比例升高，则表明存在核酸酶活性。计算方法为：将某泳道中切口环状 DNA 的像素体积除以该泳道总 DNA 的像素体积，再乘以 100 得到百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据 SDS-PAGE 分析结果，合并第二洗脱峰中几乎纯的 PCD 异源二聚体组分，且其核酸酶活性应极低或检测不到。我们通常合并的体积约为 2 mL。</li>
	<li>将样品加入截留分子量为 10 kDa 的离心过滤装置中。在 4 °C 条件下，于摆桶转子中以 4000 × g 离心 40 分钟。也可使用 35° 固定角转子，在 4 °C 条件下以 7500 × g 离心 20 分钟。
	<ol>
		<li>重复离心操作，直至最终截留液体积为 100–200 μL。</li>
		<li>将滤膜装置倒置，于 4 °C 条件下以 1000 × g 离心 2 分钟，回收截留液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. PCD 的凝胶过滤层析纯化
<ol>
	<li>配制 250 mL 尺寸排阻色谱（SEC）运行缓冲液（100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl，pH 7.5、10% 甘油、0.1 mM EDTA、800 ng/mL 胃蛋白酶抑制剂、1 μg/mL 亮肽素和 87.1 μg/mL PMSF）。将缓冲液通过 0.2 μm 孔径滤膜过滤，并于 4 °C 保存。 
	注意： 所有操作步骤均需在 4 °C 的冷藏环境中进行。尺寸排阻色谱纯化为可选步骤，但蛋白应保存在 SEC 运行缓冲液中。若省略 SEC 纯化步骤，则应在 4 °C 下将 3.6.2 步骤中收集的截留物置于 10 kDa 截留分子量（MWCO）透析袋中，对 1 L SEC 缓冲液透析过夜。</li>
	<li>使用 SEC 运行缓冲液以 0.5 mL/min 流速平衡交联琼脂糖 SEC（尺寸排阻色谱）柱（规格：10 mm × 300 mm；柱床体积 24 mL；上样体积 25–500 μL；耐压上限 1.5 MPa；排阻极限 2 × 106 Da；分离范围 1–300 kDa）。 
	注意： 如有需要，可使用其他尺寸的 SEC 柱替代。</li>
	<li>将浓缩后的组分加载至 200 μL 体积的进样环中，并以 0.5 mL/min 流速上样至色谱柱。上样体积越小，SEC 分辨率越高。用 23 mL SEC 运行缓冲液洗脱，共收集 94 个 250 μL 的组分。SEC 色谱图应呈现一个单一的 A280 峰，对应 PCD 异源二聚体。我们发现 PCD 在 8.9 mL 处洗脱。若使用不同的 SEC 柱，洗脱时间将有所变化。</li>
</ol>
5. PCA 氧化与核酸酶活性检测
<ol>
	<li>在96孔平底板中进行检测PCA氧化和核酸酶活性的反应。在4 °C冷室中将反应体系置于冰上，在96孔板中组装反应，以防止过早发生催化反应。最终反应体积为50 μL，包含：130 mM NaCl、50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl2、0.1 mM DTT、5 mM PCA、10 ng/mL超螺旋质粒pXba+以及10 μL单独的PCD SEC组分。 
	注意：PCD SEC组分应最后加入，并在加入后立即开始分析，因为蛋白在加入时即开始催化反应。</li>
	<li>PCD对PCA的氧化导致PCA在290 nm处的吸光度（A290）降低。将96孔板转移至设定内部温度为37 °C的酶标仪样品架上。将样品架缩回仪器内，每隔20秒测量一次A290，持续1小时。每次读数前让仪器振荡板子5秒。</li>
	<li>反应1小时后，加入10 μL终止液（150 mM EDTA，pH 8.0，0.6% SDS，18%甘油，0.15%橙G）终止反应。</li>
	<li>按照步骤3.2的方法制备、上样并运行琼脂糖凝胶电泳。</li>
	<li>按照步骤3.3的方法对琼脂糖凝胶进行成像和分析。</li>
	<li>选择PCA氧化活性最高且未检测到核酸酶污染的组分，用于在-80 °C长期保存。测定A280。</li>
	<li>利用A280和摩尔消光系数（ε280）734,700 M-1cm-1计算总PCD浓度。</li>
	<li>将各组分在液氮中快速冷冻，储存于-80 °C冰箱中。或者，也可将具有活性且无核酸酶污染的组分合并后分装，并以相同方式冷冻。我们通常每升培养物可获得1–2 mg PCD。在SM实验中的典型使用量为3 μg PCD。我们将PCD在-80 °C保存长达1年，未观察到活性下降。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在单分子荧光显微镜中，通常会加入氧气清除系统以减少光漂白3,7,8。这些显微技术常用于观察核酸或蛋白质与核酸之间的相互作用1,13,14。若氧气清除系统被核酸酶污染，可能导致虚假结果。
已有研究表明，市售的OSS（包括GODCAT和PCD）含有显著的核酸酶污染11。虽然可以购买PCD并通过尺寸排阻色谱法（SEC）去除核酸酶污染物11，但在该方法发表后，某供应商的市售PCD价格增长了5倍。本方法可制备出高活性且无核酸酶的PCD异源二聚体，理论上可在1周内完成。根据我们的经验，在拥有两套荧光成像系统的高效实验室中，1 L培...

单分子生物物理学是一个快速发展的领域，正在改变我们观察生命现象的方式&#160;生物现象。该领域具有独特的能力，可将物理学和化学的基本定律与&#160;生物学。荧光显微镜是一种可实现单分子灵敏度的生物物理方法。通过将生物分子与小分子有机荧光染料或量子点连接，利用荧光对其进行检测1这些分子在激光激发下可在发生不可逆光漂白前发射光子2荧光标记发生化学损伤时会出现光漂白现象&#160;从而破坏其在目标波长下激发的能力2,3活性氧（ROS）在水相缓冲液中的存在是光漂白的主要原因2,4此外，活性氧（ROS）可损伤生物分子，导致单分子实验（SM实验）中出现错误的观测结果5,6为防止氧化损伤，可使用氧气清除系统（OSS）。3,7,8葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶（GODCAT）系统在去除氧气方面具有高效性8，但会产生可能具有破坏性的过氧化物作为中间产物。这些过氧化物可能对单分子研究中关注的生物分子造成损伤。
或者，原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD）可利用其底物原儿茶酸（PCA）高效去除水溶液中的O27,9。PCD是一种金属酶，利用非血红素铁结合PCA，并以溶解态O2催化儿茶酚环的开环反应10。研究表明，该一步反应在整体上优于其他OSS系统，可提高单分子实验（SM实验）中荧光团的稳定性7。然而，许多市售的OSS酶（包括PCD）含有污染性核酸酶11，这些污染物可能导致单分子实验中所用核酸类底物的降解。本文将阐明&#160;一种基于色谱的纯化方案，用于在单分子系统中使用重组PCD。PCD可广泛应用于任何活性氧（ROS）会破坏数据采集所需底物的实验中。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>&amp;beta;机械工程</td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液，29:1</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>乙酸，冰醋酸，符合ACS标准</td><td>费希尔化学</td><td>A38C-212</td><td></td></tr><tr><td>琼脂，颗粒状</td><td>BD 生物科学</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC 系统</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>AKTA 纯化系统：Box-900、pH/C-900、UV-900、P-900 和 Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 离心滤过装置</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td>10 kDa 分子量截留值</td></tr><tr><td>六水合硫酸亚铁铵</td><td>Sigma</td><td>F-2262</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）片剂</td><td>Amresco</td><td>K833-100TABS</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 胰蛋白胨</td><td>BD 生物科学</td><td>DF0123173</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto 脱水培养基添加剂：酵母提取物瓶装</td><td>VWR</td><td>90004-092</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS丙烷&gt;≥99.0%（滴定法）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝</td><td>Amresco</td><td>0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96&amp;ndash;平底孔板&amp;ndash;底部EIA板</td><td>Bio-Rad</td><td>2240096EDU</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>PBS</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Granulated LB Broth Miller</td><td>EMD Biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率标准琼脂糖</td><td>AGTC 生物产品</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250-250G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>罗氏</td><td>11017128001</td><td></td></tr><tr><td>来自鸡蛋清的溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Amresco</td><td>0288-1KG</td><td></td></tr><tr><td>微量分光光度计，具备比色皿功能</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow（100 ml）</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Novagen BL21 感受态细胞</td><td>EMD Millipore</td><td>69-449-3</td><td>SOC 培养基包含</td></tr><tr><td>橙G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-020-25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>0754-25G</td><td></td></tr><tr><td>原儿茶酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15642110</td><td>主成分分析</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>P212121</td><td>CI-00270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 微孔板读板仪</td><td>分子装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带PES膜的无菌一次性滤器单元 &gt; 250 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>09-741-04</td><td></td></tr><tr><td>带PES膜的一次性无菌滤器单元 &gt; 500 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Superose 12 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17517301</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>0761-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris 超纯</td><td>Gojira精细化学品</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 多功能荧光成像仪</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

无核酸酶氧清除剂原儿茶酸3,4-双加氧酶的表达与纯化

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

单分子（SM）显微技术用于实时研究荧光标记生物分子的动态分子相互作用。然而，荧光基团易受溶解氧（O2）引起的光漂白影响而导致信号丢失。为防止光漂白并延长荧光基团的寿命，通常采用氧气清除系统（OSS）来降低O2浓度。市售的OSS可能被核酸酶污染，从而损伤或降解核酸，干扰实验结果的解读。本文详细描述了一种高效表达与纯化无核酸酶污染的Pseudomonas putida原儿茶酸-3,4-双加氧酶（PCD）的实验方案。PCD可通过将底物原儿茶酸（PCA）转化为3-羧基-顺,顺-粘康酸，有效清除活性O2物种。该方法适用于任何O2对数据采集产生不利影响的水相体系。与市售PCD相比，本方法在制备高活性且无核酸酶污染的PCD方面更具优势。

市售的氧气清除剂PCD常被DNA核酸酶污染。这种污染的核酸酶活性可能导致荧光实验中出现假象结果，尤其是在分析DNA或与DNA相互作用的蛋白质的研究中。我们发现，重组PCD（由六组氨酸标记的pcaH和pcaG组成的异源二聚体）可在大肠杆菌（图1）中表达。首先通过镍亲和层析纯化该异源二聚体（图2）。PCD以两种不同浓度的咪唑进行两步洗脱。通过SDS-PAGE分析层析组分。将含有近乎纯PCD的组分浓缩后，进一步通过SEC进行纯化（图3）。分别检测SEC各组分的PCA氧化活性和核酸酶活性（图4）。选择氧化活性高且无明显核酸酶活性的组分测定蛋白浓度，并保存于-80 °C冰箱中以供实验使用。
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原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD）可利用其底物原儿茶酸（PCA）在水相体系中通过酶促反应去除游离的双原子氧。本方案描述了该除氧酶的表达、纯化及活性分析方法。

单分子（SM）显微技术用于实时研究荧光标记生物分子的动态分子相互作用。然而，……

本方案可获得高活性且无可见核酸酶污染的丙酮酸脱羧酶（PCD），该酶可用于任何需去除溶液中溶解氧的实验体系。所采用的技术易于重复，且能确保产物中无核酸酶污染。首先，在离心管中加入1 µL pVP91A-pcaHG PCD表达质粒和20 µL市售的大肠杆菌BL21（E.coli BL21）。轻轻弹击离心管以混匀，将离心管置于冰上5分钟。为继续转化反应，将离心管放入42°C水浴中30秒，然后再次置于冰上2分钟。加入80 µL SOC培养基，在37°C、225 rpm条件下振荡培养1小时。接下来，将转化反应混合物倒入LB-氨苄青霉素琼脂平板上，使用涂布棒将混合物均匀涂布。盖上平板盖子，在37摄氏度下孵育16至18小时。之后，从平板上挑取一个单菌落，接种到250毫升锥形瓶中的50微升LB-氨苄青霉素培养基中。将锥形瓶置于摇床中，225 rpm、37摄氏度培养16至18小时。然后，取20毫升培养后的菌液转移至含有1升LB-氨苄青霉素的4升锥形瓶中。在37摄氏度、225 rpm条件下振荡培养。每隔一小时，取一毫升培养液加入比色皿中，使用光度计在 600 纳米波长下测定其光密度。当培养液的光密度接近 0.5 时，将测量频率增加至每 15 分钟一次，直至 OD600 达到 0.5。随后，将四升烧瓶转移至盛有冰的容器中。将烧瓶在冰浴中轻轻旋转，以降低培养物温度。将四升烧瓶转移至17摄氏度、180 rpm的培养箱中。每20分钟继续监测一次OD600。在 OD600 为 0.7 时，加入 IPTG 和硫酸铁铵六水合物储备液，使其终浓度分别为 0.5 毫摩尔和 10 毫克/升。将培养物在 180 转/分钟、17 摄氏度条件下振荡培养 18 小时。培养结束后，将培养瓶置于冰上 2 分钟。取1毫升诱导后的细胞，收集至1.5毫升聚丙烯微量离心管中，用于SDS-PAGE分析。接着，将细菌培养物倒入瓶子中，每瓶500毫升，用于离心。在4°C、3,000 × g条件下离心20分钟，收集菌体沉淀。弃去上清液。用移液器将沉淀重悬，每份沉淀分别加入12.5毫升冷PBS，并将每两份重悬液合并至一个50毫升锥形管中。再次按前述方法离心收集细胞沉淀。然后，弃去上清液，并用移液器向每根试管中加入10毫升裂解缓冲液以重悬细胞。对含有诱导细胞的试管进行超声处理后，将细菌裂解液倒入预冷的聚碳酸酯瓶中。在4°C条件下以120,000 × g离心60分钟，然后将上清液转移至预冷的50毫升锥形管中。在准备好装有镍离子螯合树脂的FPLC仪器后，以0.15毫升/分钟的流速将样品上样至柱中。用20毫升含20毫摩尔咪唑的镍缓冲液洗涤柱子。将洗涤液收集于50毫升离心管中用于后续分析。接下来，用15毫升含125毫摩尔咪唑的镍缓冲液洗涤层析柱。收集洗脱液，共19个组分，每组0.8毫升。再次用15毫升100%镍缓冲液B洗涤层析柱，并额外收集75个组分，每组0.2毫升。在12% SDS-PAGE凝胶上继续分析收集的组分，以确认PCD的存在。首先，向一个1.5毫升聚丙烯微量离心管中加入35微升反应缓冲液。在该管中，混合5微升峰值层析组分与500纳克的三干碱基对超螺旋质粒pXba。将试管置于37摄氏度水浴中孵育1小时。根据文稿制备琼脂糖凝胶后，将每种反应液各30微升加入凝胶的加样孔中。在室温下以每厘米10伏电压电泳约1小时。此时，橙色的G染料已迁移至凝胶末端。立即使用荧光扫描仪对凝胶中的溴化乙锭信号进行成像。利用信号强度与图像像素尺寸功能，测定不同DNA组分（如超螺旋、线性及切口环状DNA）的像素体积。为确定每种DNA物种的百分比，将单个DNA物种的像素体积除以所有个体物种的总像素体积。SDS-PAGE分析显示，第二个洗脱峰含有极少的蛋白质污染，代表几乎纯净的PCD异源二聚体，且核酸酶活性极低或无法检测。因此，将第二次PCD洗脱的这10个组分合并至一个5毫升的锥形管中，用于进一步分析。在4°C冷室中对PCD进行尺寸排阻色谱纯化后，于微量离心管中加入适量体积的氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）、氯化镁、二硫苏糖醇（dithiothreitol）、对氯苯胺（PCA）以及超螺旋质粒pXba，配制成5X储存液。将96孔平底板置于冰上，取10微升上述混合的5X溶液加入各孔中。在分析前立即向每孔加入10微升各自的PCD SEC组分。将酶标仪设置为37摄氏度的内部温度，然后将96孔板转移至板架中。将板架缩回仪器内，在一小时内每隔20秒测量一次290纳米处的吸光度。每次读数前，设置仪器对板进行5秒振荡。孵育一小时后，向每个孔中加入 10 µL 终止液以终止反应。对 PCD SEC 组分进行凝胶电泳。选择 PCA 氧化活性最强的组分，其特征为吸光度降低且未观察到核酸酶污染。在280纳米处测定吸光度，并根据吸光度和消光系数计算总PCD浓度。将选出的组分于-80摄氏度长期保存。本实验发现，重组PCD（即带有六组氨酸标签的pcaH与pcaG形成的异源二聚体）在大肠杆菌（E.coli）中成功表达。首先通过镍亲和层析纯化异源二聚体。吸光度以蓝色显示，镍缓冲液B的百分浓度以红色显示。流穿组分显示了未结合到镍树脂上的可溶性细菌蛋白。部分PCD在125毫摩尔咪唑存在下洗脱，但大部分蛋白质在250毫摩尔咪唑中洗脱。代表性SDS-PAGE分析表明，洗脱步骤的各组分中无污染物。核酸酶活性检测的琼脂糖凝胶结果显示，与未添加蛋白质的阴性对照以及被DNA核酸酶污染的阳性对照相比，存在污染。琼脂糖凝胶核酸酶实验中观察到的各种DNA物种的定量结果显示，第29至38组分的核酸酶活性较低，因此选择合并这些组分，浓缩后通过尺寸排阻色谱（SEC）进一步纯化。来自三个代表性SEC组分的数据表明，纯化的PCD可降低290纳米处的吸光度，表明PCA发生了氧化。通过该步骤获得的纯化PCD可用于所需的氧气清除系统，并可进一步优化。这将确定系统所需的程序性细胞死亡（PCD）的确切数量。该技术已用于延长单分子显微成像实验中荧光染料的寿命，从而允许更长时间的数据采集。所使用的超速离心机具有危险性。离心前务必确保离心机已正确平衡。溴化乙锭为有害试剂，应穿戴个人防护装备以避免接触，并按规定妥善处理。

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科研

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Biochemistry

生物化学

无核酸酶的表达和纯化原氧基质 3，4-二氧酶

利用18O标记水（LeO-工作流程）的稳定同位素标记方法是蛋白质组学定性和定量研究中的多功能工具。在蛋白酶辅助（PALeO）工作流程中，18O原子通过蛋白酶介导的蛋白水解切割和羧基氧交换反应引入。在酸催化（ALeO）工作流程中，18O原子则在低pH条件下通过羧基氧交换反应引入。...

采用18O富集水的蛋白酶及酸催化标记工作流程

我们描述了一种光催化生成过氧化氢的方案——过氧化氢是氧化转化反应的辅因子。...

光驱动酶促脱羧反应

我们提供了一种详细的方案，用于在酿酒酵母（Saccharomyces...

在Saccharomyces cerevisiae中的定向进化方法：突变文库的构建与筛选

本文介绍了一种用于制备、纯化和使用酶包封外膜囊泡（OMV）的实验方案，该囊泡可提高酶的稳定性，适用于多种不同应用。...

定向蛋白质包装至外膜囊泡中 大肠杆菌设计、生产与纯化

本文介绍了一种利用离子交换色谱法高效一步纯化无标签活性人源ten-eleven...

高效纯化及基于液相色谱-串联质谱的十一种易位-2 5-甲基胞嘧啶双加氧酶检测方法开发

本文介绍了一种在厌氧条件下进行蛋白质纯化、蛋白质浓缩以及后续利用氧电极系统进行动力学表征的实验方案。该方法以DesB酶为例进行说明，DesB是一种双加氧酶，在厌氧环境中纯化和保存时具有更高的稳定性与活性。...

通过氧电极进行厌氧蛋白质纯化与动力学分析以研究DesB双加氧酶活性与抑制作用

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植物活性氧的催化清除 体内 通过阴离子型氧化铈纳米颗粒

我们介绍了一种利用未标注来源的太平洋牡蛎样本RNA的策略，并通过与公开的基因组数据进行比对来评估其遗传物质，从而构建一个虚拟测序的cDNA文库。...

一种用于从无参考基因组的太平洋牡蛎构建虚拟测序cDNA文库的汇聚策略

本文介绍了一种利用单分子荧光共振能量转移（smFRET）研究Holliday连接体（HJ）解离的实验方案。通过双色交替激发法测定解离常数，随后在实时切割实验中应用单色时间序列smFRET，以获得HJ解离前的停留时间分布。...

单分子Förster共振能量转移方法实时研究GEN1对Holliday连接体的解析

本文介绍了一种利用酶促反应将蛋白质单体连接成具有可控序列的蛋白质聚合物，并将其固定在表面用于单分子力谱研究的实验方案。...

OaAEP1介导的聚合蛋白酶法合成及其在单分子力谱学中的固定

本文介绍了一种在C41(DE3)表达系统中过表达重组Nsp15（一种具有毒性的核酸酶）的方法，随后通过亲和层析和尺寸排阻层析纯化带标签的蛋白。这些方案可适用于其他难以表达的毒性蛋白。...

过表达并纯化一种来自 Escherichia coli 的毒性核酸酶

学习在大肠杆菌中表达和纯化原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD）的方法，用于去除水溶液中的氧气污染。该方案可获得高活性且无核酸酶污染的PCD酶，适用于单分子显微镜等生化实验。

无核酸酶氧清除剂原儿茶酸3,4-双加氧酶的表达与纯化

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