体内内皮细胞RNA分离的核糖体亲和纯化（TRAP）技术

您好，我是任斌，阿拉巴马大学伯明翰医学院外科学与生物医学工程系的副教授。我们实验室致力于研究内皮细胞生物学功能、血管生成以及在常见心血管疾病和癌症背景下的动脉生成。我们的一项研究重点是内皮细胞转分化和血管生成过程中的表观遗传学与转录调控。

为了理解血管生成的转录机制，我们建立了转基因工程小鼠品系，不仅在内皮细胞中删除了与血管生成相关的特定基因，还将增强型绿色荧光蛋白（GFP）探针在遗传上标记到内皮细胞核糖体上。通过这种方法，我们能够直接从转基因动物不同组织器官的内皮细胞中分离和纯化与其相关的信使RNA片段。随后，可利用纯化的信使RNA进行转录本及转录组的下游分析。

通过RNA测序和实时冰冻PCR。在本视频中，我的学生Patrick Moran和Jordan Palmer，以及研究技术员Nicholas Barnekow和Rong Yuan将向您展示一种对转基因小鼠进行基因分型的方法，并直接从转基因动物的内皮细胞中抽提信使RNA。基因分型是本实验方案中的重要前期步骤，以确保小鼠的内皮细胞核糖体上带有GFP标签。

由于所有后续的RNAi分离步骤均依赖于带有GFP标签的核糖体，因此在开始实验前确定基因型至关重要。在开始RNA分离之前，必须完成若干 preparatory 步骤，包括缓冲液的配制以及将抗GFP抗体结合到蛋白G dynabeads上。

缓冲液在 4°C 下可保存长达一个月，抗体结合的磁珠在 4°C 下可保存长达一周。因此，在规划实验时需考虑这些限制。使用摩尔驱动的匀浆器是提高 RNA 产量的有效方法。

务必使用较低的频率设置和较短的持续时间，以减少RNA降解。如前所述，基因分型是实验方案中的重要初步步骤。确保将通过TRAP技术分离RNA的小鼠至少为TRAP基因的杂合子，理想情况下为纯合子，这一步骤至关重要，因为只有确保GFP标签存在于核糖体上，才能利用抗原-抗体反应以及实验前制备的抗GFP磁珠有效进行后续的拉下实验。

从小鼠中分离所需组织，并立即放入含有100微克/毫升环己酰亚胺的预冷PBS溶液中。这可确保终止翻译过程，使转录组能够准确反映小鼠安乐死后前的状态。使用电动匀浆器将组织匀浆成单细胞悬液。

理想的时序和频率设置需由各个实验室根据所使用的特定电动匀浆器自行确定。频率设置过高可能导致RNA降解，并影响后续实验步骤。将细胞沉淀重悬于您在实验开始前已准备好的裂解缓冲液中。

务必进一步均质化此混合物，以确保在进行后续实验步骤前达到充分的均质化效果。将匀浆在4°C条件下以2,000 × g离心10分钟。此步骤可使细胞核和较大的细胞碎片沉淀，避免其对后续免疫沉淀反应造成干扰。

将 DHPC 和 CA-630 脂质加入前一步离心后的上清液中。这些脂质有助于将蛋白质相与其他细胞内组分分离。将悬浮液置于冰上静置五分钟。

将裂解液在13,000 × g条件下离心10分钟，以沉淀不溶性物质。保留15%的澄清裂解液用于后续步骤。将与抗GFP抗体结合的磁珠加入细胞裂解液上清中，在4°C下颠倒旋转孵育30分钟。

此处抗GFP抗体会与GFP标记的核糖体结合，从而让我们能够进一步分离这些核糖体中的RNA。将磁珠置于磁力架上，并使用您在开始分离前已配制好的高盐多聚核糖体洗涤缓冲液洗涤磁珠五次。随后立即进入下一步，将磁珠放入RLT缓冲液中。

将裂解液在最大速度下离心三分钟，小心移除上清液并转移至新的微量离心管中。向澄清的裂解液中加入等体积的70%乙醇，并立即用移液器混匀。立即进行下一步操作，即将最多700微升的样品（包括可能形成的任何沉淀）转移至置于2毫升收集管中的离心柱中。

将裂解液在大于 8,000 ×g 的条件下离心 15 秒，以洗涤离心柱膜。弃去流出液，进入下一步操作。向离心柱中加入 350 µL 的 RW1 缓冲液。

在大于8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜，并弃去流出液。继续下一步之前，使用另外350 µL缓冲液RW1重复此步骤。向离心柱中加入500 µL缓冲液RPE。

在大于8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜。弃去流出液，然后向离心柱中加入另外500 µL RPE缓冲液，重复此步骤。此次在大于8,000 × g条件下离心2分钟，以洗涤离心柱膜。

弃去流出液，将离心柱放入一个新的2毫升收集管中，然后以最大速度离心1分钟，以去除可能残留在离心柱上的任何缓冲液。弃去流出液，将离心柱转移至一个新的1.5毫升收集管中。直接向离心柱膜上加入30至50微升无RNase的水。

在大于8,000 × g的条件下离心一分钟，以从离心柱膜上洗脱RNA。此时，您的RNA已溶解于无RNase的水中，可在-80°C下保存长达一年。接下来，使用分光光度计对所提取的RNA进行定量并检测其纯度。

您需要寻找在 260 纳米处的吸收峰，因为核酸（包括 RNA）在此波长处吸收最强。浓度显示在图像右下角，单位为纳克每微升（ng/µL）。纯度可通过 260/230 比值判断，该比值位于右下角浓度值上方一项的位置。

我们的方法显示出RNA得率较低，尤其是在从心脏组织或先前冷冻的组织中纯化mRNA时更为明显。因此，我们需要优化条件以提高得率。然而，我们确实观察到，在内皮细胞特异性CD-36缺陷小鼠中，与对照组相比，肺和心脏内皮细胞中ephrin B2和DLL4的水平均显著升高。

这些结果与我们之前的体外研究一致，表明RNA质量足以满足下游分析的要求。由于实验环境条件较为严格，产量较低。为克服这一限制，关键是要建立无RNase的工作区域，并对可能被RNase污染的工作台面和设备进行去污处理，同时频繁更换手套，以提取高质量的RNA并提高产量。

此外，必须找到亲和层析基质中GFP抗体的合适浓度，在组织裂解缓冲液中使用适当浓度的RNase抑制剂，并在从靶组织的内皮核糖体中提取RNA时使用无RNase的塑料器皿和试剂。