从小鼠多个器官分离和定量寨卡病毒

在这段视频中，我们描述了一套程序，旨在询问病毒感染的影响，以及由此产生的使用寨卡感染的Murine模型的免疫反应。该协议是重要的，因为它使我们能够发展对感染和免疫的机械理解，通过确定病毒在全身传播的程度，跨体屏障和访问组织。这些技术允许对病毒发病机制进行详细了解，并提供了剖析疫苗或治疗提供的保护机制的能力。

在这里，我们演示了使用小鼠寨卡病毒感染的这种方法，但这种方法可以应用于一系列病毒感染，包括其他病毒，如登革热病毒和α病毒，如基孔肯雅病毒。采集中枢神经系统的器官可能具有挑战性，因此一个人计划一个小实验，并准备事先练习技术是重要的。该协议允许在小动物模型中快速解剖病毒传播，能够可视化、捕获和存储实验数据。

重要的是要直观地演示这种方法，让实验者了解如何收获中枢神经系统器官。同样重要的是，要看到细胞汇合水平和病毒性细菌的强度。首先，使用钳子去除受感染小鼠的皮毛。

用剪刀斩首老鼠的头，然后切除胳膊和腿。要收获大脑，使用锯齿状的拉格兰奇剪刀切割头骨通过前额巨无霸。用钳子剥下头骨，用铲子挖出大脑。

使用强钝剪刀，去除脊柱周围的骨头，然后切开骨盆骨，在腰椎水平上露出椎前科。然后，去除脊柱周围尽可能多的肌肉。小心地将针头的斜头放在椎前体内，避免过度压力，防止针头侵入椎体。

握住，对椎体和针头施加压力，然后按注射器柱塞将绳索排出到培养皿中。立即将脊髓转移到标记管中，并放在干冰浴中，以进一步均匀化。要进行均质化，请添加一毫升 DMEM，并在珠节拍器中均匀化样品。

在确保器官均质化后，将离心机和等同样品储存在零下80摄氏度，直到需要。在测定当天，从零下80摄氏度的冰柜中取出均质样品，并允许其解冻。将寨卡病毒的样品稀释十倍，进入稀释板的第一井，并使用多通道移液器在板上进行十倍连续稀释，每次更换尖端。

通过将 20 微升样品添加到 180 微升生长介质中，更改每次稀释之间的移液器尖端。通过从准备好的平底 96 井板上拆下覆盖维罗细胞的介质来准备焦点成形板。为了防止单层干燥，立即在振动板的每孔中加入100微升的病毒稀释剂。

使用同一组提示从最低浓度添加到最高浓度。岩石板一侧两到四次，在37摄氏度下孵育5%的二氧化碳一至两个小时。将2%甲基纤维素预热至室温。

然后，以大约2比1的比例稀释生长介质中的2%甲基纤维素溶液。孵育后，在96孔板的每个孔中加入125微升的甲基纤维素生长介质。在32至40小时中，在37摄氏度的二氧化碳中再次孵育。

为了修复玻璃细胞，在生物安全柜中，在96孔板的每个孔的甲基纤维素层顶部添加50微升5%的甲醛。在室温下孵育60分钟。或者，用 Parafilm 盖住盘子，并在夜间将板放在 4 摄氏度。

之后，使用移液器将覆盖物和介质从细胞中移入生物安全柜内的一次性容器中。每井用 150 微升 PBS 轻轻清洗。从板上拆下 PBS，然后从生物安全柜中拆下板。

重复PBS洗涤两次，然后每井添加150微升FFA洗涤缓冲液，在室温下离开5至10分钟，使固定细胞渗透。接下来，使用原发性寨卡抗体检测感染。在FFA染色缓冲液中，以每毫升1微克的浓度准备原抗体4G2。

从板中轻拂FFA洗涤缓冲液，并在FFA染色缓冲液中加入50微升原抗体。然后用帕拉膜或塑料薄膜密封板，并在摄氏四度下孵育过夜。在FFA染色缓冲液中，以1至5000浓度准备二次去抗小鼠HRP标记抗体。

去除抗体溶液后，用每井150微升FFA洗涤缓冲液洗三次细胞。每次轻拂到水槽中，拆下洗涤缓冲液。FFA染色缓冲液中的二级抗体将细胞污渍，每井50微升，在室温下孵育一至两个小时。

之后，使用 FFA 洗涤缓冲液洗三次细胞，每次轻拂到水槽中去除洗涤缓冲液。在每个井中加入 50 微升的真蓝底材。等待 2 到 15 分钟，直到用最少的背景完全定义斑点。

斑点可见后，用手轻轻用水清洗，以保护单层免受流水力的污染。在纸巾上轻拍干。不久之后，使用剖析范围手动计算每个井中的点数，或使用自动点计数器。

在 ImmunoCapture 软件中，为每个样品选择易于区分的 20 到 200 个孔的稀释液，并使用重复井的平均值计算每毫米聚焦单位中的滴度。在这项实验中，在伊格纳小鼠皮下感染寨卡病毒后，在周围和中枢神经系统组织中显示了病毒负担。根据器官，检测的限值是每克100至500FFU。

执行对焦形成分析时，技术错误可能导致结果欠佳。器官毒性，由高浓度的肝脏驱动，改变了测定的敏感性。当器官中的病毒滴度低于毒性时，FFA无法准确记录病毒滴度。

肾细胞说明毒性与高器官浓度，但克服病毒滴度在低器官浓度。大力移液或清洗可以去除单层，导致数据丢失不准确的滴度结果报告。实验室工作台吸水纸中的纤维或毛，如果使用自动计数程序，可能会污染单个孔并造成重大错误。

细胞密度是另一个问题，它可以显著影响焦点形成测定的成功。在测定开始时，大约60%汇合的细胞，与90%汇合时镀的细胞相比，显示出对焦形成测定的显著差异。规划实验的规模和范围，使器官收获高效完成，是手术中最重要的部分，然后开始用高质量的细胞进行聚焦形成测定。

这个程序已经用于量化多种病毒家庭的病毒。该协议也可以适应对治疗化合物的筛选和量化中和抗体滴答剂。这些技术用于量化活病毒，应根据 BMBL 中规定的准则采取适当的安全步骤。