原子力显微镜罐体功能化,具有单T细胞或单粒子免疫单细胞力光谱

该协议描述了如何使用单个 T 细胞和固体粒子以最佳方式使 AFM 推进体功能化。然后，这些提示可用于探测单对树突状细胞-T细胞相互作用，并分别监测变化无常大小的细胞反应。该技术的主要优点是，它使用生物相容性胶水进行单T细胞功能化的可逆剂。

这种胶水对真核细胞是惰性的，从而使T细胞处于基线激活阶段。这些方法提供对免疫细胞活化和复杂的细胞间事件，如免疫突触形成的洞察。这些方法也可以扩展到涉及细胞细胞或细胞表面相互作用的其他系统。

对于对这项技术很了解的人，重要的是确保T细胞在使用前处于良好状态，并且一夜之间用IL-2进行预处理。此外，使用生物相容性胶水时，请快速移动，防止不必要的氧化。要开始此过程，请按照文本协议中遵循，为显微镜准备单个 T 细胞。

然后，准备用DC2.4细胞播种的玻璃盖玻片，在37摄氏度和5%CO2的加湿室中孵育细胞过夜。使用食人鱼法处理、血浆清洁或紫外线臭氧清洁，清洁柔软、无尖的软性针干剂，具有低弹簧常数。然后，将清洁的悬臂安装到 AFM 扫描头上。

接下来，准备一个干净的样品室，并用纯净水填充。首先在玻璃基板上运行力曲线，以获得悬臂的灵敏度，校准水溶液中的悬臂。然后，记录热噪声频谱以提取弹簧常数。

正确校准悬臂后，从溶液中卸下 AFM 扫描头。用几滴纯乙醇清洗安装的悬臂，使悬臂在扫描头上保持干燥。将活细胞环境外壳预热至 37 摄氏度，二氧化碳为 5%。

然后，将用 DC2.4 电池播种的玻璃盖玻片安装到样品室组件中，并立即向样品室中加入 600 微升的中B。将已完成的组件放在 AFM 样品阶段。将人类IL-2孵育CD4阳性T细胞加入样品室。

等待目标T细胞完全安放在盖玻片底部，然后在显微镜下将细胞放入视野。现在，用移液器将两微升的生物相容性胶水滴到安装的悬臂的末端。一旦生物相容性胶水被应用到悬臂上，需要尽快完成后续步骤，以最大限度地提高粘附性。

快速将扫描头放在样品阶段，将涂胶的悬臂浸入溶液中。移动样品级，直到位于悬臂尖端下方的运行状况 T 细胞。然后，通过移动扫描头微调其位置。

接下来，手动降低悬臂。从 50 微米步进开始，然后逐渐减小到 10、5 和 2，最后为 0.5 微米，如悬臂图像的锐度所示。现在，按住步进电机的位置，并调整扫描头的位置，以更好地对齐悬臂尖端和电池。

继续，直到激光位置的小位移指示牢固接触，对应于 0.5 至 1.5 纳米新吨的典型力。接触30秒后，收回悬臂。如果单元格随悬臂移动，则附件成功。

如果没有，在切换到新的悬臂之前，重复粘附步长达三次。通过移动样品级和扫描头，将附加的 T 单元放在 DC2.4 单元上方。设置适当的参数后，对样品进行力光谱分析。

对于新一轮的探测，安装一个新的，干净的悬臂。在纯水中校准它，然后返回T细胞-树突状细胞对并重复扫描。将清洁的玻璃盖玻片安装到样品室组件上。

在盖玻片的左侧，添加一滴在乙醇中稀释并含有六微米直径聚苯乙烯珠的珠子溶液。溶剂蒸发后，使用配备 20 倍目标的亮场显微镜检查珠子的间距。确保各个珠子分离良好。

然后，将微管尖端或牙签浸入混合良好的环氧树脂胶中，将少量胶水转移到三个单独的点中，右侧连续轻轻接触，但靠近盖玻片的中心，如下所示。接下来，将清洁的无尖悬臂安装到 AFM 扫描头上，并在空气中用干净的表面校准，以获得弹簧常数。然后，将悬臂笔尖放在最后一个环氧胶水点左边界上，然后用步进电机上的小步进尺寸慢慢将悬臂靠近胶水。

与胶水接触后，通过向后移动 AFM 扫描头，快速横向拉拔悬臂。通过擦掉玻璃上的任何多余的胶水，在尖端的末尾只留下少量胶水。现在，将悬臂尖端移在隔离良好的珠子上。

慢慢接近单珠，在2到5纳米新珠的范围内与它进行坚定的接触，约10秒。进行接触时，使用细尖调整将珠子定位在尖端的末尾。缩回触点端的尖端。

如果珠子从原始焦点平面上消失，则发生成功的粘附事件。最后，小心地将珠子修改的悬臂卸下，并将其存放在悬臂盒中过夜，使环氧树脂完全固化。以下是单个 T 单元和单个树突状细胞在一个方法缩回循环过程中结合相互作用的典型力-距离曲线。

浅红色曲线是延伸曲线，深红色曲线是缩回曲线。曲线中的最小值表示 T 细胞和树突状细胞之间的最大粘附力，曲线下的面积表示分离它们所需的工作。尖锐和逐步的破裂事件可以解释为膜系绳被从细胞表面拉出，由于在细胞接口的强结合，然后在连续拉下离散断裂。

在这里，常规T细胞与树突状细胞结合以灰色显示，与树突状细胞结合的调节T细胞以蓝色显示。常规T细胞和调节T细胞之间的粘附力可识别抗原呈现细胞呈现的肽抗原，而调节T细胞是抑制剂T细胞，在免疫反应接近尾声时关闭传统的T细胞调节的免疫力。这个荧光标记的噬菌体 RAW264.7 细胞的示意图显示细胞正在接近一个赤裸的、直径为 6 微米的聚苯乙烯珠。

接触珠子后，膜 PIP2 在接触点（靠近 b）进行排序，然后诱导膜招募mosin，从而引发噬菌论事件。除了此处所述的程序外，基于 AFM 的单细胞力光谱学可与荧光成像一起使用，在单细胞水平上实时研究免疫细胞激活。结合荧光技术，此方法允许实时处理更复杂的细胞过程，例如在树突状细胞和T细胞对之间形成免疫突触。