从小鼠多个器官中分离与定量寨卡病毒

在本视频中，我们描述了一套旨在利用寨卡病毒感染的小鼠模型来探究病毒感染的影响及其引发的免疫应答的实验流程。该方案的意义在于，它能够通过确定病毒在体内的扩散程度、穿越物理屏障以及侵入组织的情况，帮助我们深入理解感染与免疫的机制。这些技术有助于详细解析病毒的致病机制，并能够揭示疫苗或治疗手段所提供保护作用的具体机制。

本文以寨卡病毒对小鼠的感染为例演示该方法，但该方法也可应用于多种病毒感染，包括其他黄病毒（如登革病毒）以及甲病毒（如基孔肯雅病毒）。中枢神经系统器官的采集可能具有挑战性，因此实验人员有必要预先规划小规模实验，并提前练习相关技术。本方案可实现对小型动物模型中病毒扩散的快速解剖分析，并能够对实验数据进行可视化观察、采集和保存。

直观展示该方法非常重要，可帮助实验人员了解如何收获中枢神经系统器官。同时，观察细胞融合程度和病毒病灶强度也至关重要。首先，使用镊子去除感染小鼠的毛皮。

用剪刀将小鼠头部断头，随后去除四肢。取脑时，使用锯齿状拉格朗日剪从枕骨大孔处剪开颅骨。用镊子剥离颅骨，并用解剖铲挖出脑组织。

使用锋利的钝头剪刀去除脊柱周围的骨骼，然后横切骨盆骨以暴露腰段的椎间孔。接着，尽可能清除脊柱周围附着的肌肉组织。小心地将针头斜面端插入椎间孔内，避免施加过大压力，以防针头穿入椎体。

用力按压椎体和针头，同时推动注射器活塞，将脊髓排出至培养皿中。立即将脊髓转移至已标记的试管中，并置于干冰浴中以备进一步匀浆。匀浆时加入1毫升DMEM，使用BeadBeater对样品进行匀浆处理。

确保组织充分匀浆后，将样品在冰上离心并分装，于-80°C保存备用。检测当天，从-80°C冰箱中取出匀浆样品，使其解冻。将样品置于冰上，用多通道移液器将寨卡病毒在稀释板的第一孔中进行10倍稀释，并依次进行10倍系列稀释，每步换用新吸头。

将20微升样品加入180微升培养基中，每次稀释之间更换移液枪吸头。通过移除预先准备好的平底96孔板中覆盖病毒细胞的培养基，制备焦点形成板。为防止单层细胞干燥，立即向病毒板的每个孔中加入100微升病毒稀释液。

使用同一组枪头，从最低浓度到最高浓度依次加入。将培养板左右摇晃两到四次，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育一至两小时。将2%甲基纤维素 warming 至室温。

然后，以大约2:1的比例将2%甲基纤维素溶液用生长培养基稀释。孵育后，向96孔板的每孔中加入125微升甲基纤维素生长培养基。再次于37°C、5%二氧化碳条件下孵育32至40小时。

为了固定病毒细胞，在生物安全柜中，向96孔板每个孔的甲基纤维素层上方加入50微升5%多聚甲醛。在室温下孵育60分钟。或者，用封口膜覆盖孔板，并在4摄氏度下放置过夜。

随后，使用移液器将覆盖层和培养基从细胞中移除，弃至生物安全柜内的一次性容器中。每孔加入 150 µL PBS 轻柔洗涤。吸去 PBS，将培养板从生物安全柜中取出。

用 PBS 洗涤两次，然后每孔加入 150 µL FFA 洗涤缓冲液，室温孵育 5 至 10 分钟，以通透固定后的细胞。接下来，使用一抗 Zika 抗体检测感染。将一抗 4G2 用 FFA 染色缓冲液稀释至浓度为 1 µg/mL。

从孔板中 flick 掉 FFA 洗涤缓冲液，每孔加入 50 µL 用 FFA 染色缓冲液稀释的一抗。然后用 Parafilm 或塑料膜密封孔板，在 4 °C 下孵育过夜。用 FFA 染色缓冲液将二抗（山羊抗小鼠 HRP 标记抗体）按 1:5,000 的浓度稀释备用。

除去抗体溶液后，用150微升FFA洗涤缓冲液每孔洗涤细胞三次，每次洗涤后将缓冲液弹入水槽中弃去。每孔加入50微升FFA染色缓冲液中的二抗对细胞进行染色，在室温下孵育一至两小时。

随后，用FFA洗涤缓冲液洗涤细胞三次，每次均通过轻弹至水槽中去除洗涤缓冲液。向每孔加入50 µL TrueBlue底物。孵育2至15分钟，直至斑点清晰可见且背景最低。

待斑点可见后，用手遮挡单层细胞，避免水流冲击，轻轻用水冲洗。用纸巾轻拍干燥。随后，使用解剖显微镜手动计数每个孔中的斑点，或使用自动斑点计数器进行计数。

在 ImmunoCapture 软件中，为每个样本选择每孔 20 至 200 个易于区分的病灶的稀释度，并根据复孔的平均值计算每毫升的蚀斑形成单位滴度。本实验中，通过皮下接种 Zika 病毒后，在 Ifnar 小鼠的周围和中枢神经系统组织中检测到病毒载量。检测下限根据器官不同，为每克 100 至 500 FFU。

进行焦点形成实验时，技术性错误可能导致结果不理想。由肝脏中高浓度引起的器官毒性会改变实验的敏感性。当器官中的病毒滴度低于毒性水平时，焦点形成实验无法准确记录病毒滴度。

肾脏细胞在器官浓度较高时表现出毒性，但在器官浓度较低时，病毒滴度可克服该毒性。剧烈的移液或洗涤操作可能破坏单层细胞，导致数据丢失及病毒滴度结果的不准确报告。实验台吸水纸上存在的纤维或毛发可能污染单个孔，若使用自动计数程序，将导致显著误差。

细胞密度是另一个会影响焦点形成实验成败的重要因素。实验开始时细胞汇合度约为60%与接种时细胞汇合度为90%相比，对焦点形成实验的影响存在显著差异。合理规划实验的规模和范围，以确保器官收获能够高效完成，是整个操作过程中最重要的环节，其次是在焦点形成实验开始时使用高质量的细胞。

该方法已用于多种病毒科的病毒定量。本方案还可用于筛选治疗性化合物以及测定中和抗体滴度。这些技术用于定量活病毒，应根据《生物安全微生物和生物医学实验室指南》（BMBL）中规定的要求采取适当的安全防护措施。