Name: 美国食品药品监督管理局追踪者在拟南芥底部水槽组织中的射击运动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 了解如何使用CFDA荧光探针在拟南芥根部和下胚轴进行加载实验，通过荧光显微镜观察羧基荧光素在植物体内的运输分布模式，从而研究植物细胞间运输机制与韧皮部活性。

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本工作由国家自然科学基金（31671257）和湖北省粮食行业协同创新中心（LXT-16-18）资助。

1. 拟南芥 MS培养基中的垂直生长
<ol>
	<li>使用前，需对超净工作台内部进行30分钟紫外照射和15分钟通风。开启紫外灯时，务必关闭玻璃门。将所有工具和培养皿用70%乙醇喷洒后，再放入工作台内。</li>
	<li>在超净工作台中，于标准的90 mm直径培养皿内配制MS（Murashige and Skoog）培养基。 
	注意：MS 培养基包含以下组分：20.6 mM NH4一氧化氮3，18.8 mM KNO₃3，1.25 mM KH2PO4，1.5 mM MgSO₄4·7H2O，3 mM CaCl2·2H2O，0.1 mM MnSO₄4·H2O，1.03 µM Na2MoO4·2H2O₂，0.1 mM H₂O₂3BO3，30 µM ZnSO₄4·7H2O，0.1 µM CuSO₄4·5H2O₂，0.1 µM CoCl₂2·6H2O₂，1.39 µM KI，97 µM FeSO₄·7H₂O2O、114.5 µM 乙二胺四乙酸（EDTA）、4.07 µM 烟酸、2.44 µM 盐酸吡哆醇、0.15 µM 盐酸硫胺素、2.68 mM 甘氨酸、555 µM 肌醇、87.7 mM 蔗糖和 10 g/L 琼脂。</li>
	<li>用灭菌的接种针或牙签轻轻接触MS培养基以润湿针尖或牙签，然后将灭菌后的种子逐个接种到每个培养皿中由播种卡标示的固定位置上。</li>
	<li>用石蜡膜和胶带密封培养皿，将其垂直放置于生长室内的透明支架上（22 °C，70% 湿度），光照周期为16小时光照、8小时黑暗（光照时间从早上6点至晚上10点）。 拟南芥 播种后第9至13天，植物即可进行CFDA负载。 
	注意：以下操作在下午2点至5点之间进行。</li>
</ol>
2. 根部切割法加载CFDA
<ol>
	<li>使用前立即配制新鲜的CFDA工作液。将保存在-20 °C冰箱中的1 mM CFDA储备液用无菌超纯水稀释至5 µM的工作浓度。</li>
	<li>将微孔石蜡膜（见材料表）切成3 mm × 3 mm的小片。</li>
	<li>在22 °C的培养室内打开正在生长的植物，用纸巾清除多余的水分，并将膜小片置于每条根下方。 
	注意：从本步骤至步骤2.6，整个操作应在15分钟内完成。</li>
	<li>将植物移至培养皿盖上，于根与下胚轴连接处下方约5–10 mm位置切断根部，再将地上部分放回培养基表面的膜上。</li>
	<li>在解剖显微镜下，小心地将0.25 µL的CFDA溶液滴加至每条根的切口末端，避免溅到植物其他部位。</li>
	<li>盖上培养皿，将植物置于生长室光照条件下孵育2–3小时（22 °C）。</li>
	<li>将染色后的植物依次在三个盛有蒸馏水的烧杯中各冲洗一次，然后在体视荧光显微镜下（放大倍数1.4x至3.3x，见材料表）观察。荧光检测时，使用高效率滤光立方体（激发光470/20 nm，分光镜495 nm，发射光525/50 nm）以接收荧光信号。</li>
</ol>
3. 下胚轴夹持法加载CFDA
<ol>
	<li>使用前立即配制新鲜的CFDA工作液。将保存在-20 °C冰箱中的1 mM CFDA储备液用无菌超纯水（见材料表）稀释至5 µM的工作浓度。</li>
	<li>将微孔石蜡膜（见材料表）切成3 mm × 3 mm大小的小片。</li>
	<li>在22 °C室内打开培养皿，暴露生长中的植株，并用纸巾清除多余水分。 
	注意：从本步骤至步骤3.7，整个操作应在15分钟内完成。</li>
	<li>将一小片膜置于每株植物根-下胚轴连接处下方。</li>
	<li>在解剖显微镜下，用镊子轻轻夹住下胚轴靠近根-下胚轴连接处的位置。</li>
	<li>在解剖显微镜下，小心地将0.1 µL CFDA滴加到伤口处，避免溅到植株其他部位。</li>
	<li>盖上培养皿，将植株置于光照条件下（22 °C）孵育2–3小时。</li>
	<li>将染色后的植株依次在三个盛有蒸馏水的烧杯中各冲洗一次，然后在体视荧光显微镜下（放大倍数1.4x至3.3x，见材料表）观察。进行荧光检测时，安装高效滤光立方体（激发光470/20 nm，分光镜495 nm，发射光525/50 nm），以传递荧光信号。</li>
</ol>

<ol><li>Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%285%29Carboxyfluorescein+as+a+tracer+of+phloem+sap+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation.</a> American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).</li>
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<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近期研究表明，植物能够快速响应外界刺激23，包括实验操作过程中引入的干扰22。在我们最初的实验中，由于忽视了这一认识，常常导致染色失败。吸取这些教训后，我们建议在进行本实验时应注意以下事项：（1）收获后的种子应保存在设定为低温低湿的储物柜中；（2）对植物的操作，特别是将其暴露于储物柜空气中，应尽量缩短时间；（3）实验条件应保持恒定，例如所有操作均应在生长室中进行。
本实验中另一个需要注意的方面是，CFDA 的上样体积应尽可能小。过量的溶液常会导致产生假象，多余的 CFDA 溶液可通过毛细作用扩散至地上部分，从而使幼嫩库叶的毛状体着色。尽管成像前进行洗涤步骤可减轻这种假象，但最佳做法仍是上样最小必要量，以避免过量溶液带来的干扰。
在解决这些技术注意事项后，可以稳定地观察到CFDA从根到茎的运输过程，如图2所示。当植物生长至较老阶段（例如超过24天），拟南芥（Arabi...

目前已开发并应用于植物中以监测共质体运输和韧皮部活性的荧光示踪剂种类繁多，具有不同的光谱特性，例如5(6)-羧基荧光素（CF）1、8-羟基芘-1,3,6-三磺酸2、荧光黄CH（LYCH）3、七叶苷和CTER4。通常将共质体染料加载至目标组织的切口处，随后观察报告分子在植物其他部位的依次扩散，从而揭示细胞间的通讯情况。尽管染料吸收机制尚未完全阐明，但CF在活细胞内运输的基本原理已被广泛认可。CF的酯化形式（CF二乙酸酯，CFDA）本身无荧光且可穿透膜。该特性使得染料能够快速通过膜扩散进入细胞。一旦进入活细胞，细胞内的酯酶会切除CFDA在3'和6'位点的乙酰基团，释放出具有荧光且不可穿透膜的CF（图1，另见Wright等人的研究2）；随后CF可通过胞间连丝迁移至植物的其他部位。
使用CFDA进行实验是一种成熟的方法，可将其加载到源叶中，用于监测多种物种韧皮部的物质运输及在库组织中的卸载过程，例如拟南芥（Arabidopsis）根中的CF卸载5、马铃薯块茎形成过程中的韧皮部卸载6、烟草（Nicotiana）库叶中的韧皮部卸载7等。通过类似的加载方法，其他研究也利用该染料来证明寄主与寄生植物之间的共质体连接8,9，或揭示共生关系10,11。
利用这种染料的另一种方法是通过显微注射将其导入特定细胞或单个细胞，以确定其分布模式。这类精密技术极大地促进了我们对胞间连丝介导的细胞间通讯的深入理解，尤其是在共质体结构域概念的发展方面12,13。例如，将CFDA显微注射到拟南芥（Arabidopsis）子叶细胞中，结果染料在下胚轴表皮细胞中发生耦合扩散，但在其下方的细胞或根表皮细胞中则不发生耦合，因此下胚轴表皮构成了一个共质体结构域14。通过显微注射技术，已鉴定出多个类似的结构域，如气孔保卫细胞15、筛管-伴胞复合体16、根毛细胞14以及根冠17,18。最令人惊讶的是，某些结构域允许示踪分子朝特定方向移动。以毛状体结构域为例，将荧光探针注射到支撑性的表皮细胞中，示踪物可流入毛状体结构域，但反向注射则无法实现该流动19。最近一项研究也在景天科（Sedum）胚胎的共质体结构域中发现了类似现象20。因此，上述所有案例表明，更换染料加载位点可能为共质体通讯研究带来新的见解。我们先前一项旨在解析根部至地上部分可移动沉默信号传递路径的实验，鉴定出一个新的共质体结构域，即下胚轴-上胚轴连接区（HEJ区），并通过根部加载（非经典源-库加载）CFDA实验进一步验证了该区域的存在21。在此，我们通过一种简便方法进一步阐明了CF从根到茎的移动过程，并通过改变加载位点重新发现了一个潜在的共质体结构域。此外，该方法还可用于区分在根至地上部长距离运输方面存在差异的遗传背景。

<table><tbody><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>肌醇&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>烟酸&amp;nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>盐酸吡哆醇</td><td>MACKLIN</td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>盐酸硫胺素</td><td>MACKLIN</td><td>T818865</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>MACKLIN</td><td>G800880</td><td></td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>Novon</td><td>ZZ14022</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom V16</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200&amp;mu;l 移液器</td><td>Dragon Laboratory Instruments</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2.5&amp;mu;l 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子&amp;nbsp;</td><td>TWEEZERS</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>封口膜</td><td>PARAFILM</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢双面刀片</td><td>Gillette</td><td>Platinum-Plus Double-Edge Blade</td><td></td></tr></tbody></table>

拟南芥底部库组织中加载cfda示踪剂的向顶运输

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

同质体示踪剂5(6)-羧基荧光素二乙酸盐（CFDA）已广泛应用于活体植物中，以示踪细胞间连接、韧皮部运输及维管组织模式。本实验方案分别采用根部切断法和下胚轴夹压法，展示羧基荧光素（CF）在拟南芥（Arabidopsis）中由下向上的运输过程。这两种不同的处理方法导致CF运输效率存在差异：采用下胚轴夹压法时，约91%的植株地上部分可检测到CF；而采用根部切断法时，仅有约70%的植株地上部分出现CF。仅改变染料加载位点即引起该同质体染料运输效率的显著变化，提示CF的运输可能受到同质体调控机制的影响，最可能的调控部位为根与下胚轴交界区。

共质体运输常受环境波动的影响。植物生长状态的扰动，甚至组织制备过程本身，都会影响胞间连丝的大小排阻极限，从而影响共质体运输22。为了提高染色效率，我们将在生长室中进行操作，严格控制温度和湿度，并尽可能快速完成整个实验流程（理想情况下，在打开培养皿盖后10–15分钟内完成）。实验过程中采取这些预防措施，可有效降低茎尖染色失败率。
我们描述了两种略有不同的方法以展示CF向茎部的移动。通常情况下，两种方法均能在施加染料约2小时后在茎中观察到CF染色（图2）。然而，这两种方法产生的染色效率不同。下胚轴夹伤法的染色效率为91%，而根切断法为70%（Welch's t-检验，p &lt; 0.001）（图3）。我们还尝试通过根部夹伤法加载染料，发现其染色效率较根切断法更低，表明根部...

本实验方案的目的是展示如何将CFDA加载到微流控芯片底部不同位点 拟南芥然后我们展示了CF在茎中的分布模式结果。

拟南芥底部库组织中加载CFDA示踪剂的向顶运输

活体植物中用于示踪共质体的染料5(6)-羧基荧光素二乙酸酯（CFDA）已被广泛应用于展示细胞间连接，……

广泛使用的探针CFDA，即羧基荧光素二乙酸酯（carboxyfluorescein diacetate），本身不具荧光。该化合物上的两个H3基团及3'6'位点使其具有膜通透性。一旦进入细胞，细胞内的酯酶将水解去除乙酸基团，释放出CFDA的新的荧光形式。这是一种羧基荧光素（CF），具有荧光特性。由于这种新形式的膜通透性较低，其分子主要通过细胞间的孔道，即植物中的胞间连丝进行移动，这使得该二乙酸盐成为研究韧皮部活动中细胞间运输的理想探针。在本视频中，我们将分别演示将CFDA加载到拟南芥植物的根部和下胚轴中的过程，并展示这两种略有不同的操作步骤如何影响该荧光探针从底部向顶部的运输过程。为了稳定获得染色结果，我们将收获的拟南芥种子储存在4摄氏度、40%湿度的培养柜中。在此条件下储存超过七天的新收获种子可直接用于播种。为确保每株植物在培养皿中生长的空间相对一致，我们使用种子分区定位卡。现在，将灭菌后的枪头润湿，蘸取灭菌后的种子，逐粒将种子接种到指定位置。播种完成后，用封口膜和胶带密封培养皿，并将其放置在培养皿架上，使其垂直生长。以下是本实验中将要使用的工具。请注意，我们最好尽快完成染料的加载。通常情况下，整个过程应在10到15分钟内完成。在进行CFDA加载实验之前，我们始终要配制新鲜的CFDA溶液。此处，将1毫摩尔的CFDA用水稀释至5微摩尔浓度，现配现用。将封口膜切成3毫米×3毫米大小的小片。由于培养皿的盖子和底部有冷凝水，需用纸巾擦干，以防止染料扩散流动。将一小块Parafilm放在根部下方。提起植株并放置在盖子上。在子叶下方约5至10毫米处切断根部。将茎段放回到小块的石蜡膜上。现在小心地将一微升 CFDA 滴加到根的切端。注意避免污染所有原生植株。然后盖上盖子，将样品置于培养室中静置两小时。下胚轴夹捏法。将预先准备好的小块封口膜置于根与下胚轴连接处下方。我们使用镊子轻轻夹住靠近根组织的下胚轴，并在夹住的一侧小心地施加 0.1 µL CFDA，然后将植物放置两小时。照片拍摄于染色后 9 至 12 天的植株，均显示子叶和真叶中的维管组织染色模式。仅在极少数情况下，子叶出现半叶染色模式。因此基本上，两种方法在CF染色模式上并无差异；然而，当我们对越来越多的植株进行染料加载时，发现这两种操作在效率上存在显著差异。采用根部切割法时，约70%的植株在茎叶部分显示出荧光信号。但采用下胚轴夹压法可将效率提高至91%。我们也尝试了根部夹压法，但该方法的效率更低，约为30%。因此，染料加载方式似乎并不能解释染色差异。这种差异很可能在于加载位点的不同，而这些位点可能被共质体屏障所分隔。我们展示了如何将CFDA加载到拟南芥的根和下胚轴中。我们采用了两种略有不同的操作步骤，这两种略有不同的步骤导致了探针从底部向顶部移动的显著差异。我们建议，该方法可能有助于我们鉴定根部向地上部分传递信号的潜在共质体屏障。

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