人类囊胚活检与玻璃化冷冻

囊胚活检和玻璃化冷冻技术在体外受精（IVF）领域均具有革命性意义，使全球的胚胎学家能够对人类胚胎进行植入前遗传学检测，同时将胚胎所面临的风险降至最低。滋养层细胞活检技术使得从一个完全发育的胚胎中获取约七个细胞成为可能，从而为可靠的下游遗传分析提供了条件。此外，迄今为止尚未发现该方法对胚胎产生不良影响。

该工作流程的临床效率使得单基因疾病患者以及所有囊胚染色体异常风险升高的患者均能受益于胚胎植入前遗传学检测。目前的胚胎筛选策略仍有改进空间。例如，对单个滋养层活检样本进行miRNA组学和蛋白质组学分析，是补充胚胎植入前遗传学检测的颇具吸引力的选择。

缺乏经验的操作者在打开和穿透透明带时常遇到困难。关键在于聚焦。囊胚、激光物镜和移液管应位于同一焦平面上。

用永久性无毒标记笔在活检培养皿上标注患者的详细信息后，使用胚胎编号和周期编号对每10微升一份的HEPES缓冲液滴进行编号。用300微米的剥离吸管将一个存活且完全扩张的囊胚转移至活检培养皿的第一个液滴中，并冲洗该液滴以去除多余的培养基，然后将囊胚移入培养皿的第二个液滴中。将培养皿置于倒置显微镜下，用活检培养皿第三个液滴中的培养基预润湿活检吸管。在20倍放大倍数下，调整囊胚的方向，使内细胞团在7点钟位置清晰可见，并用固定吸管固定胚胎。

聚焦于透明带，使移液管和囊胚处于同一焦平面上。切换到激光物镜，将激光指针定位在内细胞团对侧的透明带上。用两到三次激光脉冲在透明带上打孔，然后轻轻将活检移液管抵住透明带，使培养基从破口处冲出，从而将滋养层细胞从内表面分离。

当滋养层细胞脱离时，通过小孔进入，用活检吸管轻轻抽吸7至8个滋养层细胞。在施加适度负压以拉伸目标细胞的同时，轻微向后移动活检吸管，并将激光对准所吸细胞最薄的部位。在细胞间的连接处发射2至5次激光脉冲，以将目标细胞从胚胎本体上分离。

当滋养层片段从囊胚分离后，将其释放到同一活检液滴中远离囊胚的位置，以防止片段被重新吸入活检吸管。松开固定吸管中的囊胚，并迅速抬起两根吸管，以避免片段粘附在吸管上。随后对活检所得的片段进行成像，以用于质量控制。

当所有囊胚均按上述方法完成活检后，将活检培养皿移回超净工作台，用夫妇编号标记活检后培养皿，并用胚胎编号和周期编号标记每个液滴。在见证人见证下，用干净的体外受精培养基清洗囊胚，然后将囊胚转移至活检后培养皿中对应的液滴中。随后将活检后的培养皿置于37摄氏度、6%二氧化碳和5%氧气的培养箱中。

在见证人面前，于室温下的超净工作台内，使用永久性、无毒标记笔标记PCR管。用活检胚胎编号标记直径60毫米、高度15毫米培养皿的皿盖，并向培养皿中加入两滴10微升的活检洗涤液。在体视显微镜下，用培养皿中第二滴活检洗涤液对140微米剥离移液管进行预润，以观察滋养层片段。

轻轻将部分活检洗涤液释放到滋养层片段上，并将该片段吸入剥离移液管中。将片段转移至第二滴活检洗涤液中，小心冲洗组织两到三次。用上样液将滋养层片段转移至相应标记的PCR管底部，注意避免剥离移液管尖端接触管壁。

当所有片段都加入到各管中后，将所有管子放入小型离心机中离心数秒，以沉淀片段。随后将样本储存于负20摄氏度，直至运送至送检的遗传学实验室进行检测。在滋养层活检后的30分钟内，用患者的详细信息以及需要玻璃化冷冻的囊胚编号标记玻璃化冷冻板。

使用特殊的耐低温冷冻标签，在玻璃化冷冻支撑架上标记患者的姓名、姓氏、夫妇编号、将要加载的胚胎编号以及操作日期。在室温下，为每个将要进行玻璃化冷冻的囊胚分配300微升平衡液，并在见证人见证下，使用300微米的剥离吸管将囊胚转移至一份平衡液中。让囊胚在平衡液中停留13至15分钟。

在体积初始收缩后，将观察到逐渐重新扩张的现象。平衡结束时，向玻璃化冷冻板的第二个孔中加入 300 微升玻璃化冷冻液，并将完全重新扩张的囊胚转移至该溶液中，停留一分钟。孵育结束后，用溶液冲洗囊胚以稀释平衡液，并在见证人见证下，将囊胚加载至玻璃化冷冻载体上。

去除多余的玻璃化冷冻液。应使一层极薄的液膜包裹囊胚。将玻璃化冷冻载体迅速浸入液氮中，并剧烈晃动载体，以降低在样本附近形成气泡的风险。

然后，在玻璃化冷冻支撑架仍浸没在液氮中时，将保护帽安装到支撑架上。在此具有代表性的两年期间内，共进行了 1,544 例滋养层活检操作，每次操作对 1 至 4 个囊胚进行活检，每例操作耗时 3 至 22 分钟。在这些图表中，显示了各操作者在研究各季度中活检操作的平均耗时，总体平均值为 8.24 分钟。

对每个活检片段获取图像有助于质量控制，可用于评估诊断结果不明确的原因是否归因于片段的大小和/或质量、导管因素，或遗传实验室样本处理过程中的某些问题。在本研究中，572个染色体整倍体囊胚经解冻后准备进行胚胎移植，这些囊胚均在解冻后30分钟内完成玻璃化冷冻复苏；其中2.4%的囊胚在解冻后31至90分钟内未重新扩张，4.9%的囊胚在解冻90分钟后仍未重新扩张。

对于质量较差和/或第七天的囊胚而言，活检与玻璃化冷冻之间的时间间隔似乎对解冻后囊胚的再扩张至关重要。在暴露滋养层细胞连接处并进行打孔时，需注意在切开透明带前先对焦；同时需注意防止囊胚在玻璃化冷冻前过早再扩张。此外还存在另外两种囊胚活检方法，均需先打开透明带，随后等待滋养层细胞自然隆起。

这些方法虽然操作更简便，但需要更多的操作步骤，且耗时更长。该工作流程的有效性使得在体外受精（IVF）中能够应用分子技术，以期在胚胎移植前筛选出着床潜力最高的囊胚。需注意避免使用可能对胚胎产生毒性的器械或溶液，并采用无DNA污染的材料以防止DNA污染。