Name: 翻译核糖体亲性纯化(TRAP),用于从体内内皮细胞中分离RNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学习翻译核糖体亲性纯化(TRAP)技术，用于从小鼠脑、肺和心脏组织的血管内皮细胞中分离核糖体结合的mRNA。该方法利用EGFP标记的核糖体，实现特异性mRNA纯化，助力血管生成和心血管疾病研究。

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Ren博士的研究工作得到了美国心脏协会（13SDG14800019；BR）、Ann's Hope基金会（FP00011709；BR）、美国癌症协会（86-004-26；MCW癌症中心至BR）以及美国国立卫生研究院（HL136423；BR）的资助；Jordan Palmer得到了2018年MCW CTSI 500 Stars实习项目的资助；P. Moran得到了美国国家心肺血液研究所机构研究培训基金（5T35 HL072483-34）的资助。

对于动物实验，本文所述所有方法均已获得威斯康星医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 准备试剂
<ol>
	<li>配制裂解缓冲液，使其含有 10 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、0.5 mM DTT、100 µg/mL 环己酰亚胺、蛋白酶抑制剂以及重组 RNase 抑制剂，各成分浓度如下所述。
	<ol>
		<li>将以下试剂加入 500 mL 无 RNase 的去离子水中：1.19 g HEPES、5.59 g KCl、0.24 g MgCl2、35 mg DTT、0.5 mL 环己酰亚胺，根据需要加入 NaOH 调节 pH 至 7.4，再加入无 EDTA 的蛋白酶抑制剂（每 10 mL 加一片小片剂）和 RNase 抑制剂（10 µL/mL）。</li>
		<li>置于 4 °C 冰箱中保存，可保存长达 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制高盐多聚核糖体洗涤缓冲液，使其含有 10 mM HEPES（pH 7.4）、350 mM KCl、5 mM MgCl2、1% vol/vol CA-630、0.5 mM DTT 和 100 µg/mL 环己酰亚胺。
	<ol>
		<li>将以下试剂加入 500 mL 无 RNase 的去离子水中：1.19 g HEPES、13.05 g KCl、0.24 g MgCl2、5 mL 非离子型非变性去垢剂、5 管 7.7 mg 的 DTT 和 0.5 mL 环己酰亚胺，根据需要加入 NaOH 调节 pH 至 7.4。</li>
		<li>置于 4 °C 冰箱中保存，可保存长达 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在开始实验前，将抗 GFP 抗体与 Protein G 磁珠结合。
	<ol>
		<li>将 10 µg 抗 GFP 抗体溶于 200 µL PBS 中，加入 Protein G 磁珠。</li>
		<li>室温下以翻转混匀方式孵育 10 分钟。</li>
		<li>将磁珠置于磁力架上，吸除上清液。</li>
		<li>用 200 µL PBS 重悬磁珠，置于 4 °C 冰箱中保存，可保存长达 1 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制含 100 µg/mL 环己酰亚胺的冰冻 PBS。
	<ol>
		<li>将 1 体积环己酰亚胺溶液（100 mg/mL）加入 999 体积的冰冻 PBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分离并裂解目标组织
<ol>
	<li>通过腹腔注射戊巴比妥（500 mg/kg体重）和赛拉嗪（10 mg/kg体重）处死小鼠，并分离所需组织（例如心脏、肺）。立即进行下一步操作。</li>
	<li>将所需组织放入含有环己酰亚胺（100 µg/mL）的500 µL冰浴PBS中。</li>
	<li>使用电动匀浆器或小间隙玻璃匀浆器将组织研磨成细胞悬液。若使用电动匀浆器，匀浆时间应限制在1分钟以内，且保持低频率（&#60;15,000 Hz），以避免RNA变性。</li>
	<li>通过反复吹吸，用200 µL裂解缓冲液重悬细胞沉淀。随后在小间隙玻璃匀浆器中进行10次抽吸，或在电动匀浆器中以低频率（&#60;15,000 Hz）匀浆15秒，进一步均质化细胞悬液。</li>
	<li>在4 °C条件下，以2,000 × g离心10分钟，沉淀细胞核和大颗粒细胞碎片，保留上清液。</li>
	<li>向上清液中加入非离子性、非变性去污剂至终浓度1%（v/v），并加入DHPC至终浓度30 mM。冰上孵育5分钟。</li>
	<li>以16,000 × g离心10分钟，沉淀不溶性物质。转移并保留15%澄清裂解液作为输入样本，用于后续步骤。</li>
</ol>
3. 分离核糖体/mRNA 复合物
<ol>
	<li>向细胞裂解物上清液中加入 50 µL 抗体结合的磁珠，并在 4 °C 下以翻转旋转方式孵育 30 分钟。在此步骤中，抗 GFP 抗体将结合 GFP 标记的核糖体，从而允许我们进一步分离这些核糖体中的 RNA。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上收集，并用高盐多聚核糖体洗涤缓冲液洗涤 5 次。
	<ol>
		<li>当磁珠吸附至管壁一侧后，吸出并弃去液体。随后用移液器反复吹打 200 µL 高盐多聚核糖体洗涤缓冲液数次。重复此步骤 5 次，最后一次洗涤后弃去全部缓冲液。立即进入下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分离 mRNA
<ol>
	<li>将珠子放入RLT缓冲液中。以下步骤直接来自RNeasy mini试剂盒说明书，未作任何扩展。 
	注意：RLT缓冲液含有胍盐；切勿与漂白剂混合。</li>
	<li>在4 °C条件下，以13,000 rpm或16,000 g离心裂解液3分钟。用移液器小心吸取350 µL上清液，并转移至新的微量离心管中。后续步骤中仅使用此上清液（裂解液）。</li>
	<li>向微量离心管中加入等体积的70%乙醇。</li>
	<li>将最多700 µL样品（包括可能形成的任何沉淀）转移至置于2 mL收集管中的离心柱中。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜。弃去穿流液。</li>
	<li>向离心柱中加入350 µL RW1缓冲液。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜。弃去穿流液，并在下一步中重复使用该收集管。 
	注意：RW1缓冲液含有胍盐；切勿与漂白剂混合。</li>
	<li>向离心柱中加入350 µL RW1缓冲液。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心15秒。弃去穿流液。</li>
	<li>向离心柱中加入500 µL RPE缓冲液。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜。弃去穿流液。</li>
	<li>向离心柱中加入500 µL RPE缓冲液。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心2分钟，以洗涤离心柱膜。然后小心地将离心柱从收集管中取出，确保柱子不接触穿流液。</li>
	<li>将离心柱放入一个新的2 mL收集管中，并丢弃含有穿流液的旧管。轻轻盖上盖子，并在最大转速下离心1分钟，以去除残留缓冲液。</li>
	<li>将离心柱放入一个新的1.5 mL收集管中。直接向离心柱膜上加入30–50 µL无RNase水。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心1分钟，以洗脱RNA。</li>
	<li>若预期RNA产量&#62;30 µg，则使用另30–50 µL无RNase水重复步骤4.10，或使用步骤4.10的洗脱液（如需高浓度RNA）。重复使用步骤4.10中的收集管。</li>
	<li>将纯化的RNA用于下游分析，如RNA测序或实时定量PCR，或将溶解于无RNase H2O中的RNA在-80 °C保存最多1年。</li>
</ol>

<ol><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li>
<li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF%2FPKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA%2FPKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosclerosis+Thrombosis%2C+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li>
<li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).</li>
<li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond%3A+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li>
<li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA%2FPKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li>
<li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

血管生成是一个复杂的多步骤过程，其中内皮细胞（EC）特异性的血管生成相关基因的转录与表达在EC分化及血管生成重编程中起着至关重要的作用3,4。为了克服细胞多样性及结构复杂性带来的障碍，从而更深入地在活体水平上从分子层面理解哺乳动物血管系统的功能，我们利用Pu实验室开发的通用型floxed TRAP小鼠模型或EGFP-TRAP小鼠2，结合其他基因工程小鼠品系，构建了EC特异性的TRAP小鼠模型，并进一步获得了EC特异性的cd36缺失、EC特异性的pkd-1缺失或全身性的cd36缺失小鼠。该模型可在活体条件下，针对EC特异性的pkd-1缺失或全身性cd36基因表达缺失情况，检测完整组织中血管内皮细胞全部翻译中的mRNA谱系8，这对于研究与生理性和病理性血管生成相关的基因转录具有重要意义4<sup...

在哺乳动物脑、心脏和肺等复杂组织中，细胞的高度异质性使得基于全组织样本获得的基因表达数据的分析变得复杂。为了在体内观察特定细胞类型的基因表达谱，近年来开发出一种新方法，可对任意遗传学定义的细胞类型中全部正在翻译的mRNA进行检测。该方法被称为翻译核糖体亲和纯化（translating ribosome affinity purification, TRAP）技术1,2。当该技术与在动物体内遗传操控其他血管生成相关基因的方法相结合时，成为研究内皮细胞生物学和血管生成的有力工具。
我们已证明，促血管生成的PKD-1信号通路以及促血管生成基因CD36的转录对内皮细胞（EC）的分化和功能性血管生成至关重要3,4,5,6。为了阐明促血管生成和代谢信号在基因转录及内皮细胞转分化中的分子机制，我们基于TRAP技术构建了基因工程化的TRAP小鼠，特异性地删除了促血管生成相关基因1,2。此外，在我们的TRAP动物模型中，不仅在血管内皮中特异性缺失pkd-1或cd36基因或全身性缺失cd36基因，而且还将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在遗传上标记至内皮细胞的翻译核糖体上。TRAP技术可实现从靶组织血管内皮中直接亲和纯化与核糖体结合的mRNA，从而能够在体内条件下直接分析基因表达，并鉴定与内皮细胞分化和血管生成相关的新转录组。我们已成功从这些基因工程动物的内皮细胞中分离出与核糖体结合的RNA。所纯化的RNA可用于进一步表征调控内皮细胞分化与功能的促血管生成或促动脉生成基因。本方案提供了在体内直接从内皮细胞中分离mRNA的TRAP技术的逐步操作指南。

<table><tbody><tr><td>使用纳米芯片和皮升芯片的2100电泳生物分析仪</td><td>Agilent</td><td>G2939AA, 5067-1511 &amp;amp; 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器</td><td>Fisher Scientific</td><td>K8855100020</td><td></td></tr><tr><td>磁力架（Dynamag-2）</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td>取决于纯化规模；1.5 mL离心管中的样品可使用DynaMag-2进行浓缩</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C分光光度计</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>制冷离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>配备适用于1.5 mL微量离心管的转子</td></tr><tr><td>无RNase的1.5 mL微量离心管</td><td>Applied Biosystems&amp;nbsp;</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的50 mL锥形管</td><td>Applied Biosystems&amp;nbsp;</td><td>AM12501</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的1000-&amp;mu;L滤芯吸头</td><td>Rainin</td><td>RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的200-&amp;mu;L滤芯吸头</td><td>Rainin&amp;nbsp;</td><td>RT-200F</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的20-&amp;mu;L滤芯吸头</td><td>Rainin&amp;nbsp;</td><td>RT-20F</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器用转子</td><td>Yamato&amp;nbsp;</td><td>LT-400D</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator，Labquake品牌</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-687-12Q</td><td></td></tr></tbody></table>

体内内皮细胞rna分离的核糖体亲和纯化（trap）技术

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

许多研究局限于使用体外细胞实验，或从动物体内分离特定细胞类型，进而通过qPCR和RNA测序对转录组和基因表达进行体外分析。针对复杂组织和器官中特定细胞类型的全面转录组与基因表达分析，对于理解基因调控的细胞与分子机制及其与组织稳态和器官功能之间的关联至关重要。本文以动物肺部血管内皮细胞为例，展示一种直接在活体（in vivo）条件下分离核糖体结合RNA的技术方法。本文将详细描述组织处理和RNA纯化的具体材料与操作步骤，包括RNA质量与得率的评估，以及用于促动脉生成基因检测的实时qPCR分析。该方法被称为翻译核糖体亲和纯化（translating ribosome affinity purification, TRAP）技术，可广泛应用于在复杂组织中直接对特定细胞类型进行活体基因表达和转录组分析。

我们之前的研究4,7表明，CD36可能通过LPA/PKD-1信号通路发挥调节微动脉分化和毛细血管动脉化的作用。为了研究LPA/PKD-1-CD36信号轴是否在体内动脉生成过程中至关重要，我们建立了新型的TRAP小鼠品系，这些品系不仅具有全身性cd36缺失、内皮细胞特异性cd36缺失或pkd-1缺失，还可通过GFP特异性分离cre标记细胞谱系中与核糖体结合的RNA，并可用作cre激活的荧光报告系统2。
通过基因分型分析，我们观察到在内皮特异性 cd36 基因敲除小鼠中，cd36 基因在全身或血管内皮中被完全删除（数据未显示），同时 pkd-1 基因也在血管内皮中被删除。图1 展示了构建成功的全身性 cd36 TRAP 小鼠或内皮特异性 pkd-1 TRAP 小鼠品系的代表性结果。利用免疫荧光显微镜，我们证实了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）在体内被遗传标记至内皮细...

我们介绍一种通过在核糖体中特异性地对血管内皮细胞（ECs）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）进行基因标记，并结合RNA纯化方法，直接从小鼠脑、肺和心脏组织中纯化核糖体结合的mRNA的技术。

体内内皮细胞RNA分离的核糖体亲和纯化（TRAP）技术

许多研究仅局限于使用体外细胞实验、完整组织，或从动物中分离特定细胞类型进行体外分析……

您好，我是任斌，阿拉巴马大学伯明翰医学院外科学与生物医学工程系的副教授。我们实验室致力于研究内皮细胞生物学功能、血管生成以及在常见心血管疾病和癌症背景下的动脉生成。我们的一项研究重点是内皮细胞转分化和血管生成过程中的表观遗传学与转录调控。为了理解血管生成的转录机制，我们建立了转基因工程小鼠品系，不仅在内皮细胞中删除了与血管生成相关的特定基因，还将增强型绿色荧光蛋白（GFP）探针在遗传上标记到内皮细胞核糖体上。通过这种方法，我们能够直接从转基因动物不同组织器官的内皮细胞中分离和纯化与其相关的信使RNA片段。随后，可利用纯化的信使RNA进行转录本及转录组的下游分析。通过RNA测序和实时冰冻PCR。在本视频中，我的学生Patrick Moran和Jordan Palmer，以及研究技术员Nicholas Barnekow和Rong Yuan将向您展示一种对转基因小鼠进行基因分型的方法，并直接从转基因动物的内皮细胞中抽提信使RNA。基因分型是本实验方案中的重要前期步骤，以确保小鼠的内皮细胞核糖体上带有GFP标签。由于所有后续的RNAi分离步骤均依赖于带有GFP标签的核糖体，因此在开始实验前确定基因型至关重要。在开始RNA分离之前，必须完成若干 preparatory 步骤，包括缓冲液的配制以及将抗GFP抗体结合到蛋白G dynabeads上。缓冲液在 4°C 下可保存长达一个月，抗体结合的磁珠在 4°C 下可保存长达一周。因此，在规划实验时需考虑这些限制。使用摩尔驱动的匀浆器是提高 RNA 产量的有效方法。务必使用较低的频率设置和较短的持续时间，以减少RNA降解。如前所述，基因分型是实验方案中的重要初步步骤。确保将通过TRAP技术分离RNA的小鼠至少为TRAP基因的杂合子，理想情况下为纯合子，这一步骤至关重要，因为只有确保GFP标签存在于核糖体上，才能利用抗原-抗体反应以及实验前制备的抗GFP磁珠有效进行后续的拉下实验。从小鼠中分离所需组织，并立即放入含有100微克/毫升环己酰亚胺的预冷PBS溶液中。这可确保终止翻译过程，使转录组能够准确反映小鼠安乐死后前的状态。使用电动匀浆器将组织匀浆成单细胞悬液。理想的时序和频率设置需由各个实验室根据所使用的特定电动匀浆器自行确定。频率设置过高可能导致RNA降解，并影响后续实验步骤。将细胞沉淀重悬于您在实验开始前已准备好的裂解缓冲液中。务必进一步均质化此混合物，以确保在进行后续实验步骤前达到充分的均质化效果。将匀浆在4°C条件下以2,000 × g离心10分钟。此步骤可使细胞核和较大的细胞碎片沉淀，避免其对后续免疫沉淀反应造成干扰。将 DHPC 和 CA-630 脂质加入前一步离心后的上清液中。这些脂质有助于将蛋白质相与其他细胞内组分分离。将悬浮液置于冰上静置五分钟。将裂解液在13,000 × g条件下离心10分钟，以沉淀不溶性物质。保留15%的澄清裂解液用于后续步骤。将与抗GFP抗体结合的磁珠加入细胞裂解液上清中，在4°C下颠倒旋转孵育30分钟。此处抗GFP抗体会与GFP标记的核糖体结合，从而让我们能够进一步分离这些核糖体中的RNA。将磁珠置于磁力架上，并使用您在开始分离前已配制好的高盐多聚核糖体洗涤缓冲液洗涤磁珠五次。随后立即进入下一步，将磁珠放入RLT缓冲液中。将裂解液在最大速度下离心三分钟，小心移除上清液并转移至新的微量离心管中。向澄清的裂解液中加入等体积的70%乙醇，并立即用移液器混匀。立即进行下一步操作，即将最多700微升的样品（包括可能形成的任何沉淀）转移至置于2毫升收集管中的离心柱中。将裂解液在大于 8,000 ×g 的条件下离心 15 秒，以洗涤离心柱膜。弃去流出液，进入下一步操作。向离心柱中加入 350 µL 的 RW1 缓冲液。在大于8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜，并弃去流出液。继续下一步之前，使用另外350 µL缓冲液RW1重复此步骤。向离心柱中加入500 µL缓冲液RPE。在大于8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜。弃去流出液，然后向离心柱中加入另外500 µL RPE缓冲液，重复此步骤。此次在大于8,000 × g条件下离心2分钟，以洗涤离心柱膜。弃去流出液，将离心柱放入一个新的2毫升收集管中，然后以最大速度离心1分钟，以去除可能残留在离心柱上的任何缓冲液。弃去流出液，将离心柱转移至一个新的1.5毫升收集管中。直接向离心柱膜上加入30至50微升无RNase的水。在大于8,000 × g的条件下离心一分钟，以从离心柱膜上洗脱RNA。此时，您的RNA已溶解于无RNase的水中，可在-80°C下保存长达一年。接下来，使用分光光度计对所提取的RNA进行定量并检测其纯度。您需要寻找在 260 纳米处的吸收峰，因为核酸（包括 RNA）在此波长处吸收最强。浓度显示在图像右下角，单位为纳克每微升（ng/µL）。纯度可通过 260/230 比值判断，该比值位于右下角浓度值上方一项的位置。我们的方法显示出RNA得率较低，尤其是在从心脏组织或先前冷冻的组织中纯化mRNA时更为明显。因此，我们需要优化条件以提高得率。然而，我们确实观察到，在内皮细胞特异性CD-36缺陷小鼠中，与对照组相比，肺和心脏内皮细胞中ephrin B2和DLL4的水平均显著升高。这些结果与我们之前的体外研究一致，表明RNA质量足以满足下游分析的要求。由于实验环境条件较为严格，产量较低。为克服这一限制，关键是要建立无RNase的工作区域，并对可能被RNase污染的工作台面和设备进行去污处理，同时频繁更换手套，以提取高质量的RNA并提高产量。此外，必须找到亲和层析基质中GFP抗体的合适浓度，在组织裂解缓冲液中使用适当浓度的RNase抑制剂，并在从靶组织的内皮核糖体中提取RNA时使用无RNase的塑料器皿和试剂。

translating-ribosome-affinity-purification-trap-for-rna-isolation

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

翻译核糖体亲性纯化(TRAP),用于从体内内皮细胞中分离RNA

对含有新生肽酰-tRNA的核糖体进行生化分析的主要障碍在于，同一样品中存在其他核糖体，这些核糖体并未参与待分析的特定mRNA序列的翻译。我们开发了一种简单的方法，可特异性纯化仅含有目标新生肽酰-tRNA的核糖体。...

分离含有肽基-tRNA的翻译核糖体用于功能与结构分析

本视频演示了一种 体外 RNA下拉实验用于鉴定与mRNA中腺苷酸-尿苷酸富集元件（ARE）序列相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）。将细胞裂解液中的目标RBPs与RNA探针混合，形成RNA-蛋白质复合物，随后分离这些复合物 通过...

RNA-蛋白质下拉实验通过亲和提取分离RNA结合蛋白

翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification,...

稀有细胞群体的核糖体亲和纯化技术（TRAP-rc） 黑腹果蝇 胚胎

本文描述了一种通过特异性寡核苷酸定向富集的方法，用于分离在真核细胞中形成的特定同源核糖核蛋白复合物（RNP）。我们通过分离与逆转录病毒5'非翻译区结合的同源RNP（其组分包含DHX9/RNA解旋酶A）来展示该方法的适用性。...

利用寡核苷酸定向洗脱法从细胞中分离同源RNA-蛋白质复合物

本文描述了一种用于回收内源性形成的mRNA-蛋白质复合物的串联RNA分离流程（TRIP）。具体而言，首先在活体（in...

一种基于寡核苷酸的串联RNA分离方法以回收真核生物mRNA-蛋白质复合物

核糖体亲和纯化技术（TRAP）能够快速高效地分离特定细胞类型的翻译中mRNA。在此，我们展示了一种方法，该方法结合了在肝细胞再生小鼠模型中进行的水动力尾静脉注射与TRAP技术，以检测再生肝细胞的基因表达谱。...

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

本文介绍了利用RiboTag系统从成年雄性小鼠特定生殖细胞群体中免疫沉淀核糖体及其结合RNA的方法。通过合理的杂交育种和严谨的免疫沉淀操作，可获得纯净且可重复的结果，从而揭示生殖细胞的翻译组特征，并有助于深入理解突变表型的作用机制。...

雄性小鼠生殖细胞中的RiboTag免疫沉淀

我们介绍一种利用甲醛交联在活酵母和哺乳动物细胞中快速稳定翻译（蛋白质生物合成）复合物的技术。该方法能够解析瞬时中间产物以及动态的RNA:蛋白质相互作用。交联后的复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜观察和质谱分析。...

快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、定位、折叠和组装过程中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析法，这是一种用于在模式真核生物Saccharomyces...

通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

本方案旨在利用 NuTRAP 小鼠模型分离特定细胞类型的翻译核糖体...

无需细胞分选从速冻异质组织样本中分离细胞类型特异性RNA

AviTag特异性定位限制性光照增强生物素化（ALIBi）是一种新型的光遗传学激活方法，用于标记和亲和纯化亚细胞区域的核糖体亚群，以进行后续的测序和蛋白质组学分析。...

基于重组肽标签特异性定位限制性光照增强生物素化的亚细胞核糖体亚群分离

学习翻译核糖体亲性纯化(TRAP)技术，用于从小鼠脑、肺和心脏组织的血管内皮细胞中分离核糖体结合的mRNA。该方法利用EGFP标记的核糖体，实现特异性mRNA纯化，助力血管生成和心血管疾病研究。

体内内皮细胞RNA分离的核糖体亲和纯化（TRAP）技术

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