Name: 原子力显微镜罐体功能化,具有单T细胞或单粒子免疫单细胞力光谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学习原子力显微镜悬臂功能化技术，使用单T细胞或固体颗粒研究树突状细胞与T细胞相互作用及巨噬细胞实时响应。该方法采用生物相容性胶水保持T细胞基线活化状态，为免疫突触形成等复杂细胞间事件提供深入见解。

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本工作得到国家自然科学基金面上项目（31370878）、重点项目（31630023）和创新研究群体项目（81621002）的资助。

小鼠实验方案遵循清华大学的动物护理指南
1. 使用单个T细胞对悬臂梁进行功能化修饰
<ol>
	<li>小鼠脾细胞制备
	<ol>
		<li>使用二氧化碳处死小鼠（8-16周龄，性别不限；例如C57BL/6品系），随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>用75%乙醇清洁小鼠，沿中线做皮肤切口，随后进行脾脏切除术。</li>
		<li>使用玻片在含有2%胎牛血清（FBS）的4 mL PBS中研磨脾脏组织，并将细胞悬液通过70 μm尼龙筛网过滤，以去除细胞团块和碎片。</li>
		<li>将细胞悬液在500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液，加入2 mL室温平衡的红细胞裂解缓冲液重悬细胞，裂解5分钟。加入8 mL PBS溶液终止裂解反应。</li>
		<li>将细胞悬液在500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液，用含2% FBS和1 mM EDTA的PBS重悬细胞至密度为1 x 108 个细胞/mL（标记为溶液A），体积通常为0.25-2 mL，具体取决于细胞密度。将重悬的细胞转移至5 mL（12 x 75 mm）聚苯乙烯圆底管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠CD4+ T细胞制备
	<ol>
		<li>向步骤1.1.5获得的细胞样品中加入50 μL/mL大鼠血清（见材料表）和50 μL/mL CD4+ T细胞分离试剂盒（见材料表）。混匀后室温孵育10分钟。</li>
		<li>将链霉亲和素包被的磁性颗粒原液（见材料表）涡旋振荡30秒，或直至颗粒均匀分散。</li>
		<li>向细胞样品中加入75 μL/mL链霉亲和素包被的磁性颗粒。混匀后室温孵育2.5分钟。</li>
		<li>加入溶液A将细胞样品体积补至2.5 mL，并通过轻柔吹打2-3次混匀。</li>
		<li>将样品管（不加盖）放入磁架（见材料表）中，室温孵育5分钟。小心将富集后的细胞悬液倒入新的5 mL聚苯乙烯圆底管中。</li>
		<li>将细胞悬液在500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液，用500 μL溶液A重悬富集的T细胞。 
		注：富集的CD4+ T细胞包含常规T细胞和调节性T细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从常规T细胞中分离调节性T细胞
	<ol>
		<li>向步骤1.2.6获得的富集T细胞样品中加入25 µL FcR阻断剂（见材料表）。混匀后室温孵育5分钟。</li>
		<li>向T细胞样品中加入25 μL调节性T细胞阳性选择试剂盒（见材料表）。混匀后室温孵育10分钟。</li>
		<li>向T细胞样品中加入10 μL PE选择试剂盒（见材料表）。混匀后室温孵育5分钟。</li>
		<li>将葡聚糖包被的磁性颗粒原液（见材料表）涡旋振荡30秒，或直至颗粒均匀分散。</li>
		<li>向T细胞样品中加入10 μL葡聚糖包被的磁性颗粒。混匀后室温孵育5分钟。</li>
		<li>加入溶液A将T细胞样品体积补至2.5 mL，并通过轻柔吹打2-3次混匀。</li>
		<li>将T细胞样品管（不加盖）放入磁架中，室温孵育5分钟。小心将上清液倒入新管中。 
		注：上清液中含有富集的常规CD4+T细胞。</li>
		<li>将富集的常规CD4+T细胞在500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液，用4 mL含10% FBS、0.05 mM β-巯基乙醇、0.01 M HEPES和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养基重悬细胞（标记为培养基B）。</li>
		<li>从磁架上取下含有富集调节性T细胞的管子，加入2.5 mL溶液A，轻柔吹打2-3次混匀。将管子重新放回磁架，孵育5分钟，然后小心倾去并弃去上清液。重复此步骤三次。</li>
		<li>用2 mL培养基B重悬富集的调节性T细胞。</li>
		<li>将纯化的常规T细胞和调节性T细胞均在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中，用100 U/mL人IL-2孵育过夜或至少4小时，之后用于悬臂梁功能化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>树突状细胞制备
	<ol>
		<li>配制piranha溶液，即30% H2O2（30%）与70% H2SO4（浓）按体积比（v/v）混合。在持续搅拌和冷却条件下，缓慢将3 mL H2O2倒入7 mL H2SO4中。 
		注意：Piranha溶液具有极强腐蚀性，可灼伤并破坏人体组织。因此，使用时应在通风橱内操作并佩戴适当的安全防护装备，以防溶液飞溅。使用后需用NaOH中和至pH 7。</li>
		<li>将直径为24 mm的玻璃盖玻片浸入piranha溶液中30分钟，随后用无菌超纯水彻底冲洗。</li>
		<li>将一对尖头镊子浸入75%乙醇中30分钟进行低温消毒。</li>
		<li>用镊子将清洗后的玻璃盖玻片转移至6孔培养板中。</li>
		<li>倾斜预先用4 mL培养基B培养DC2.4细胞的6 cm塑料培养皿，吸除全部培养基。向培养皿中加入2 mL PBS冲洗DC2.4细胞，弃去PBS。重复此冲洗步骤两次。</li>
		<li>向培养皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，消化2分钟。加入1 mL培养基B终止酶消化反应。将消化后的细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>将细胞悬液在500 x g条件下离心5分钟，用培养基B重悬DC2.4细胞至密度为2 x 105 个细胞/mL。</li>
		<li>将DC2.4细胞接种于步骤1.4.4制备的玻璃盖玻片上，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养过夜。 
		注：为测量两个单细胞之间的相互作用力，需使用相对较低浓度的DC2.4细胞（即<10%汇合度），以确保细胞间有适当间距。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原子力显微镜（AFM）悬臂梁制备 
	注：适用于单细胞力谱实验的悬臂梁应具有较低的弹簧常数，通常在0.01-0.06 N/m范围内。此处优先选用无探针的软质悬臂梁，用于单细胞和单个固体颗粒的功能化。
	<ol>
		<li>通过piranha处理、等离子体或紫外-臭氧清洗法清洁悬臂梁。</li>
		<li>将清洁后的悬臂梁安装至AFM扫描头。</li>
		<li>准备一个装有纯水的洁净样品池，并在水溶液中校准悬臂梁：首先在玻璃基底上运行力-距离曲线，获得灵敏度（接近曲线排斥段线性拟合的斜率），然后记录热噪声谱，根据AFM说明书提取弹簧常数。</li>
		<li>将AFM扫描头从溶液中取出，用几滴纯乙醇清洗已安装的悬臂梁，并保持悬臂梁在扫描头上干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将单个T细胞固定至悬臂梁
	<ol>
		<li>预热活细胞环境腔体，设置为37 °C、5% CO2。</li>
		<li>将步骤1.4.8中培养有DC2.4细胞的玻璃盖玻片安装至样品池组件，立即向池中加入600 µL培养基B，然后将组件置于AFM样品台上。</li>
		<li>向样品池中加入经hIL-2孵育的CD4+T细胞（常规或调节性T细胞均可）。 
		注：总样品体积不应超过1 mL。</li>
		<li>等待加入的CD4+T细胞完全沉降到盖玻片底部。 
		注：气泡会对实验造成严重干扰，因此在步骤1.6.2和1.6.3中应避免产生任何气泡。</li>
		<li>用移液器向已安装的悬臂梁末端加入2 μL生物相容性胶水（如图1所示），然后迅速将扫描头放回样品台，使涂有生物相容性胶水的悬臂梁浸入溶液中。 
		注意：切勿用移液器尖端触碰玻璃块或悬臂梁。由于此处使用的生物相容性胶水在空气中易氧化，此步骤应尽快完成。</li>
		<li>在显微镜下粗略定位悬臂梁尖端下方的一个健康T细胞，通过移动样品台进行初步定位，再通过移动扫描头进行精细调整。 
		注：健康的CD4+T细胞通常体积较大、边缘光滑，在明场成像下具有较好的光学通透性。</li>
		<li>通过控制步进电机，手动降低悬臂梁，步长从50 μm开始，逐步减小至10、5、2和0.5 μm。当悬臂梁与目标T细胞牢固接触时（由光电探测器上激光束位置的微小位移指示，对应典型作用力范围为0.5-1.5 nN），保持步进电机位置，并调整扫描头位置，使悬臂梁尖端与细胞对齐更佳。 
		注：此步骤也可通过运行单次力测量实现，其中设定点（施加于细胞的力）和接触时间可在软件中明确定义。但由于T细胞本身非黏附性较强，手动操作在控制瞄准、定位和接触时间方面比自动接近更具灵活性，且对T细胞黏附效果更可靠。未来的研究者应尝试手动和自动接近两种方法，以确定哪种更适合其研究体系。</li>
		<li>接触30秒后收回悬臂梁。 
		注：若细胞随悬臂梁移动，则固定成功；否则，重复步骤1.6.6，更换另一个T细胞进行尝试。由于生物相容性胶水易氧化，步骤1.6.5至1.6.7应在5分钟内完成。此外，若同一悬臂梁连续三次T细胞固定失败，应更换新的悬臂梁，并从步骤1.5.2重新开始固定程序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="生物相容性胶水装置示意图；玻璃块上带有移液器尖端和弹簧，用于精确施加。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59609/59609fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：将少量生物相容性胶水滴加到固定悬臂梁上的示意图。 悬臂梁通过夹紧弹簧固定在安装于原子力显微镜（AFM）扫描头上的玻璃块支架上（本图未绘制扫描头）。当扫描头置于水平表面时，悬臂梁呈垂直方向，如图所示。使用微量移液器可在悬臂梁尖端加入约 2 µL 的生物相容性胶水。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59609/59609fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="7">
	<li>单对T细胞/树突状细胞相互作用的力谱学研究 
	注意：为了研究细胞/细胞相互作用，需使用Z轴范围大于常规10-15 μm 需要完全分离两个细胞。此处使用的原子力显微镜（AFM）具有Z轴范围 100 μm足以在细胞间接触后将T细胞与树突状细胞分离
	<ol>
		<li>将连接的T细胞通过移动样品台和/或扫描头定位在另一个DC2.4细胞上方（参见 图2).</li>
		<li>设置合适的参数并运行力谱学实验。 
		注意：通常使用的以下关键参数：设定值 0.5 nN，拉伸长度 50 μm，Z轴运动恒定速度，延伸速度 5 μm/s，接触时间10 s，延迟模式为恒定力。每对T-DC重复采集20条力曲线，至少使用14条力曲线进行后续分析。</li>
		<li>安装一个新的经清洁的悬臂梁，按照步骤1.5.3在纯水中进行校准，然后返回同一T-DC细胞样品，对不同的T-DC细胞对重复步骤1.6和1.7。每种条件下至少检测5对细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="生物相容性胶水实验；组织（T）与树突状细胞（DC）黏附的示意图和显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59609/59609fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：单个T细胞与DC之间力学探测的实验配置。（A）实验配置示意图，其中附着在悬臂梁上的T细胞被移向生长在基底上的DC，以进行力学探测。（B）功能化了T细胞的悬臂梁与DC的明场图像。比例尺，20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59609/59609fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 使用单个聚苯乙烯微球对悬臂梁进行功能化修饰
<ol>
	<li>单个微珠的制备
	<ol>
		<li>将6 μm聚苯乙烯微珠的储备悬浮液用100%乙醇稀释。 
		注意：稀释后的微珠溶液浓度应足够低，以便滴加到玻璃盖玻片表面后，在溶剂蒸发后各个微珠之间充分分离，无明显聚集。</li>
		<li>用乙醇清洗直径为24 mm的玻璃盖玻片，并用N2气流去除灰尘。</li>
		<li>将清洗后的玻璃盖玻片安装至样品腔组件上，并将组件置于显微镜载物台上。</li>
		<li>将一滴稀释后的微珠溶液滴加到盖玻片左侧靠近中心的位置（见图3），然后在显微镜20倍物镜下明场模式中观察溶剂蒸发后微珠之间的间距。若微珠彼此充分分离，则进行下一步操作。</li>
		<li>将微量移液器吸头或牙签浸入充分混合的环氧树脂胶中，然后通过连续轻触的方式，将少量胶液转移至盖玻片右侧靠近中心的三个不同位置。 
		注意：三个胶点应呈垂直排列（见图3）。最后一个胶点所含胶量最少，将在后续步骤中使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="微珠操作示意图；探针前后移动；环氧树脂扩增过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59609/59609fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：悬臂梁上单个微珠功能化的流程示意图。 在基底左侧制备分散良好的微米级微珠，通过三次轻柔接触将微量环氧胶转移至基底右侧，形成三个胶点。仅使用最后一次接触形成的、胶量最少的胶点（以圆圈标示）来涂覆悬臂梁的最末端。从左侧将悬臂梁接近胶点，浸入胶中后向后移动悬臂梁，使胶液局限于悬臂梁末端。将目标微珠移至悬臂梁下方并进行精确对准，随后施加牢固接触（通常为2–5 nN），实现微珠的粘附。当微珠成功固定于悬臂梁上后，可安装新的悬臂梁以开始下一轮功能化循环。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59609/59609fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>原子力显微镜悬臂梁制备
	<ol>
		<li>将清洁的无针尖悬臂梁安装到原子力显微镜扫描头。</li>
		<li>在空气中使用洁净表面校准该悬臂梁，以获得其弹簧常数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将单个微珠连接至悬臂梁
	<ol>
		<li>将悬臂梁针尖定位在最后一个环氧胶点左侧边界处，如图3所示。</li>
		<li>通过以小步长降低步进电机，缓慢将悬臂梁靠近胶体。</li>
		<li>当针尖浸入胶中后，手动向后（向左）移动原子力显微镜扫描头，横向快速将悬臂梁从胶中拉出。 
		注意：确保仅有极少量胶体附着在针尖最末端。若针尖上胶体过多，可通过将针尖接触并滑过空白表面来减少胶量。</li>
		<li>将悬臂梁针尖移至一个孤立良好的单个微珠上方。</li>
		<li>缓慢接近该单个微珠，并与微珠牢固接触（由光电探测器中激光束位置的位移指示，对应典型作用力范围为2–5 nN），持续约10秒；在此期间，横向微调针尖位置有助于将微珠更准确地定位在针尖末端。接触结束后将针尖回撤。 
		注意：若原焦平面上的微珠完全消失，表明已成功黏附。</li>
		<li>小心拆下修饰有微珠的悬臂梁，并将其置于悬臂梁盒中过夜，使胶体充分固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用原子力显微镜递送单个微珠后，巨噬细胞细胞反应的荧光成像。 
	注意：荧光成像在基于商用显微镜支架搭建的自制物镜型全内反射荧光显微镜上进行。该成像系统配备4种激光光源（405 nm、488 nm、561 nm、647 nm）、双色检测分光器以及电子倍增电荷耦合器件（EMCCD），用于宽场成像。
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中，将RAW264.7细胞培养于玻璃盖玻片上。</li>
		<li>使用转染试剂盒（见材料表），按照制造商说明书将Moesin-EGFP和PLCδ-PH-mCherry转染至RAW264.7细胞，分别用于荧光标记Moesin和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）分子。 
		注意：Moesin含有ITAM基序，可激活吞噬作用中的关键分子Syk。PIP2已知可招募Moesin至细胞膜。</li>
		<li>将带有细胞的玻璃盖玻片放入样品腔组件中，并将组件安装至原子力显微镜样品台。</li>
		<li>将修饰有微珠的悬臂梁安装至原子力显微镜扫描头。</li>
		<li>在无细胞区域运行力曲线，并利用该曲线的灵敏度及步骤2.2.2中测得的弹簧常数进行力的校准。</li>
		<li>在488/561 nm激发下，寻找在绿色（Moesin-EGFP）和红色（PLCδ-PH-mCherry）通道均具有适当荧光强度的孤立良好细胞。</li>
		<li>使用原子力显微镜以1 nN恒定作用力和500秒接触时间，将裸露的6 μm聚苯乙烯微珠递送至细胞表面。</li>
		<li>记录细胞与微珠接触过程中的荧光图像序列以供分析（通常为10帧/秒）。 
		注意：为减少荧光染料的光漂白，在寻找目标细胞时应使用相对较低的激发光功率。此外，若细胞反应动力学过程较慢，可采用间歇性激发方案以延长荧光信号的可观测时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于原子力显微镜的单细胞力谱技术已发展成为研究活细胞生物物理特性的有力工具。在这些应用中，需对悬臂梁进行适当的修饰，以探测目标细胞上的特定相互作用或特性。本文分别描述了将单个T细胞和单个微米级小球连接至无针尖悬臂梁的方法。为将单个T细胞固定在悬臂梁上，选用一种生物相容性胶体作为细胞黏附剂。该胶体是一种从海洋贻贝中提取的特制蛋白质溶液，其黏附性来源于多酚类残基，这些残基上的羟基可非特异性地与细胞表面暴露的残基形成氢键。这种结合方式通常不会干扰被结合细胞的正常细胞功能。为了实现良好的黏附效果，待固定细胞的状态也至关重要。以新纯化的鼠源CD4+ T细胞为例，必须先用重组人IL-2处理过夜，方可用于悬臂梁的功能化修饰；否则，细胞会迅速发生死亡。若细胞状态不佳，即使能够成功附着于悬臂梁，在经历数次力探测循环后也极可能因黏附强度较弱而脱落，导致力测量实验失败率升高。这种生物相容性胶体的缺点是易发生氧化，因此偶联操作应尽快完成，这对操作者而言有时具有挑战性。为减少该胶体的氧化，强烈建议将30 µL分装液置于充满N₂的冷冻管中保存2 来自N₂储备液的气体2 空气环境并储存在液氮中2 以获...

原子力显微镜（AFM）作为一种多功能工具，已在细胞生物学研究中得到广泛应用1,2,3,4,5。除了具备高分辨率成像能力外，其固有的力探测功能还可在单细胞水平上直接原位研究活细胞的生物物理特性6,7，包括亚细胞结构甚至整个细胞的刚度8,9,10,11,12、细胞表面单分子水平上的特异性配体/受体结合强度13，以及单个颗粒与细胞之间或两个细胞之间的黏附力1,2,14,15。后两者通常被归类为单细胞力谱技术（SCFS）16。由于可方便获得具有不同弹簧常数的微悬臂梁，AFM 可测的力范围相当宽，从几皮牛顿（pN）到微牛顿（µN），足以覆盖从几十皮牛顿（如受体介导的单分子结合）到纳牛顿（如吞噬性细胞事件）等各类细胞力学过程所涉及的力范围15。这一宽广的动态力范围使 AFM 相较于其他力探测技术（如光镊/磁镊和生物膜力探针）更具优势，因为后者更适用于弱力测量，通常测量力小于 200 pN17,18。此外，AFM 还可作为高精度操纵器，以时空可控的方式向单个细胞施加多种刺激4,19，这对于实时单细胞激活研究非常有利。结合活细胞荧光成像技术，可以同时监测细胞对特定刺激的响应，从而使基于 AFM 的 SCFS 与光学成像相结合，成为研究细胞信号转导的实用而强大的工具。例如，已有研究利用 AFM 确定引发成骨细胞钙瞬变所需的应变程度20，该研究中，在使用 AFM 探针对培养的成骨细胞施加局部力后，通过钙离子比率荧光成像技术追踪钙瞬变。最近，AFM 还被用于拉伸培养肝星状细胞（HSC）的胶原原纤维，并通过荧光 Src 生物传感器实时监测这种力学转导引起的 HSC 激活过程；该生物传感器的磷酸化水平由其荧光强度表示，且与 HSC 的激活状态相关3。
在基于原子力显微镜的单细胞力谱（AFM-SCFS）实验中，AFM悬臂梁的适当功能化是实现成功测量的关键步骤。由于我们的研究重点在于免疫细胞的活化，我们通常将可引发吞噬作用和/或强烈免疫反应的颗粒物质4,14,15，以及能够与抗原呈递细胞（如活化的树突状细胞（DC））形成免疫突触的单个T细胞2，固定在悬臂梁上。单个固体颗粒通常通过环氧胶在空气中与悬臂梁连接，而由于T细胞本身不具备黏附性，因此需在溶液中利用生物相容性胶将单个T细胞固定于悬臂梁上。本文描述了上述两种悬臂梁修饰方法，并提供了两个相关应用实例。第一个应用是利用AFM-SCFS探测T细胞与DC之间的相互作用，从细胞力学角度理解调节性T细胞的抑制机制。第二个应用是将AFM与活细胞荧光成像相结合，实时监测巨噬细胞对固体颗粒的细胞反应，以揭示受体非依赖性的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）-Moesin介导的吞噬作用的分子机制。本实验方案旨在为有志于开展基于AFM的单细胞分析用于免疫学研究的科研人员提供一个参考框架。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l 移液器吸头</td><td>Thermo Fisher</td><td>104-Q</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 直径培养皿</td><td>NALGENE nunc</td><td>150462</td><td></td></tr><tr><td>6 孔培养板</td><td>JET</td><td>TCP011006</td><td></td></tr><tr><td>AFM 悬臂梁</td><td>NanoWorld</td><td>Arrow-TL1-50</td><td>无针尖悬臂梁</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>7604</td><td></td></tr><tr><td>生物相容性胶水</td><td>BD Cell-Tak</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T 细胞分离试剂盒</td><td>STEMCELL</td><td>19852C.1</td><td></td></tr><tr><td>DC2.4 细胞系</td><td>由 K. Rock（美国马萨诸塞大学医学院，伍斯特，MA）惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖包被磁性颗粒</td><td>STEMCELL</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GENEray</td><td>Generay-E1101-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>ERGO</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>twbio</td><td>00019</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Ex Cell Bio</td><td>FSP500</td><td></td></tr><tr><td>FcR 阻断剂</td><td>STEMCELL</td><td>18731</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>本地供应商（海门联升）</td><td>HX-E37</td><td>直径 24 mm，厚度 0.17 mm</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>海门金通实验室与设备管理科&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>定制</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;(30%)</td><td>国药集团</td><td>10011218</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>国药集团</td><td>80120892</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>磁铁</td><td>STEMCELL</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>尼龙网筛</td><td>BD Falcon</td><td>REF 352350</td><td></td></tr><tr><td>Moesin-EGFP</td><td>N/A</td><td></td><td>实验室克隆</td></tr><tr><td>小鼠 CD25 Treg 细胞阳性分离试剂盒</td><td>STEMCELL</td><td>18782</td><td>组分：FcR 阻断剂、调节性 T 细胞阳性选择试剂、PE 选择试剂、Dextran RapidSpheres</td></tr><tr><td>小鼠 CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T 细胞分离试剂盒</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td>组分：CD4+ T 细胞分离试剂、链霉亲和素 RapidSpheres、大鼠血清</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>北京兰谊化学产品有限公司</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1022-500</td><td></td></tr><tr><td>PE 选择试剂</td><td>STEMCELL</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>PLC&amp;delta;-PH-mCherry</td><td>Addgene</td><td>36075</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球 6.0&amp;mu;m</td><td>Polysciences</td><td>07312-5</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯圆底管</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>大鼠血清</td><td>STEMCELL</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>&amp;nbsp;ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组人白细胞介素-2</td><td>Peprotech</td><td>Peprotech, 200-02-1000</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>碧云天</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>调节性 T 细胞阳性选择试剂</td><td>STEMCELL</td><td>18782C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>样品室</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素包被磁性颗粒</td><td>STEMCELL</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂盒</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>JD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x 物镜 NA 0.8</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901</td><td>Plan-Apochromat</td></tr><tr><td>原子力显微镜</td><td>JPK</td><td>cellHesion200</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman coulter</td><td>Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>荧光成像系统</td><td>基于 Zeiss 显微镜支架自制的物镜型全内反射荧光显微镜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Fisher</td><td>HERACELL 150i</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Observer A1 手动型</td><td></td></tr></tbody></table>

原子力显微镜悬臂的功能化：负载单个t细胞或单颗粒用于免疫学单细胞力谱分析

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

基于原子力显微镜的单细胞力谱技术（AFM-SCFS）是研究活细胞生物物理特性的有力工具。该技术可用于探测活细胞膜上的相互作用强度与动态过程，包括细胞间的相互作用、受体与配体之间的结合，以及其他多种情况。此外，该技术还可作为一种机制，以时空可控的方式对单个细胞施加物理或生化刺激，从而在与活细胞荧光成像结合时，实现实时监测特定细胞的激活及其后续的细胞事件。此类AFM-SCFS测量的关键步骤是原子力显微镜悬臂梁的功能化，即以某种方式将待研究对象固定在悬臂梁上。本文介绍了分别将单个T细胞和单个聚苯乙烯微球修饰到原子力显微镜悬臂梁上的方法，用于免疫学研究。前者采用一种生物相容性胶体，在溶液环境中将单个T细胞偶联至平头悬臂梁的尖端；后者则依赖环氧胶在空气环境中实现单个微球的粘附。本文还提供了与每种悬臂梁修饰方法相关的两项免疫学应用实例。此处描述的方法可轻松适用于不同类型的细胞和固体颗粒。

图4A 显示了一个T细胞与一个树突状细胞（DC）在一次接近-回撤循环中结合相互作用的典型力-距离曲线。浅红色曲线为延伸曲线，深红色曲线为回撤曲线。由于延伸曲线通常用于压痕或刚度分析，此处仅关注回撤曲线以研究细胞黏附。曲线中的最小值（绿色圆圈）反映了最大黏附力的大小。曲线下的面积（阴影区域）表示将T细胞从DC上分离所需的功（能量）。在完全分离之前，常可观察到尖锐且呈阶梯状的断裂事件。这被解释为由于细胞-细胞界面处的强结合，在持续拉力作用下，细胞膜表面被拉出膜纳米管（membrane tethers），随后在拉力下离散断裂所致。这些阶梯的数量、高度和长度可用于表征细胞膜的力学特性21。对于T细胞-DC相互作用，我们关注的是结合强度，因此仅对每条曲线的最大黏附力进行分析。图4B 比较了传统T细胞（Tconv）/DC与调节性T细胞（Treg）/DC之间的黏附力。Tconv可识别由抗原呈递细胞（如DC）呈递的肽类抗原...

我们提出了一种用于免疫学研究的原子力显微镜（AFM）悬臂梁功能化方案，可在其上固定单个T细胞和微粒。本文展示了利用AFM探测单对T细胞-树突状细胞结合的步骤，以及结合荧光成像技术，利用AFM实时监测巨噬细胞对单个固体微粒的细胞反应的方法。

原子力显微镜悬臂的功能化：负载单个T细胞或单颗粒用于免疫学单细胞力谱分析

基于原子力显微镜的单细胞力谱技术（AFM-SCFS）是一种研究活细胞生物物理特性的强大工具。

本方案详细介绍了如何利用单个T细胞和固体颗粒对原子力显微镜（AFM）悬臂梁进行最佳功能化修饰。这些探针尖端可用于分别研究单对树突状细胞与T细胞之间的相互作用，以及监测尺寸不稳定的细胞响应。该技术的主要优势在于采用了一种生物相容性胶水，用于实现悬臂梁的单个T细胞功能化修饰。这种胶对真核细胞呈惰性，因此可使T细胞保持在基础激活状态。这些方法有助于深入了解免疫细胞的激活过程以及复杂的细胞间事件，例如免疫突触的形成。这些方法还可拓展应用于涉及细胞-细胞或细胞-表面相互作用的其他系统。对于初次使用该技术的研究人员，重要的是确保T细胞在使用前处于良好状态，并用IL-2预处理过夜。此外，使用生物相容性胶水时应迅速操作，以避免不必要的氧化。开始本实验前，请按照文本方案中的步骤准备用于显微镜观察的单个T细胞。然后，准备接种有 DC2.4 细胞的玻璃盖玻片，并将细胞在 37 摄氏度、5%CO2 的湿润培养箱中孵育过夜。使用食人鱼溶液处理、等离子清洗或紫外-臭氧清洗法清洁低弹性系数的柔软无针尖悬臂。随后，将清洁后的悬臂安装至原子力显微镜（AFM）扫描头。接下来，准备一个洁净的样品室，并用纯水填充。首先在玻璃基底上采集一条力-距离曲线，以获得悬臂的灵敏度，从而在水溶液中对悬臂进行校准。然后，记录热噪声谱以提取弹簧常数。当悬臂梁校准完成后，将原子力显微镜扫描头从溶液中取出。用几滴纯乙醇清洗固定好的悬臂梁，并保持悬臂梁在扫描头上的干燥状态。将活细胞培养环境腔室预热至37摄氏度，含5% CO2。然后，将接种有 DC2.4 细胞的玻璃盖玻片安装到样品室组件中，并立即向腔室内加入 600 微升的 B 培养基。将组装好的样品置于原子力显微镜（AFM）样品台上。将经人 IL-2 孵育的 CD4 阳性 T 细胞加入样品室中。等待靶向T细胞完全沉降到盖玻片底部后，将细胞移至显微镜视野中。接着，用移液器吸取2微升生物相容性胶水，滴加到固定好的悬臂末端。一旦将生物相容性胶水施加到悬臂上，后续步骤需尽快完成，以最大程度保证粘附效果。迅速将扫描头放置在样品台上，使涂有胶水的悬臂浸入溶液中。移动样品台，直至一个健康的T细胞位于悬臂尖端下方。然后，通过微调扫描头的位置进行精细定位。接下来，手动降低悬臂。首先以 50 微米的步长开始，然后根据悬臂图像的清晰度逐渐减小至 10、5、2，最后为 0.5 微米。现在保持步进电机的位置，并调节扫描头的位置，以更好地对准悬臂尖端与细胞。持续操作直至激光位置出现微小位移，表明已形成牢固接触，对应的典型作用力为 0.5 至 1.5 纳牛。接触 30 秒后，收回悬臂。如果细胞随悬臂一起移动，则表明附着成功。如果未成功，可在更换新的悬臂梁之前，重复粘附步骤最多三次。通过移动样品台和扫描头，将已附着的T细胞定位在DC2.4细胞上方。设置合适的参数后，在样品上进行力谱测量。进行新一轮探测时，安装一个新的洁净悬臂梁。在纯水中对其进行校准，然后返回至T细胞-树突状细胞对并重复扫描。将一块已清洁的玻璃盖玻片安装到样品室组件上。在盖玻片的左侧，加入一滴用乙醇稀释的六微米直径聚苯乙烯微球溶液。待溶剂挥发后，使用配备20倍物镜的明场显微镜检查微球的间距。确保各个微球之间充分分离。然后，将微量移液器吸头或牙签浸入充分混合的环氧胶中，并通过连续轻触的方式，将少量胶水转移至盖玻片右侧靠近中心位置的三个不同点，如图所示。接着，将一个已清洁、无针尖的悬臂安装到原子力显微镜（AFM）扫描头，并在空气中使用洁净表面进行校准，以获得其弹簧常数。随后，将悬臂针尖定位至最后一个环氧胶点的左侧边界，并通过步进电机以较小的步长缓慢地将悬臂靠近胶滴。一旦探针与胶接触，立即通过向后移动原子力显微镜扫描头，快速将悬臂在侧向上拉开。通过在玻璃上擦拭去除多余的胶，仅在针尖末端留下极少量的胶。现在，将悬臂针尖移动到一个孤立良好的微珠上方。缓慢接近单个微珠，并以2至5纳牛顿的力与其稳定接触约10秒。接触过程中，使用微调装置将微珠精确定位于针尖末端。接触结束后，将针尖回撤。如果微珠从原始焦平面上消失，则表明已发生成功的黏附事件。最后，小心拆下修饰有微珠的悬臂，并将其放入悬臂盒中过夜，使环氧树脂充分固化。以下是单个T细胞与单个树突状细胞在一次接近-回撤循环过程中结合相互作用的典型力-距离曲线。浅红色曲线为延伸曲线，深红色曲线为回缩曲线。曲线中的最小值反映了T细胞与树突状细胞之间最大黏附力的大小，曲线下的面积则表示将两者分离所需做的功。曲线中出现的尖锐且呈阶梯状的断裂事件，可解释为由于细胞-细胞界面处存在强结合，在持续拉力作用下，细胞表面被拉伸出膜纳米管结构，随后该结构发生离散性断裂所致。此处，传统T细胞与树突状细胞的结合以灰色表示，调节性T细胞与树突状细胞的结合以蓝色表示。传统T细胞与调节性T细胞之间的黏附力可识别抗原呈递细胞所呈递的肽类抗原，而调节性T细胞是一类抑制性T细胞，可在免疫反应末期关闭由传统T细胞介导的免疫应答。该图示为一个荧光标记的吞噬性RAW264.7细胞，显示一个直径为六微米的裸露聚苯乙烯微球正接近该细胞。当微珠与细胞接触后，膜上的PIP2在接触位点附近b处发生分选，进而诱导膜招募moesin，最终引发吞噬事件。除了本文所述方法外，基于原子力显微镜的单细胞力谱技术还可与荧光成像结合，用于在单细胞水平上实时研究免疫细胞的活化过程。结合荧光技术，该方法能够实时解析更为复杂的细胞过程，例如树突状细胞与T细胞之间免疫突触的形成。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

原子力显微镜罐体功能化,具有单T细胞或单粒子免疫单细胞力光谱

本文中，我们描述了使用磁力镊子以高度可并行的方式在单分子水平上研究力对酶促蛋白水解作用的影响。...

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我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子力学性质及其机械解折叠路径的详细步骤与策略。同时，我们展示了代表性结果，以作为筛选和判断高质量单个蛋白质分子记录的参考依据。...

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本方案描述了使用异双功能硅烷偶联剂将蛋白质共价固定在二氧化硅表面的方法，该表面专为基于原子力显微镜的单分子力谱技术而设计，并以肺炎链球菌（S.

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用于基于原子力显微镜的力谱单分子共价连接

本文介绍了一种用于B细胞牵引力显微镜实验的方案。我们描述了软性聚丙烯酰胺凝胶的制备及其功能化方法，以及显微镜下的数据采集和数据分析的概要。...

用于研究B淋巴细胞活化的牵引力显微镜技术

本方案旨在对数百个微生物细胞实现原子力显微镜（AFM）测量的自动化。首先，将微生物固定在PDMS印章微结构中，随后对数百个固定的细胞自动进行力谱测量。...

对数百个C. albicans细胞进行生物原子力显微镜测量的自动化

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

本文展示了利用光热非共振轻敲（PORT）技术观察生物分子相互作用的成像方案，其中我们优化了成像参数，确定了系统局限性，并探究了在三叉星DNA结构组装成像中的潜在改进方法。...

高速原子力显微镜成像技术用于DNA三点星形结构自组装的光热非共振轻敲模式研究

学习原子力显微镜悬臂功能化技术，使用单T细胞或固体颗粒研究树突状细胞与T细胞相互作用及巨噬细胞实时响应。该方法采用生物相容性胶水保持T细胞基线活化状态，为免疫突触形成等复杂细胞间事件提供深入见解。

原子力显微镜悬臂的功能化：负载单个T细胞或单颗粒用于免疫学单细胞力谱分析

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