Name: 通过微注射研究3D组织衍生的人体器官培养系统中的隐孢子虫感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 了解微注射技术用于研究隐孢子虫在人体肠道和呼吸道类器官中的感染机制。该方法通过纯化子孢子和免疫染色实现精确病原体递送，为微生物学研究提供可靠的宿主-病原体相互作用模型。

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我们感谢美国亚利桑那大学农业与生命科学学院动物与比较生物医学科学系（位于亚利桑那州图森市）的 Deborah A. Schaefer 在卵囊制备与分析方面提供的帮助。我们还感谢华盛顿州立大学 Franceschi 显微镜与影像中心以及 D.L. Mullendore 在分离类器官卵囊的透射电镜样品制备与成像方面给予的支持。
D.D. 获得了荷兰科学研究组织（NWO-ALW，016.Veni.171.015）的 VENI 项目资助。I.H. 获得了荷兰科学研究组织（NWO-ALW，863.14.002）的 VENI 项目资助，并获得了欧洲委员会玛丽·居里奖学金（项目编号 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF）的支持。本研究工作获得了欧洲研究理事会高级资助协议编号 67013 以及美国国立卫生研究院国家补充与综合健康研究中心（NIH NIAIH）R21 AT009174 项目对 RMO 的资助。本研究属于 Oncode 研究所的一部分，该研究所部分由荷兰癌症协会资助，并获得了荷兰癌症协会资助项目的资金支持。

所有组织处理和切除操作均在机构审查委员会（IRB）批准的方案下进行，并取得患者的知情同意。
1. 注射用 C. parvum 卵囊的制备
注意：Cryptosporidium 卵囊购自商业来源（参见材料表）。这些卵囊由犊牛产生，并保存在含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中。可在 4 °C 下保存约 3 个月，切勿冷冻。我们通常在一个月内使用卵囊。可使用完整卵囊感染类器官，或者也可从脱囊卵囊中分离子孢子用于感染类器官，以避免原始接种物中的卵囊残留。
<ol>
	<li>准备 隐孢子虫 用于感染细胞的卵囊（图1A).
	<ol>
		<li>在整个操作过程中，将卵囊保持在冰上，直至添加至类器官中。</li>
		<li>计算一个完整的六孔板类器官所需的卵囊数量（通常约为 5 x 105–2.5 × 105 用血细胞计数板对载玻片上的卵囊数量进行计数以确认数量，随后转移至离心管中。 
		注意： 为便于观察，可将卵囊与卵囊特异性荧光抗体按1:1比例混合（参见 材料表) 后再加载到血细胞计数板上。使用荧光显微镜可轻松观察并计数荧光标记的卵囊。建议每个类器官接种约 100–1,000 个卵囊。通常情况下，可在六孔板中培养 1,000–2,000 个类器官。</li>
		<li>用 PBS 将卵囊悬液体积补至 900 µL，加入 100 µL 次氯酸钠（例如 Clorox）漂白剂（4 °C 条件下），冰上孵育 10 分钟。</li>
		<li>在微型离心机中以8,000 x g离心3分钟 g 在 4 °C 下离心。将离心管在离心机中放置时，管盖开口朝向内侧。沉淀物可能难以观察，因此必须明确寄生虫在管中的沉淀位置。</li>
		<li>用移液器小心吸除上清液，避免触及沉淀。加入1 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），涡旋混匀。</li>
		<li>在微型离心机中以8,000 x g离心3分钟 g 在 4 °C 下。</li>
		<li>用DMEM再重复洗涤两次。</li>
		<li>配制添加了牛磺胆酸至终浓度为0.5%（w/v）的扩增培养基（OME）或分化类器官培养基（OMD）（参见 材料表）。牛磺胆酸应始终新鲜配制并立即添加。 
		注意： 我们已在感染实验中成功使用0.5%牛磺胆酸，其中接种物为完整的卵囊，并观察到感染率提高，且对宿主细胞无不良影响。然而，牛磺胆酸可能对细胞产生意料之外的作用，且已有研究在感染实验中成功使用了更低浓度的牛磺胆酸。16.</li>
		<li>将卵囊重悬于100 μL含有0.5%（w/v）牛磺胆酸钠的类器官培养基中。按照步骤1.1.2所述方法再次计数卵囊。</li>
		<li>加入快绿染料以可视化注射过程。</li>
		<li>填充微载样头（参见 材料表用卵囊悬液填充拉制好的毛细管。 
		注意： 整个操作应在生物安全二级实验室的超净工作台内进行。建议佩戴口罩 隐孢子虫 卵囊在空气中也可能具有传染性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从C. parvum 卵囊中体外纯化子孢子
<ol>
	<li>按照上述方法漂白并洗去漂白剂后，从C. parvum卵囊中纯化子孢子。
	<ol>
		<li>将卵囊转移至15 mL离心管中。用室温脱囊培养基（含0.75% w/v 牛磺胆酸钠的DMEM）重悬卵囊，使浓度达到1 × 107 个卵囊/mL。添加牛磺胆酸钠可提高卵囊的脱囊率，从而增加子孢子产量。</li>
		<li>将卵囊悬液在37 °C孵育1–1.5小时。</li>
		<li>在显微镜下检查脱囊程度；若脱囊率达到60–80%，则可获得较理想的子孢子回收率。若脱囊率较低，可延长孵育时间（再孵育30分钟至1小时）。</li>
		<li>根据起始卵囊数量计算脱囊百分比。脱囊率计算公式如下： 
		% 脱囊率 = [1 – (完整卵囊数 / 起始卵囊数)] × 100</li>
		<li>通过加入14 mL PBS或培养基混匀后，在3,400 × g条件下离心20分钟，洗涤细胞以去除脱囊试剂，从而收集细胞（包括完整卵囊、卵囊壳和子孢子）。吸取上清时应小心操作，避免细胞损失。</li>
		<li>将子孢子沉淀用1–2 mL DMEM重悬，使终浓度为3 × 107 个卵囊/mL（基于起始卵囊数量）。</li>
		<li>为去除残留的卵囊和卵囊壳，将悬液通过3 µm滤膜过滤（图1B）。使用配备聚碳酸酯滤膜（孔径3 µm）的47 mm滤器装置，并连接10 mL注射器筒。将滤器装置置于15 mL离心管上方，并将整个装置放入冰桶或冷藏室中。</li>
		<li>向滤器装置中加入7.5 mL子孢子悬液，依靠重力自然过滤。再用7.5 mL DMEM冲洗滤膜。 
		注意：为确保子孢子分离成功，新鲜卵囊和良好的脱囊效果至关重要。若未脱囊的卵囊过多，悬液将无法依靠重力顺利过滤。对注射器施加压力可能导致未脱囊卵囊被强行挤过滤膜。由于子孢子容易聚集并堵塞毛细管，因此对类器官进行子孢子显微注射比卵囊注射更具挑战性。为避免此问题，建议在向类器官注射子孢子时使用更宽口径的毛细管尖端。为达到足够的感染水平，每个类器官所需注射的子孢子数量应为感染卵囊时的2–4倍。</li>
		<li>将过滤后的子孢子悬液使用水平转子在3,400 × g条件下离心20分钟，以收集子孢子沉淀。</li>
		<li>用50–100 μL OME或OMD类器官培养基（见材料表）重悬沉淀，该培养基需补充0.05% (w/v) 快绿染料以及含L-谷胱甘肽、甜菜碱、L-半胱氨酸、亚油酸和牛磺酸的还原缓冲液5（见材料表）。 
		注意：卵囊孵育时间过长可能导致子孢子裂解，造成回收率降低，因此应避免长时间孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于显微注射的人肠道和肺类器官的体外培养
<ol>
	<li>在扩增和分化培养基条件下培养肠道类器官。 
	注意：肠道和肺类器官的传代培养细节已在其他文章中描述过8,13（培养基配方见材料表）。本文简要描述类器官培养方法，并特别说明针对Cryptosporidium注射和生长的优化条件。我们发现，在对类器官中的寄生虫进行成像时，使用扩增培养基培养的类器官优于使用分化培养基培养的类器官，因为前者积累的碎片较少。然而，如果目标是分离卵囊，则使用分化培养基培养的类器官可产生数量多得多的卵囊。
	<ol>
		<li>将类器官在37 °C条件下，以三维形式培养于细胞外基质中（见材料表），在基质上方加入OME（扩增培养基），每天更换一次。 
		注意：对于肺类器官，我们不使用单独的扩增和分化培养基。</li>
		<li>为进行显微注射而传代和铺板类器官时，移除含有人类类器官的6孔板中的培养基，向孔中加入F12+++（见材料表），用1 mL移液枪头反复吹打数次以打碎基质。将细胞收集至15 mL离心管中（每管2 mL F12+++足以进行后续操作）。</li>
		<li>向另一15 mL离心管中加入10–12 mL F12+++，将一支火焰抛光的玻璃移液管插入液体中，上下吹打3次，以打碎人类肠道和肺类器官。 
		注意：使用较长的玻璃移液管（20–30 cm），并短暂进行火焰抛光。移液管开口不宜过小（直径约1 mm），以免损伤类器官。通过短暂火焰抛光使移液管尖端光滑。将类器官打碎成约50 µm大小的片段。肺类器官外膜较厚，因此相比肠道类器官需要更强的剪切力。此外，其生长速度较慢（每次传代间隔可达14天）。</li>
		<li>加入F12+++至总体积5–7 mL，以350 x g离心5分钟。 
		注意：此步骤的离心速度高于常规，目的是形成良好的细胞沉淀，并与细胞外基质（见材料表）充分分离。我们观察到，与小鼠小肠类器官相比，人类小肠类器官更难解离。</li>
		<li>尽可能移除上清液而不扰动细胞沉淀，然后用保持在4 °C的基质重悬沉淀；每六孔板孔需200–300 µL基质。类器官应按1:3比例传代，以维持较高的细胞密度。</li>
		<li>将类器官以每滴约5–10 µL的基质滴加至六孔板孔中。在37 °C孵育20–30分钟后，在上方加入扩增培养基（OME）。</li>
		<li>每2–3天更换一次培养基。 
		注意：在扩增培养基中培养约5–7天后，类器官可长至100–200 μm，即可用于注射。</li>
		<li>为诱导类器官分化，在扩增培养基中培养5–6天后，更换为分化培养基（DM）条件，并继续培养5–6天后再接种寄生虫。 
		注意：为扩增类器官，建议高密度铺板。为进行显微注射，推荐使用六孔板，并以较低密度铺板。例如，将三个六孔板孔中的类器官铺至一个完整的六孔板中用于显微注射。基质应于-20 °C长期保存，使用前在4 °C或冰上解冻。肺类器官的扩增方法类似，但需使用肺类器官特异性的培养基成分（表1）8。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将卵囊/子孢子显微注射至类器官腔内
<ol>
	<li>将寄生虫显微注射至三维类器官的顶端侧（图2）。
	<ol>
		<li>使用微量移液器拉制仪制备直径为1 mm的玻璃毛细管。 
		注意：微量移液器拉制仪（见材料表）的设置参数为：加热温度 = 663，拉力 = 100，速度 = 200，时间 = 40 ms。具体参数需根据所用仪器的用户说明书进行调整。</li>
		<li>用镊子剪断毛细管尖端，使毛细管末端的尺寸/直径约为9–12 μm，以便卵囊（大小为4–5 μm）顺利通过。</li>
		<li>使用微量加样器吸头将卵囊或子孢子悬液吸入毛细管中。</li>
		<li>将含有卵囊的毛细管装载到显微注射仪上。</li>
		<li>在倒置显微镜下（5倍放大），向每个类器官显微注射100–200 nL悬液，并保持压力恒定。显微注射后，每天更换OMO或OMD培养基，并将培养板维持在37 °C。 
		注意：本实验不使用显微操作器进行显微注射。建议整个实验过程中使用同一根毛细管，以确保每个样本的注射量一致。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 类器官的免疫荧光染色
<ol>
	<li>用 P1000 移液器将类器官（1–2 × 24 孔）收集至含有冷 F12+++ 的 15 mL 离心管中。</li>
	<li>在 300 × g 条件下离心 2 分钟使类器官沉淀，弃去上清液但不要扰动沉淀，然后轻轻吹打使沉淀重新悬浮于残留液体中。</li>
	<li>加入 5 mL 含 2% 多聚甲醛的 PBS 溶液。为防止类器官粘附管壁，请勿翻转离心管。让类器官自然沉降至管底，在 4 °C 下固定过夜或在室温下固定 1 小时。</li>
	<li>去除固定液，加入 10 mL 通透缓冲液（含 0.2% Triton 的 PBS）。</li>
	<li>在室温下旋转孵育 20 分钟（以确保所有类器官保持悬浮状态）。</li>
	<li>在 300 × g 条件下离心 2 分钟使类器官沉淀，然后弃去上清液。</li>
	<li>用 500 µL 封闭液（见材料表）轻柔重悬类器官，并转移至 2 mL 微量离心管中。</li>
	<li>在摇床上室温孵育 20 分钟。让类器官通过重力自然沉降至管底，弃去封闭液后加入一抗溶液（见材料表），室温孵育 1–2 小时或 4 °C 过夜。</li>
	<li>用含 0.1% Tween 的 PBS 洗涤 3 次。每次洗涤后让类器官自然沉降，并弃去上清液。</li>
	<li>加入二抗溶液（见材料表），室温孵育 2 小时。</li>
	<li>用含 0.1% Tween 的 PBS 洗涤 3 次。第三次洗涤后保留 50 μL PBS。</li>
	<li>用移液器将悬浮于 50 μL PBS 中的类器官转移至载玻片上进行封片。去除多余 PBS，滴加一滴封片剂（见材料表），盖上盖玻片，用指甲油密封边缘并静置干燥。</li>
</ol>
6. 从类器官中分离卵囊
<ol>
	<li>从类器官腔内分离新形成的卵囊。 
	注意：使用卵囊分离试剂盒（参见材料表）通过免疫磁珠分离法从类器官中分离卵囊，具体步骤如下文所述。分离得到的卵囊可用于免疫荧光和电子显微镜分析。
	<ol>
		<li>起始材料为已在OMD培养基中培养5–7天的分化类器官，包括未感染、感染1天和感染5天的样本。前两种作为阴性对照。 
		注意：我们发现，分化类器官产生的卵囊数量多于肺类器官或扩增期肠类器官10。</li>
		<li>将类器官收集至15 mL离心管中。在10 °C条件下，以3,000 × g离心20分钟。 
		注意：此高速离心步骤可确保即使部分类器官破裂，也不会丢失卵囊。</li>
		<li>移除类器官培养基，并加入5 mL水。</li>
		<li>使用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管反复剧烈吹打，以破坏类器官结构。</li>
		<li>若可见团块，将类器官悬液转移至玻璃Dounce匀浆器中，匀浆至类器官充分破碎。Dounce匀浆器不会影响卵囊完整性。</li>
		<li>当无可见团块后，加入卵囊分离试剂盒中的缓冲液A 5 mL。混匀后，加入120 µL包被有抗卵囊IgM抗体的磁珠。</li>
		<li>将细胞悬液与磁珠在室温下于摇床上持续混匀孵育2小时。</li>
		<li>孵育结束后，将含有细胞和磁珠的离心管置于适用于15 mL离心管的磁力分离架上。</li>
		<li>手动旋转离心管3分钟。磁珠将吸附在靠近磁铁一侧的管壁上。</li>
		<li>用10 mL移液器小心吸除上清液。将磁珠重悬于450 µL缓冲液B中，并转移至1.5 mL微量离心管中。 
		注意：在确认卵囊成功分离前，请保留上清液。</li>
		<li>为回收残留的磁珠和卵囊，用450 µL缓冲液B冲洗15 mL离心管，并将洗涤液加入微量离心管中的磁珠悬液中。</li>
		<li>重复步骤6.1.11一次。此时所有磁珠及捕获的卵囊应均已转移至微量离心管中。</li>
		<li>将微量离心管置于适用于微量离心管的磁力分离架上。</li>
		<li>手动旋转微量离心管3分钟。</li>
		<li>小心用移液器将上清液转移至新离心管中。 
		注意：在确认卵囊成功分离前，请保留上清液。</li>
		<li>将含有磁珠和卵囊的微量离心管从磁力分离架上取下。</li>
		<li>向磁珠中加入100 µL 0.1 N HCl，以洗脱结合在磁珠上的卵囊。涡旋振荡30秒。 
		注意：涡旋振荡器速度应略低于最大速度。</li>
		<li>在室温下用0.1 N HCl孵育磁珠10分钟。</li>
		<li>再次涡旋振荡，然后将离心管放回磁力分离架。待磁珠吸附至管壁后，将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
		<li>重复步骤6.1.17至6.1.19，并将第二次洗脱液与第一次洗脱液合并。</li>
		<li>用20 µL 1 N NaOH或其它中和缓冲液（如pH 8的1 M Tris）中和洗脱液。</li>
		<li>为计数卵囊，取10 µL洗脱液，与10 µL特异性抗卵囊抗体混合（参见材料表），在血细胞计数板上计数荧光标记的卵囊。 
		注意：分离得到的卵囊可在4 °C保存，或立即用于免疫荧光或电子显微镜成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

培养 隐孢子虫 肠道和气道类器官中的寄生虫为研究宿主-寄生虫相互作用提供了精确的模型10 但还具有许多其他应用。例如，目前选择和扩增转基因的常用方法 隐孢子虫 寄生虫需要在小鼠体内传代19 无法分离出对体内感染至关重要的已发生修饰的寄生虫。类器官培养 隐孢子虫 为该操作提供了一种替代方法。然而，我们注意到电穿孔处理后的子孢子容易发生聚集，从而堵塞微移液管。为了筛选基因修饰的寄生虫，可在胶原包被的transwell上以二维形式培养类器官，并在分化条件下培养，以允许转染后的子孢子感染，进而筛选获得基因修饰的卵囊。transwell装置可同时接触顶端和基底外侧表面，并可在较长时间内保持稳定。
目前，我们将类器官以二维形式进行培养，用于对源自癌组织的类器官开展高通量药物筛选（未发表数据）。该类器官培养方法也可适用于抗肿瘤药物的测试隐孢子虫 使用基因修饰的荧光素酶标记药物 隐孢子虫 菌株<sup class=...

用于治疗和预防的药物或疫苗的开发 隐孢子虫 感染研究因缺乏能够精确模拟人体内环境的体外系统而受到阻碍1,2. 目前许多可用的系统仅允许短期感染（&#60;5天）或无法支持寄生虫的完整生命周期3,4其他能够支持寄生虫完整发育的系统基于永生化细胞系或肿瘤细胞系，但这些细胞系无法真实再现人体内的生理状况。5,6,7类器官或“迷你器官”是来源于三维组织的结构，在添加了多种组织特异性生长因子的细胞外基质中培养而成。类器官已从多种器官和组织中成功构建，具有遗传稳定性，能够重现其来源器官的大部分功能，并可在体外长期培养。我们已建立一种方法，用于将人肠道和肺类器官感染 隐孢子虫 为研究与肠道和呼吸道隐孢子虫病相关的宿主-寄生虫相互作用提供准确的体外模型8,9,10,11,12,13与其他已发表的培养模型相比，类器官系统更能代表真实的宿主-寄生虫相互作用，能够完成寄生虫的生活史，从而可研究其生活史的各个阶段，并可维持寄生虫增殖长达28天10.
Cryptosporidium parvum 是一种顶复门寄生虫，可感染呼吸道和肠道的上皮细胞，引起持续性腹泻疾病。其对环境具有抗性的阶段为卵囊，可在被污染的食物和水中发现14。一旦被摄入或吸入，卵囊会脱囊并释放出四个子孢子，子孢子附着于上皮细胞。子孢子在宿主细胞表面滑行并结合宿主细胞受体，但寄生虫并不完全侵入细胞，而是似乎诱导宿主细胞将其吞噬15。该寄生虫位于细胞内但胞质外的隔室内，始终停留在细胞的顶端表面，并在寄生泡内进行复制。它经历两轮无性繁殖，这一过程称为裂体增殖。在裂体增殖过程中，首先形成含有八个裂殖子的Ⅰ型裂殖体，裂殖子释放后侵入新的细胞。这些裂殖子侵入新细胞后发育为含有四个裂殖子的Ⅱ型裂殖体。当这些裂殖子释放后，会感染细胞并发育为大配子体和小配子体。小配子释放后与大配子结合，形成合子，合子进一步发育为卵囊。成熟的卵囊随后被释放到管腔中。卵囊分为两种：薄壁卵囊可立即脱囊，重新感染上皮细胞；厚壁卵囊则被释放到环境中，以感染下一个宿主14。我们课题组先前建立的类器官培养系统中，已鉴定出Cryptosporidium生活史的各个阶段10。
由于人类类器官能够高度模拟人体组织9,11,13，并支持所有复制阶段的 隐孢子虫10，它们是研究的理想组织培养系统 隐孢子虫 生物学及宿主-寄生虫相互作用。本文中，我们描述了使用两种病原体感染类器官的实验步骤 隐孢子虫 卵囊和脱囊的子孢子，并分离该组织培养系统中新产生的卵囊。

<table><tbody><tr><td>基底膜提取物（细胞外基质）</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo 抗体（卵囊特异性抗体）</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>终浓度 = 每张载玻片使用 2–3 滴</td></tr><tr><td>Crypto-Grab IgM 包被磁珠</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 15 磁架</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 2 磁架</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EMD Millipore&amp;nbsp;Isopore 聚碳酸酯膜滤器 - 3&amp;micro;m</td><td>EMD-Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Femtojet 4i 显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>直径为 1 mm 的玻璃毛细管</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel（细胞外基质）</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量加样器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃毛细管拉制仪 P-97</td><td>Shutter instrument</td><td>P-97</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青链霉素双抗（Penstrep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>次氯酸钠（使用 5%）</td><td>Clorox</td><td>50371478</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超强粘附载玻片</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mm 聚碳酸酯滤器支架</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛磺胆酸钠水合物</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Merck</td><td>8221840500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 涡旋振荡器</td><td>Scientific industries, Inc</td><td>SI0236</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Adv+++（DMEM+青链霉素+谷氨酰胺+HEPES）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;最终体积&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>青链霉素双抗（Penstrep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>500 mL DMEM 中加入 5 mL 储存液</td></tr><tr><td>谷氨酰胺（Glutamax）</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>500 mL DMEM 中加入 5 mL 储存液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>500 mL DMEM 中加入 5 mL 储存液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;肠道类器官培养基-OME（扩增培养基）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;终浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0.5 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>定容至 100 mL</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>胃泌素</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>本实验室制备*</td><td>&amp;nbsp;</td><td>10%</td></tr><tr><td>p38 抑制剂（SB202190）</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>每 500 mL 培养基加入 1 mL</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>本实验室制备*</td><td>&amp;nbsp;</td><td>20%</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>本实验室制备*</td><td>&amp;nbsp;</td><td>50%</td></tr><tr><td>本实验室制备* — 细胞系可根据请求提供</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;肠道类器官培养基-OMD（分化培养基）&lt;/strong&gt;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>为诱导类器官分化，将扩增中的小肠类器官在富含 Wnt 的培养基中培养 6–7 天后，转入分化培养基（从富含 Wnt 的培养基或 OME 中去除 Wnt、烟酰胺、SB202190 和前列腺素 E2）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;肺类器官培养基-LOM（分化培养基）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;终浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>定容至 100 mL</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0.0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>直接联系公司</td><td>10%</td></tr><tr><td>p38 MAPK 抑制剂</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Rho 激酶抑制剂 Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2.5 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>直接联系公司</td><td>10%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;还原缓冲液（用于重悬卵囊和子孢子以进行注射）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;终浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>还原型 L-谷胱甘肽</td><td>Sigma</td><td>G4251-10MG</td><td>0.5 &amp;mu;g/&amp;mu;L OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>甜菜碱</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td>0.5 &amp;mu;g/&amp;mu;L OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>168149-2.5G</td><td>0.5 &amp;mu;g/&amp;mu;L OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>亚油酸</td><td>Sigma</td><td>L1376-10MG</td><td>6.8 &amp;mu;g/mL OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T0625-10MG</td><td>0.5 &amp;mu;g/&amp;mu;L OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;封闭缓冲液（用于免疫荧光染色）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;终浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>驴/山羊血清</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>70011044</td><td>定容至 100 mL</td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;所用抗体列表&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Alexa 568 标记山羊抗兔 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>稀释比例 - 1:500；RRID: AB_143157</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo 综合试剂盒 - 荧光素标记抗体 Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLK</td><td>稀释比例 - 1:200</td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS 磁珠 - 单克隆抗体包被的磁珠</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>稀释比例 - 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>稀释比例 - 1:1,000；RRID: AB_2629482</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-Alexa 674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>稀释比例 - 1:1,000；RRID: AB_2620155</td></tr><tr><td>由 R. M. O&amp;rsquo;Connor（共同作者）制备的兔抗 gp15 抗体</td><td>根据请求提供</td><td>根据请求提供</td><td>稀释比例 - 1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>稀释比例 - 1:200</td></tr></tbody></table>

研究 隐孢子虫 通过显微注射在三维组织来源的人类类器官培养系统中建立感染

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Cryptosporidium parvum 是人类腹泻疾病的主要病因之一。为了理解该寄生虫的致病机制并开发高效的药物，需要建立一种能够在体外重现宿主内环境的培养系统。类器官因其结构与来源组织高度相似，是研究宿主-病原体相互作用的理想模型。类器官是由成体干细胞来源的三维（3D）组织结构，可在体外长期培养，且不发生任何遗传异常或转化。它们具有明确的极性，包含顶膜和基底侧膜两个表面。类器官在药物筛选、生物样本库构建、疾病建模以及宿主-微生物相互作用研究中具有广泛的应用。本文提供了一步一步的操作方案，介绍如何制备用于感染人肠道和呼吸道类器官的Cryptosporidium卵囊和子孢子。随后，我们展示了如何通过显微注射将微生物注入类器官腔内。目前有三种主要方法可用于利用类器官开展宿主-微生物相互作用研究：显微注射、机械剪切后铺板以及形成单层细胞。其中，显微注射能够维持类器官的三维结构，实现对寄生虫接种量的精确控制，并使微生物直接接触顶膜表面。我们还详细说明了为成像分析或卵囊生产而优化类器官生长的条件。最后，我们展示了如何从类器官中分离新生成的卵囊，以便进行后续处理和分析。

本文所展示的方案可高效纯化卵囊和子孢子（图1A），适用于显微注射。通过脱囊方案可从约70–80%的卵囊中释放出子孢子，因此必须使用3 µm滤膜过滤去除残留的卵囊及囊壳。过滤后可实现接近100%的子孢子纯度（图1B）。此外，加入绿色染料有助于确保所有类器官均被注射，并可在注射后至少24小时内对已注射的类器官进行可视化观察（图2B）。
这些制备卵囊和子孢子的方案简单易行，已使用多年，因此预期处理后的卵囊和纯化的子孢子具有活力且具备感染性。然而，在我们的研究中，我们采用扫描电子显微镜确认脱囊过程未对子孢子或卵囊造成损伤（图2A）10。通过简单的显微成像可直观确认等量卵囊已注入类器官腔内（图2C）。应取部分感染的类器官样本，采用我们已描述的方法通过...

我们描述了制备卵囊并纯化子孢子的方案，用于研究人肠道和呼吸道类器官的感染过程 微小隐孢子虫 我们展示了将寄生虫显微注射至肠道类器官腔内以及对类器官进行免疫染色的操作步骤。最后，我们描述了从类器官中分离所产生卵囊的方法。

微小隐孢子虫是人类腹泻性疾病的主要病因之一。为了理解该寄生虫的致病机制并开发高效的药物，需要……

利用这种子孢子纯化和显微注射方法，基本上可以在任何来源于组织的器官系统中研究任意宿主微生物。通过该技术，我们可以控制注入类器官腔内或类器官顶侧的纯子孢子数量。为纯化微小隐孢子虫（C.parvum）子孢子，将卵囊转移至15毫升离心管中，并以每毫升含1×10⁷个卵囊的浓度重悬于脱囊培养基中。在37摄氏度下孵育60至90分钟后，将14毫升适当的洗涤液与卵囊混合，并通过离心沉淀细胞。小心吸除上清液，避免卵囊损失，然后将孢子状沉淀物重悬于1至2毫升DMEM中，浓度为每毫升3×10⁷个卵囊。为去除残留的卵囊和外壳，将装有47毫米滤器支架装置（内含孔径为3微米的聚碳酸酯滤膜）的10毫升注射器筒插入15毫升离心管中，并置于4摄氏度环境中。向滤器组件中加入 7.5 毫升子孢子悬液。待全部液体依靠重力通过滤网后，用另外 7.5 毫升 DMEM 将残留细胞冲洗通过滤网。当所有冲洗液均通过滤网后，将滤过的子孢子悬液以离心法收集 10 分钟，并将沉淀重悬于 50 至 100 微升含有 0.05% 快绿染料以及含还原剂的类器官培养基中，该培养基需添加 L-谷胱甘肽、甜菜碱、L-半胱氨酸、亚油酸和牛磺酸。为了将寄生虫显微注射到三维类器官的顶侧，首先使用微电极拉制仪制备玻璃注射毛细管。用镊子将毛细管尖端剪至9至12微米直径，以确保子孢子或卵囊（如选择直接注射卵囊）能够顺利流动，并使用微量上样吸头将每根毛细管填充入含快绿染料标记的卵囊或子孢子悬液。随后，将第一根装有子孢子的毛细管装入显微注射仪，在倒置显微镜下以5倍放大倍数和恒定压力，向每个类器官显微注射100至200纳升的悬液。脱囊实验方案可使约70%至80%的卵囊释放出子孢子。因此，必须通过三微米过滤步骤去除残留的卵囊壳，以清除几乎100%未脱囊的卵囊。此外，添加绿色染料有助于确保所有类器官均被成功注射，并可在注射后至少24小时内对已注射的类器官进行可视化观察。尽管该方法已较为成熟，但仍可采用扫描电子显微镜来确认脱囊过程是否对子孢子或卵囊造成了损伤。通过简单的显微成像即可直观确认等量卵囊是否已被注入类器官腔内。免疫荧光检测也可用于探究被隐孢子虫感染的细胞类型。在已分化的类器官感染五天后，可通过将部分卵囊滴加到粘附载玻片上，用甲醇固定卵囊，并结合 DAPI 染色与合适的卵囊特异性抗体，来确认卵囊内子孢子的存在。为获得最佳结果，应使用新鲜的卵囊，所有注射均使用同一根毛细管，并在注射后每天更换培养基。利用该技术，目前已有多个实验室开始使用类器官来研究宿主与微生物之间的相互作用。我们正在类似的类器官微培养体系中研究共生菌以及其他病原体。由于隐孢子虫是一种人类寄生虫，因此必须按照生物安全二级标准进行这些实验。

studying-cryptosporidium-infection-3d-tissue-derived-human-organoid

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

通过微注射研究3D组织衍生的人体器官培养系统中的隐孢子虫感染

在本视频中，我们演示了一种 体外 从致病寄生虫厚壁卵囊中纯化子孢子的方法...

体外分离Cryptosporidium parvum卵囊中的子孢子

本视频演示了一种显微注射技术，用于建立人肠道类器官感染模型。将寄生虫微小隐孢子虫（Cryptosporidium...

通过显微注射技术在肠道类器官中建立寄生虫感染的方法

本方案介绍了Lgr5阳性原代类器官的培养以及后续的逆转录病毒转导操作。该方法可实现由Cre诱导的外源转基因过表达或敲低，从而在新型模型中开展功能研究 体外 器官型 模型系统.

原代肠道类器官培养中逆转录病毒感染的视频方案

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。...

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

由干细胞衍生的培养物在模拟感染性疾病方面具有巨大潜力。本文介绍了源自成体干细胞的小鼠和人类胃类器官的培养方法。通过显微注射将胃部病原体Helicobacter...

类器官作为感染性疾病的模型：人和小鼠胃类器官的培养及幽门螺杆菌的显微注射

本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。...

人肠道类器官上皮屏障通透性的实时测量

由人诱导性多能干细胞（hiPSC）衍生的肠道类器官为在体外模拟肠道疾病提供了新的研究机会。本文展示了将hiPSC分化为肠道类器官（iHOs）、利用细胞因子刺激这些iHOs，以及将鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella...

利用人诱导性多能干细胞来源的肠道类器官研究并调控上皮细胞对损伤的防护作用 沙门氏菌 及其他病原体

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。...

小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。...

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

该研究提出了一种方法 体外 细菌感染的研究 利用组织干细胞来源的肠道类器官。该方案描述了如何在二维条件下培养和分化类器官，并用黏附侵袭性...

利用侵袭素或基底膜提取物进行二维类器官培养以研究宿主-细菌相互作用

了解微注射技术用于研究隐孢子虫在人体肠道和呼吸道类器官中的感染机制。该方法通过纯化子孢子和免疫染色实现精确病原体递送，为微生物学研究提供可靠的宿主-病原体相互作用模型。

研究隐孢子虫通过显微注射在三维组织来源的人类类器官培养系统中建立感染

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