Name: 全骨髓的制备,用于中性粒系细胞的大规模细胞测定分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学习全骨髓制备方法，用于质谱流式细胞术分析中性粒系细胞。该方案可保存短寿命髓系细胞完整性，帮助研究人员识别稀有免疫细胞亚群并探索疾病机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢LJI流式细胞术核心团队在质谱流式细胞术实验操作中提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为R01HL134236、P01HL136275和R01CA202987（均授予C.C.H.），以及ADA7-12-MN-31（04）（授予C.C.H.和Y.P.Z.）。

所有实验均遵循拉霍亚过敏与免疫学研究所动物护理和使用委员会批准的指南，并根据美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中规定的要求，获得了拉霍亚过敏与免疫学研究所关于啮齿类动物使用的批准。
1. 收集小鼠骨髓（BM）
<ol>
	<li>从商业供应商处购买 C57BL/6J 小鼠。给予标准啮齿类动物饲料，并将小鼠饲养于无病原体设施中的微隔离笼内。</li>
	<li>实验使用 6 至 10 周龄的雄性小鼠。通过吸入 CO2 实施安乐死，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>将小鼠仰卧置于无菌手术垫上。用 70% 乙醇喷洒腹部及后肢区域以消毒皮肤。使用解剖手术剪剪开腹腔。</li>
	<li>去除皮肤以暴露后肢。使用一对钝头敷料镊夹住小鼠胫骨踝关节稍上方位置。用另一对弯头敷料镊在钝头敷料镊下方固定胫骨。用钝头敷料镊撕开附着的肌肉，折断胫骨并暴露骨组织。 
	注意：胫骨与膝关节连接较松，可用钝头敷料镊轻易取出。</li>
	<li>将胫骨放入冷的 1x PBS 中。</li>
	<li>随后，将用于固定的弯头敷料镊向下移动至股骨。将钝头敷料镊滑至膝关节下方并夹住髌骨。轻柔向上牵拉使髌骨脱位。撕开附着于髌骨的肌肉以暴露股骨。用弯头敷料镊夹住暴露的股骨，并使用解剖手术剪从骨底部剪下股骨。</li>
	<li>将股骨放入冷的 1x PBS 中。</li>
	<li>用 18 G 针头在 0.5 mL 微离心管上打孔。</li>
	<li>将胫骨和股骨均放入同一个 0.5 mL 微离心管中，使骨的开口端朝下对准孔洞。</li>
	<li>将装有胫骨和股骨的 0.5 mL 管放入一个 1.7 mL 微离心管中。</li>
	<li>在微量离心机中以 5,510 x g 离心 30 秒，使双层管中的胫骨和股骨共同离心。</li>
	<li>确保骨髓（BM）已从骨组织中被冲出，并在管底形成沉淀。弃去含有空骨的 0.5 mL 管。小鼠骨髓现已准备好用于后续步骤。 
	注意：人骨髓按先前所述方法从临床资源中获取11。</li>
</ol>
2. 对骨髓细胞进行CyTOF染色
<ol>
	<li>用 1 mL 1× 红细胞（RBC）裂解缓冲液重悬骨髓细胞。对于人骨髓样本，将全部骨髓组织重悬于 10 倍体积的 1× 红细胞（RBC）裂解缓冲液中，在室温（RT）孵育 10 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。对于人骨髓样本，在进行步骤 2.3 前需重复步骤 2.1 和 2.2。</li>
	<li>小心吸除上清液，保留沉淀不受扰动。用 1 mL 冷的 1× PBS 重悬沉淀，并通过 70 μm 细胞滤网将细胞滤入 15 mL 圆锥管中。此时骨髓细胞已完全从肌肉和骨碎片中分离出来。向管中加入 9 mL 冷的 1× PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 350 x g 将 15 mL 管离心 5 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，用 10 mL 冷 PBS 重悬骨髓细胞。取部分细胞用于计数，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将 5 × 106 个骨髓细胞分装至新的 15 mL 管中，用于质谱流式（CyTOF）染色。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 350 x g 将 15 mL 管中的细胞分装物离心 5 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，用含 125 nM 顺铂的 1 mL CyTOF 染色缓冲液重悬骨髓细胞，作为样本的活率指示剂。在室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>孵育后，向管中加入 4 mL CyTOF 染色缓冲液，在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。对于人骨髓样本，需在 CyTOF 染色缓冲液中加入 10% 人 AB 血清。</li>
	<li>用 50 µL Fc 受体阻断液重悬细胞沉淀，小心吸除上清液后进行重悬。在 4 °C 孵育 10 分钟。人骨髓样本可跳过此步骤。</li>
	<li>向样本中加入 50 µL 自制的 CyTOF 抗体混合液5，使总染色体积达到 100 μL。轻轻吹打混匀。在 4 °C 孵育 30 分钟。小鼠骨髓和人骨髓样本的抗体混合液体积最终均为 100 μL。</li>
	<li>孵育结束后，每管加入 2 mL CyTOF 染色缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>重复步骤 2.12，共进行两次洗涤。</li>
	<li>从 16% 储存安瓿中新鲜配制 1.6% 甲醛溶液。将 1 份甲醛原液与 9 份 1× PBS 混合稀释。</li>
	<li>小心吸除上清液，用 1 mL 新鲜配制的 1.6% 甲醛（FA）溶液重悬沉淀。在室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 800 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，用含 125 nM 插入剂溶液的 1 mL 固定/透化缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将样本在插入剂溶液中于 4 °C 过夜孵育。</li>
</ol>
3. 准备用于CyTOF检测的细胞
<ol>
	<li>轻轻涡旋并在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>加入 2 mL CyTOF 染色缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟，然后通过抽吸去除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 1 mL 二重蒸馏水（diH2O）中。从每管中保留少量体积（约 10 µL）用于细胞计数。</li>
	<li>在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>重复步骤 3.3 和 3.4。</li>
	<li>小心抽吸上清液，保留细胞沉淀。骨髓（BM）细胞现在可重悬至 1 × 106 个细胞/mL 的浓度，用于 CyTOF 检测。</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li>
<li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li>
<li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+data+using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li>
<li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).</li>
<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%E2%80%99s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler’s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).</li>
<li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在过去几十年中，基于荧光的流式细胞术被用作研究细胞谱系和异质性的主要方法1,2,3。尽管流式细胞术能够提供多维数据，但该方法受限于参数选择以及光谱重叠问题。为了克服流式细胞术的局限性，我们采用了CyTOF技术，该技术使用重金属同位素而非荧光染料来标记抗体，从而消除了检测通道之间的串扰或细胞自身的自发荧光，因此能够在单细胞水平上同时检测更多参数，并对细胞多样性进行更深入的评估12。过去在去除非目标细胞或设门过程中被忽略的细胞群体，尤其是长期以来被认为具有同质性的重要免疫细胞（如中性粒细胞谱系细胞）13,14，现可通过CyTOF得到更精确的表征2,3,<s...

在过去几十年中，细胞计数技术已成为研究骨髓（BM）造血系统的一种强大工具。这些技术包括荧光激活流式细胞术以及使用重金属标记抗体的新型CyTOF技术。它们通过识别不同细胞独特的表面标志物表达谱，实现了在异质性生物样本中发现多种细胞类型。然而，荧光激活流式细胞术中通道数量增加会导致光谱重叠加剧，从而引起更高的数据误差。因此，通常需要去除不需要的细胞，以富集目标细胞群体，便于进行荧光激活流式细胞术分析。例如，Ly6G（或Gr-1）和CD11b被视为成熟髓系细胞的标志物，在对造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行流式细胞术分析前，通常会使用磁珠富集试剂盒从骨髓样本中去除Ly6G+（或Gr-1+）和CD11b+细胞，或者将这些标志物组合在一个弃除通道（dump cocktail channel）中加以排除1,2,3。另一个例子是，在免疫学研究中，通常会从人外周血样本中去除中性粒细胞，以富集外周血单个核细胞（PBMC）。然而，从小鼠或人分离得到的全骨髓样本却很少被完整地用于细胞计数分析。
近年来，CyTOF 已成为研究造血系统的一种革命性工具4,5,6。在 CyTOF 技术中，荧光素标记的抗体被重金属元素标记的抗体所取代。该方法可同时检测超过 40 种标志物，且无需担心光谱重叠问题。它使得在无需预先耗竭步骤或“倾倒通道”（dump channel）的情况下，对完整的生物样本进行分析成为可能。因此，我们能够以高维度的信息内容，全面地观察造血系统，超越传统二维流式细胞术图谱的局限。过去在耗竭或设门过程中被忽略的细胞群体，如今可通过 CyTOF 产生的高维数据得以揭示4,5。我们设计了一套抗体组合，可同时检测造血系统中的 39 个参数，重点关注髓系细胞谱系7。与传统的流式细胞术数据相比，对 CyTOF 产生的前所未有的单细胞高维数据进行解读和可视化具有挑战性。计算科学家已开发出多种降维技术，用于高维数据集的可视化。本文中我们采用了 viSNE 算法，该算法基于 t-分布随机邻域嵌入（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding, t-SNE）技术，用于分析 CyTOF 数据，并将高维结果呈现在二维图谱上，同时保留数据的高维结构8,9,10。在 tSNE 图中，相似的细胞被聚类为亚群，颜色用于突出细胞的特征。例如，在图 1中，髓系细胞根据其在 CyTOF 检测中 33 种表面标志物的表达模式相似性，被分布到多个细胞亚群中（图 1）4。本文中，我们利用先前报道的 39 参数小鼠 CyTOF 抗体组合，结合 viSNE 分析方法，对小鼠骨髓进行了研究7。viSNE 对 CyTOF 数据的分析揭示了一个此前未被识别的细胞群体，该群体同时表现出造血干细胞/祖细胞（HSPC，CD117+）和中性粒细胞（Ly6G+）的特征（图 2）7。
综上所述，我们提出了一种用于质谱流式细胞术（CyTOF）分析的新鲜全骨髓样本处理方案。本文以小鼠骨髓为例进行说明，但该方案同样适用于人骨髓样本的处理。针对人骨髓样本的具体操作细节也在方案中予以注明。本方案的优势在于包含了孵育时间、温度等经过优化的关键参数，旨在保护全骨髓中的中性粒细胞谱系细胞，从而实现对完整全骨髓样本的分析。此外，该方案也可便捷地修改后用于荧光激活流式细胞术（fluorescence-activated flow cytometry）的应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;CyTOF 抗体（小鼠）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）-89Y</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3089005B</td><td></td></tr><tr><td>抗人/小鼠 CD45R/B220（克隆 RA36B2）-176Yb</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3176002B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD105（克隆 MJ7/18）- 纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号：120402；RRID:AB_961070</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD115（CSF-1R）（克隆 AFS98）- 纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号：135502；RRID:AB_1937293</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD117/c-kit（克隆 2B8）-166Er</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3166004B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11a（克隆 M17/4）- 纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号：101101；RRID:AB_312774</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b（克隆 M1/70）-148Nd</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3148003B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c（克隆 N418）-142Nd</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3142003B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD127（IL-7R）&amp;alpha;)（克隆 A7R34）-MaxPar 就绪</td><td>Biolegend</td><td>货号 133919；RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD150（克隆 TC1512F12.2）-167Er</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3167004B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16.2 (Fc&amp;gamma;RIV（克隆9E9）-纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号：149502；RRID:AB_2565302</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD162（克隆 4RA10 (RUO)）- 纯化</td><td>BD 生物科学</td><td>货号：557787；RRID:AB_647340</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD169（Siglec-1）（克隆 3D6.112）- 纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号：142402；RRID:AB_10916523</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD182（CXCR2）（克隆 SA044G4）- 纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号：149302；RRID:AB_2565277</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD183（克隆 CXCR3-173）- 纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号 126502；RRID:AB_1027635</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD335 (NKp46)（克隆 29A1.4）-MaxPar 就绪</td><td>Biolegend</td><td>货号# 137625；RRID:AB_2563744</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD34（克隆 MEC14.7）- 纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号 119302；RRID:AB_345280</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD41（克隆 MWReg30）-MaxPar 就绪</td><td>Biolegend</td><td>货号 133919；RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD43（克隆 S11）-146Nd</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3146009B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD48（克隆 HM48.1）-156Gd</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3156012B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD62L（克隆 MEL-14）-MaxPar 就绪</td><td>ThermoFisher</td><td>货号# 14-1351-82；RRID:AB_467481</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠CD71（克隆RI7217）-纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号 113802；RRID:AB_313563</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD90（克隆 G7）- 纯化</td><td>Biolegend</td><td>货号：105202；RRID:AB_313169</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 F4/80（克隆 BM8）-159Tb</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3159009B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Fc&amp;epsilon;RI&amp;alpha; （克隆 MAR-1）-MaxPar 就绪</td><td>Biolegend</td><td>货号：134321；RRID:AB_2563768</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 GM-CSF（MP1-22E9（仅供研究使用））- 纯化</td><td>BD 生物科学</td><td>货号：554404；RRID:AB_395370</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 I-A/I-E（克隆 M5/114.15.2）-174Yb</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3174003B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ki67（克隆 B56 (RUO)）- 纯化抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>货号：556003；RRID:AB_396287</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)（克隆 D7）-169Tm</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3169015B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly6B（克隆 7/4）- 纯化</td><td>abcam</td><td>货号：ab53457；RRID:AB_881409</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6G（克隆 1A8）-MaxPar 就绪</td><td>Biolegend</td><td>货号 127637；RRID:AB_2563784</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 NK1.1（克隆 PK136）-165Ho</td><td>Fluidigm</td><td>货号 3165018B</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Siglec-F（克隆 E50-2440 (RUO)）- 纯化</td><td>BD 生物科学</td><td>货号：552125；RRID:AB_394340</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 TCR&amp;beta; （克隆 H57-597）-143Nd</td><td>Fluidigm</td><td>（克隆 H57-597）-143Nd</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 TER-119/红系细胞（克隆 TER-119）-MaxPar 就绪</td><td>Biolegend</td><td>货号：116241；RRID:AB_2563789</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;化学品、多肽与重组蛋白 &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体稳定剂</td><td>CANDOR Bioscience</td><td>货号 130050</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 A4503</td><td></td></tr><tr><td>顺铂-194Pt</td><td>Fluidigm</td><td>货号 201194</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x 红细胞裂解缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>货号# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>EQ四元素校准微球</td><td>Fluidigm</td><td>货号 201078</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific</td><td>货号# FB-02</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 磷酸盐缓冲液溶液</td><td>GE 生命科学</td><td>货号#SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>嵌入剂-Ir</td><td>Fluidigm</td><td>货号 201192B</td><td></td></tr><tr><td>MAXPAR 抗体标记试剂盒</td><td>Fluidigm</td><td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 158127</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 S2002</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 X100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA 1x</td><td>康宁</td><td>货号 25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;实验模型：生物体/菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠：C57BL/6J</td><td>杰克逊实验室</td><td>货号：000664</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件算法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>基于微珠的标准化试剂</td><td>Finck 等，2013</td><td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td><td></td></tr><tr><td>Cytobank</td><td>Cytobank</td><td>https://www.cytobank.org/</td><td></td></tr><tr><td>Cytofkit v1.r.0</td><td>陈等，2016</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td><td></td></tr><tr><td>t-SNE</td><td>van der Maaten 和 Hinton，2008</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

中性粒细胞谱系细胞的全骨髓样本制备用于质谱流式分析

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

本文介绍了一种优化的实验方案，旨在保存新鲜骨髓（BM）中的中性粒细胞谱系细胞，以用于全骨髓质谱流式细胞术（CyTOF）分析。我们采用了一个偏向髓系细胞的39抗体CyTOF检测组合，结合该方案对造血系统进行评估，重点关注中性粒细胞谱系细胞。通过开放资源的降维算法viSNE分析CyTOF结果，并展示该方案所获得的数据。基于此方案，我们发现了新的中性粒细胞谱系细胞群体。该新鲜全骨髓制备方案可用于：1）通过CyTOF分析从全骨髓中发现尚未鉴定的细胞群体；2）研究血液疾病（如白血病）患者全骨髓的异常缺陷；3）辅助优化使用新鲜全骨髓样本的荧光激活流式细胞术实验方案。

图1 展示了质谱流式细胞术（CyTOF）实验的一个示例结果。在此tSNE图中，来自多个小鼠组织的细胞根据质谱流式33参数检测面板所测量的表面标志物表达谱的相似性，被聚类为不同的细胞亚群。根据每个细胞上33个标志物的表达情况，性质更为相似的细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞）被自动聚集成簇。
图2 作为本研究中所述小鼠骨髓CyTOF实验方案的一个示例结果展示。该方案保持了骨髓完整性的前提下，成功发现了一个此前未知的共表达中性粒细胞（Ly6G）的细胞群体+, 图 2A）和 HSPC（CD117+, 图2B）表面标志物的同时检测。该细胞群体在我们采用的CyTOF检测面板所测定的表面标志物表达上呈现出独特的表达模式（图2C）并且由于Ly6G的存在...

本文介绍了一种处理从小鼠或人新鲜骨髓（BM）中分离的中性粒细胞谱系细胞的实验方案，用于高维质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF）分析。

本文介绍了一种优化的实验方案，旨在保存新鲜骨髓（BM）中的中性粒细胞谱系细胞，以用于全骨髓样本的质谱流式细胞术（CyTOF）分析。我们采用了一种……

该质谱流式细胞术方案可保持整个骨髓的完整性，从而挽救在传统样本制备过程中因研究不足的细胞而丢失的信息。这种快速且简便的骨髓分离方案有助于获取具有活力的短寿命髓系细胞群体，例如稀有的中性粒细胞谱系亚群。利用质谱流式细胞术鉴定以往未被充分重视的免疫细胞（如中性粒细胞谱系细胞），可能对多种疾病的研究具有广泛意义。该方案可保持骨髓中短寿命髓系细胞的完整性，并可轻松适用于其他组织类型，如实体瘤。我们已对方案进行了简化，以尽可能提高操作的便捷性，但与所有生物学研究一样，可能需要进行数次预实验才能熟练掌握。首次操作时，可先准备好所有试剂，然后严格遵循本方案进行操作。如果您遇到任何问题，可以登录 CyTOForum 与其他 CyTOF 用户交流，以获得故障排除方面的帮助。对于生物样本的制备，一些简单的技巧可能对最终结果产生显著影响。对于新用户而言，通过可视化演示来理解实验方案会更加容易。如果是首次进行该操作，可先准备好试剂，然后严格遵循实验方案。进行骨髓采集时，将一只6至10周龄的C57黑六小鼠仰卧置于无菌手术垫上，用70%乙醇消毒腹部和后肢。使用解剖剪剪开腹腔，并去除皮肤以暴露后肢。使用一对钝头敷料镊，在小鼠胫骨踝关节下方夹住胫骨，并用一对弯头敷料镊在钝头敷料镊下方固定胫骨。用钝头敷料镊折断胫骨并去除肌肉，以暴露骨骼。在将胫骨放入冷PBS之前，将用于固定的弯头敷料镊移至股骨，并将钝头敷料镊滑至膝关节下方以夹住髌骨。轻轻上提以脱位髌骨，并将肌肉从髌骨上剥离，暴露股骨。用弯头敷料钳夹住暴露的股骨，使用手术剪从骨底部切断股骨。随后将股骨置于PBS中。接下来，使用18号针头在0.5毫升微量离心管上打一个孔，将两根骨骼放入该管中，使骨骼的开口端朝下插入孔中。将0.5毫升管放入1.7毫升微量离心管中，将双层管置于微量离心机中离心。离心结束后，确认骨髓已完全被甩出至管底。为了对骨髓细胞进行质谱流式染色，将骨髓重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育10分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于1毫升预冷的PBS中。使用70 µm细胞筛将细胞过滤至15 mL锥形管中，并用9 mL新鲜预冷的PBS洗涤细胞。将骨髓细胞沉淀重悬于10毫升新鲜的冷PBS中进行计数，并将5 × 10⁶个细胞分装至新的15毫升离心管中。通过离心收集细胞，再将细胞重悬于1毫升质谱流式染色缓冲液中，该缓冲液中添加了125纳摩尔的顺铂。室温孵育5分钟后，用4毫升新鲜的质谱流式缓冲液洗涤细胞。将沉淀重悬于50 µL的FC受体阻断溶液中。在4°C条件下孵育10分钟后，向细胞中加入50 µL感兴趣的抗体混合液，轻轻吹打混匀。不同孵育步骤中的温度对于维持骨髓细胞的活性至关重要。在4°C条件下孵育30分钟后，每次用2毫升新鲜的质谱流式缓冲液洗涤细胞，共洗涤两次，然后将细胞重悬于1毫升新配制的1.6%甲醛溶液中，在室温下固定15分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于1毫升固定透化缓冲液中，该缓冲液中添加了125 nmol的嵌入溶液，于4°C过夜孵育。在进行质谱流式分析前，轻轻涡旋混匀细胞悬液并离心，然后用2毫升新鲜的质谱流式染色缓冲液洗涤细胞。接下来，用一毫升蒸馏水洗涤细胞两次，每次洗涤后弃去上清液；第二次洗涤后，小心吸除上清液，然后将细胞重悬于质谱流式缓冲液中，调整细胞浓度至每毫升含1 × 10⁶个细胞，用于质谱流式分析。在此t分布随机邻域嵌入（t-SNE）图中，来自多只小鼠不同组织的细胞根据其表面标志物表达谱的相似性被聚类为不同的细胞亚群，该表达谱由包含33个参数的质谱流式抗体 panel 所测定。根据每个细胞上这些标志物的表达情况，性质更为相似的细胞被自动聚类在一起。采用该方法后，骨髓整体的完整性得以保留，从而发现了一群此前未知的细胞群体，这类细胞同时共表达中性粒细胞和造血干细胞及祖细胞的特征性表面标志物。由于在髓系祖细胞研究中通常会去除Ly6G阳性细胞，这一细胞群体此前一直被忽略，但其表面标志物的表达具有独特的模式。更重要的是，这些数据进一步揭示出Ly6G阳性细胞簇中存在一个微小子集，其本身并不表达Ly6G，但在聚类分析中与CD117阳性且Ly6G阳性的细胞紧密聚集，提示基于本项质谱流式细胞术实验所使用的33种表面标志物的表达情况，这些细胞与中性粒细胞谱系具有相似性。随后可构建一个13色荧光激活的细胞分选面板，从而通过流式细胞术分离中性粒细胞前体，用于后续功能分析。骨髓分离操作应尽快完成，并在染色过程中将细胞保持在4°C。

preparation-whole-bone-marrow-for-mass-cytometry-analysis-neutrophil

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

全骨髓的制备,用于中性粒系细胞的大规模细胞测定分析

本视频介绍了一种详细的实验方案，用于从小鼠后肢分离新鲜的完整骨髓，以研究白血病等血液疾病患者的全骨髓缺陷。...

从小鼠后肢采集骨髓

我们描述了一种通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离和纯化中性粒细胞，并使用CellTracker染料对中性粒细胞进行标记的实验方案。该方法简单、快速、可重复且经济，适用于获取大量中性粒细胞，以用于后续的功能研究或过继转移与示踪实验。...

小鼠骨髓中性粒细胞的分离、纯化及标记用于功能研究与过继性转移实验

我们报道了一种利用荧光激活细胞分选技术从易患狼疮小鼠的骨髓中高纯度分离浆细胞样树突状细胞（pDC）的方案，用于pDC的功能研究。...

利用荧光激活细胞分选法从鼠骨髓中纯化浆细胞样树突状细胞

本文提供了一种利用高速细胞分选技术鉴定并分离大量由GM-CSF驱动的髓系细胞的方法。根据Ly6C和CD115的表达情况，可鉴定出五种不同的细胞群体（共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞以及单核细胞来源的树突状细胞）。...

利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

在缺乏形态学标准或细胞遗传学信息不明确的情况下，骨髓增生异常综合征（MDS）的诊断较为困难。多参数流式细胞术（MFC）可能有助于优化MDS的诊断流程。为了在临床实践中具有应用价值，MFC分析必须基于具备足够特异性和敏感性的参数，且不同操作者之间的数据应具有可重复性。...

基于数据库指导的流式细胞术评估骨髓髓系细胞成熟度

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪逐步测定小鼠和人类中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的实验方案。...

中性粒细胞线粒体生物能量谱的实时测量

单细胞/单细胞核转录组学和多组学研究的成功在很大程度上取决于细胞/细胞核的质量。因此，从组织中分离细胞/细胞核并进行纯化的步骤必须高度标准化。本方案描述了为后续单细胞核多组学检测制备脑组织和骨髓细胞核的方法。...

高质量脑组织与骨髓细胞核制备用于单细胞核多组学分析

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。...

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

本文概述了一种从小鼠骨髓中分离中性粒细胞并构建ATAC-seq文库的实验方案，旨在确保中性粒细胞的高存活率和高质量文库的制备。文章提供了骨髓细胞制备、免疫磁珠分选及文库构建的详细步骤，为中性粒细胞研究领域的新手研究人员提供了有价值的参考指南。...

小鼠骨髓来源中性粒细胞的ATAC-Seq文库制备

学习全骨髓制备方法，用于质谱流式细胞术分析中性粒系细胞。该方案可保存短寿命髓系细胞完整性，帮助研究人员识别稀有免疫细胞亚群并探索疾病机制。

中性粒细胞谱系细胞的全骨髓样本制备用于质谱流式分析

探索更多视频