拟南芥底部库组织中加载CFDA示踪剂的向顶运输

广泛使用的探针CFDA，即羧基荧光素二乙酸酯（carboxyfluorescein diacetate），本身不具荧光。该化合物上的两个H3基团及3'6'位点使其具有膜通透性。一旦进入细胞，细胞内的酯酶将水解去除乙酸基团，释放出CFDA的新的荧光形式。

这是一种羧基荧光素（CF），具有荧光特性。由于这种新形式的膜通透性较低，其分子主要通过细胞间的孔道，即植物中的胞间连丝进行移动，这使得该二乙酸盐成为研究韧皮部活动中细胞间运输的理想探针。在本视频中，我们将分别演示将CFDA加载到拟南芥植物的根部和下胚轴中的过程，并展示这两种略有不同的操作步骤如何影响该荧光探针从底部向顶部的运输过程。

为了稳定获得染色结果，我们将收获的拟南芥种子储存在4摄氏度、40%湿度的培养柜中。在此条件下储存超过七天的新收获种子可直接用于播种。为确保每株植物在培养皿中生长的空间相对一致，我们使用种子分区定位卡。

现在，将灭菌后的枪头润湿，蘸取灭菌后的种子，逐粒将种子接种到指定位置。播种完成后，用封口膜和胶带密封培养皿，并将其放置在培养皿架上，使其垂直生长。以下是本实验中将要使用的工具。

请注意，我们最好尽快完成染料的加载。通常情况下，整个过程应在10到15分钟内完成。在进行CFDA加载实验之前，我们始终要配制新鲜的CFDA溶液。

此处，将1毫摩尔的CFDA用水稀释至5微摩尔浓度，现配现用。将封口膜切成3毫米×3毫米大小的小片。由于培养皿的盖子和底部有冷凝水，需用纸巾擦干，以防止染料扩散流动。

将一小块Parafilm放在根部下方。提起植株并放置在盖子上。在子叶下方约5至10毫米处切断根部。

将茎段放回到小块的石蜡膜上。现在小心地将一微升 CFDA 滴加到根的切端。注意避免污染所有原生植株。

然后盖上盖子，将样品置于培养室中静置两小时。下胚轴夹捏法。将预先准备好的小块封口膜置于根与下胚轴连接处下方。

我们使用镊子轻轻夹住靠近根组织的下胚轴，并在夹住的一侧小心地施加 0.1 µL CFDA，然后将植物放置两小时。照片拍摄于染色后 9 至 12 天的植株，均显示子叶和真叶中的维管组织染色模式。

仅在极少数情况下，子叶出现半叶染色模式。因此基本上，两种方法在CF染色模式上并无差异；然而，当我们对越来越多的植株进行染料加载时，发现这两种操作在效率上存在显著差异。采用根部切割法时，约70%的植株在茎叶部分显示出荧光信号。

但采用下胚轴夹压法可将效率提高至91%。我们也尝试了根部夹压法，但该方法的效率更低，约为30%。因此，染料加载方式似乎并不能解释染色差异。这种差异很可能在于加载位点的不同，而这些位点可能被共质体屏障所分隔。

我们展示了如何将CFDA加载到拟南芥的根和下胚轴中。我们采用了两种略有不同的操作步骤，这两种略有不同的步骤导致了探针从底部向顶部移动的显著差异。我们建议，该方法可能有助于我们鉴定根部向地上部分传递信号的潜在共质体屏障。