Name: 利用生命内成像和固定组织分析评估与癌细胞传播相关的转移门道介导血管渗透性的肿瘤微环境 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 了解利用活体成像和固定组织免疫荧光技术评估肿瘤微环境中TMEM介导的血管渗透性的方法。该技术使用高分子量葡聚糖实时监测癌细胞内渗动态，为研究肿瘤转移潜力提供高通量分析手段。

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我们感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院分析影像中心（AIF）在成像方面提供的支持。本研究得到了美国国家癌症研究所（NCI）资助（P30CA013330、CA150344、CA100324 和 CA216248）、SIG 1S10OD019961-01、格鲁斯-利珀生物光子学中心及其综合影像项目，以及蒙特菲奥里医学中心肿瘤微环境研究外科医生露丝·L·柯什斯坦 T32 培训项目（CA200561）的资助。

GSK 共同撰写了论文，完成了图1C和3B的成像工作，开发了固定组织分析方案，并对所有数据进行了分析和解释；JMP 共同撰写了论文，并完成了图1B、2C和3A的手术及活体成像；LB &amp;#38; AC 完成了图2B的手术及活体成像；RJ 完成了图2A的手术及活体成像；JSC 共同撰写了论文，并对所有数据进行了分析和解释；MHO 共同撰写了论文，并对所有数据进行了分析和解释；DE 完成了图2D的手术及活体成像，共同撰写了论文，开发了固定组织分析和活体成像方案，并对所有数据进行了分析和解释。

所有使用活体动物的实验必须遵循动物使用与护理的指南和规定。本研究中描述的实验程序均依照美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的法规，并经阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物护理与使用委员会（IACUC）批准后进行。
1. 利用活体动物成像评估&#34;爆发性通透性"
<ol>
	<li>同基因型乳腺肿瘤移植至表达荧光蛋白的巨噬细胞小鼠模型
	<ol>
		<li>生成适合移植的肿瘤组织片段。
		<ol>
			<li>通过将自发性、同源性、基因工程小鼠乳腺癌模型 MMTV-PyMT 小鼠与表达荧光报告基因的转基因小鼠杂交，建立荧光标记的肿瘤小鼠乳腺癌模型

荧光标记, 乳腺癌模型, MMTV-PyMT 小鼠, 转基因小鼠, 荧光报告基因, 自发性肿瘤, 同源性肿瘤, 基因工程小鼠38,39 [例如，增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、增强型青色荧光蛋白（ECFP）或 Dendra2]。</li>
			<li>让携带荧光标记肿瘤的MMTV-PyMT小鼠生长至肿瘤大小不超过2 cm（约10-12周龄）。</li>
			<li>将荷瘤的MMTV-PyMT小鼠放入含5%异氟烷的密闭容器中，待呼吸完全停止后继续维持30秒，实施安乐死。</li>
			<li>实施颈椎脱位术。</li>
			<li>使用脱毛膏去除安乐死小鼠腹部的毛发。</li>
			<li>将含有DMEM/F12细胞培养基的培养皿置于冰上。</li>
			<li>将小鼠和培养皿置于冰上，放入通风橱中。</li>
			<li>用70%乙醇消毒小鼠腹部。</li>
			<li>使用无菌手套和手术器械（已灭菌的剪刀、镊子和刀片）切除肿瘤，并将其放入培养皿中。</li>
			<li>将肿瘤在培养皿中切成小块（大小约2 mm × 2 mm × 2 mm），弃去坏死部分。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将肿瘤组织块移植到受体宿主体内。
		<ol>
			<li>培育携带基因工程荧光标记巨噬细胞的小鼠，例如 MacGreen40 或 MacBlue 41 小鼠（Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP</li>
			<li>让携带荧光标记巨噬细胞的FVB小鼠生长至约4-6周龄。</li>
			<li>在麻醉舱中使用5%异氟烷（以氧气为载体气体）对携带荧光标记巨噬细胞的FVB小鼠进行麻醉。</li>
			<li>将麻醉剂浓度降低至约3%异氟烷，并在小鼠眼部涂抹眼药膏以防止干燥。</li>
			<li>去除覆盖在4上方的毛发th 小鼠乳腺</li>
			<li>用聚维酮碘清洁皮肤。在后续操作过程中保持无菌条件至关重要，包括使用无菌器械和试剂。</li>
			<li>在第4肋软骨下方约2-3 mm处做一个小切口th 乳头</li>
			<li>解剖至暴露乳腺脂肪垫。</li>
			<li>从培养皿中取出一块肿瘤组织，并用人工细胞外基质包被。</li>
			<li>将肿瘤移植至第4肋下th 乳腺脂肪垫</li>
			<li>使用氰基丙烯酸酯粘合剂闭合切口。</li>
			<li>持续监测动物，直至其完全从麻醉中恢复，并能维持胸卧姿势。在动物完全恢复之前，不得将其放回与其他动物同处的环境中。</li>
			<li>为减少感染，向动物的饮用水瓶（8 fl oz）中加入 1 mL 浓度为 100 mg/mL 的恩诺沙星抗生素。</li>
			<li>让肿瘤生长至可触及大小（约5 mm；约4周）。</li>
			<li>根据实验需要，将小鼠分配至不同的处理组，并在适用的情况下进行相应的处理。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体成像实验装置       
	<ol>
		<li>打开显微镜的双光子激光器和探测器。</li>
		<li>打开加热箱，预热显微镜的x-y载物台。</li>
		<li>放置定制的载物台插入件42 进入x-y平台。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像窗口的制备
	<ol>
		<li>在进行成像设置之前，对自制的圆形成像窗框进行高压灭菌处理42.</li>
		<li>使用移液器或胰岛素注射器将一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂涂在窗口框架上，然后将8 mm圆形盖玻片固定到位。 
		注意：1）务必避免在盖玻片的通光孔径区域留下残留物。2）盖玻片需至少在成像使用前1小时粘附于窗口框上。</li>
		<li>使用浸有少量丙酮的实验室擦拭纸，仔细擦净盖玻片透明孔径上的多余氰基丙烯酸酯。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像过程中用于输注液体和荧光染料的尾静脉导管制备
	<ol>
		<li>剪取一段30 cm长的聚乙烯导管用于制备尾静脉插管。</li>
		<li>轻轻来回弯曲30 G针头的针头部分，直至其从鲁尔锥形接口上脱落。 
		注意：应握住针头靠近鲁尔锥形接口处，而非针尖部分。可使用钳子或镊子夹住针头，以防止针刺伤。</li>
		<li>将针头的钝端插入聚乙烯导管的一端。</li>
		<li>将另一支30 G针头的尖端插入管路的另一端，保留其鲁尔锥形接头。</li>
		<li>用1毫升注射器抽取磷酸盐缓冲液，连接至已组装好的导管的鲁尔锥形接口，冲洗尾静脉导管，确保系统内无气泡。</li>
		<li>用于血管标记，用100 μL浓度为10 mg/kg的155 kDa葡聚糖-四甲基罗丹明（TMR）或量子点填充1 cc注射器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠成像前准备
	<ol>
		<li>将小鼠置于热源灯下方约30厘米处的笼子中，使用4%–5%异氟烷与100%氧气混合，气体流速设定为每分钟1.5–2升，进行麻醉。</li>
		<li>打开手术工作区域上方的加热灯。此步骤对于维持小鼠在手术期间的核心生理体温至关重要。</li>
		<li>将小鼠置于加热灯下，并在手术期间将麻醉浓度降低至2%-3%。 
		注意：务必使加热灯与小鼠保持安全距离（约30厘米），以避免过热。</li>
		<li>在小鼠眼睛上涂抹眼药膏，以防止眼睛干燥和失明。</li>
		<li>通过脚趾夹捏试验检测小鼠是否已麻醉。若动物出现回缩反应，将异氟烷剂量增加1%，并在1-2分钟后重新测试。</li>
		<li>将尾静脉导管插入尾巴上尽可能远端的位置。</li>
		<li>用一小块实验室胶带将尾静脉导管固定在尾部，胶带环绕尾部并粘附在针头上，以确保导管不会脱落。</li>
		<li>通过尾静脉导管以每小时50 μL的速度注入PBS，以提供充足的水合作用。必须避免注入过多液体（每小时不超过200 μL）或任何气泡进入导管，否则可能对小鼠造成致命后果。</li>
		<li>去除腹部第4区域的毛发th 和 5th 使用脱毛膏处理乳腺组织。</li>
		<li>用聚维酮碘清洁皮肤，并待皮肤干燥。</li>
		<li>从生殖器上方立即开始，做一条纵向正中切口，并将切口向上延伸至第4节段上缘水平th 乳腺</li>
		<li>将切口横向延伸至第4节段的上部th 乳腺。此时必须避免损伤其血液供应。</li>
		<li>使用无菌镊子和剪刀，将乳腺脂肪垫从腹膜上分离，形成一个组织瓣。 
		注意：皮瓣成像容易受到显著的运动伪影和组织脱水影响。这些问题可通过前述方法予以避免。43,44通过在皮瓣的皮肤侧后方固定一块刚性橡胶片（以增加软组织的刚性并将其与身体其他部分隔离），然后将肿瘤置于浅层成像窗口中以保持其水合状态。这对于稳定成像至关重要，因为在此条件下，肿瘤及其周围组织的顺应性非常高。</li>
		<li>用氰基丙烯酸酯胶水将一块 2 cm × 2 cm 的刚性橡胶固定在皮瓣的皮肤侧，以稳定皮瓣。肿瘤应位于橡胶固定区域的中央。</li>
		<li>用 PBS 滴液保持暴露组织的湿润。</li>
		<li>在定制的成像窗框外缘涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯。</li>
		<li>在盖玻片中央滴加少量 PBS（约 10–20 μL）。</li>
		<li>用实验室擦拭纸擦干周围的瓣膜组织。必须确保窗框上的氰基丙烯酸酯不与玻璃上的PBS接触，否则可能导致氰基丙烯酸酯过早聚合固化。</li>
		<li>将小型成像窗口固定在组织瓣上，使肿瘤位于透明孔径的中心。</li>
		<li>从载物台上取下加热箱。</li>
		<li>将麻醉后的小鼠和尾静脉导管转移至显微镜载物台。操作需格外小心，确保尾静脉导管不脱落。</li>
		<li>将小鼠以俯卧位放置于实验台上。</li>
		<li>将异氟烷鼻罩置于动物鼻部，以维持麻醉状态。</li>
		<li>将窗口插入定制的x-y平台板上的孔中。</li>
		<li>将加热盒放回载物台上，以维持生理温度。</li>
		<li>通过夹式传感器将脉搏血氧仪探头连接至动物后肢足垫，以监测其生命体征。</li>
		<li>逐渐将异氟烷浓度降低至0.5%–1%，以维持足够的血流并避免对小鼠过度麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体成像 
	注意：本节所述成像在一台定制的双激光多光子显微镜上进行，该显微镜此前已有描述5,39,45简而言之，使用飞秒激光器产生中心波长为880 nm、脉冲宽度为90飞秒的脉冲激光。激发光经二向色镜（Chroma, Z720DCXXR）分离后，荧光信号由四个同步采集探测器中的三个进行检测（蓝色 = 447/60，绿色 = 520/65，红色 = 580/60；中心波长/带宽）。显微镜平台配备一个25倍、数值孔径（NA）为1.05、长工作距离（2 mm）的物镜。需要指出的是，尽管我们使用的是自行搭建的显微镜系统，但下述实验方案同样适用于任何 commercially available 多光子显微镜。
	<ol>
		<li>在25倍、1.05数值孔径的物镜与窗口盖玻片之间滴加一滴蒸馏水，以形成光学接触。</li>
		<li>使用显微镜目镜聚焦于窗口表面附近带有荧光肿瘤细胞的区域。</li>
		<li>找到有血流的血管和标记的巨噬细胞。观察有血流的血管对于评估血管系统的动态至关重要。</li>
		<li>将显微镜切换至多光子模式。</li>
		<li>设定z系列的上限和下限，其测量范围约为50 μm。
		<ol>
			<li>使用调焦装置将物镜移至最表层的预定起始位置，以此设定z序列的上限位置，并在软件中点击Z位置将该位置标记为零 顶部 按钮</li>
			<li>将物镜移至最深层（对于较小的肿瘤，通常为表面下50-70 μm），然后点击Z位置，以设定z序列的下限 底部 按钮</li>
			<li>将 z 轴步长设置为 5 μm。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>点击时间序列面板按钮，将采集间的时间间隔设置为至少10秒，以便有足够时间在物镜上方补充水分。在长时间时间序列过程中，需使用移液器手动向物镜上方滴加水分。</li>
		<li>移除尾静脉导管中装有 PBS 的注射器，更换为另一支含有 155 kDa 右旋糖酐-TMR（四甲基罗丹明）的注射器。</li>
		<li>通过尾静脉导管注射 100 μL 155 kDa 的葡聚糖-TMR。</li>
		<li>注射后，将TMR注射器更换为PBS注射器。</li>
		<li>通过点击Z-Stack（Z轴层扫）和Time-Lapse（时间序列）按钮，然后点击录制按钮，获取z轴层扫时间序列成像。</li>
		<li>每30-45分钟注射50 µL PBS，以维持动物充足的水合状态。每次注射量避免超过200 μL，以免引起液体过载。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安乐死
	<ol>
		<li>将异氟烷浓度增加至5%，并使用鼻罩使动物持续暴露于5%异氟烷中，直至呼吸停止后30秒。</li>
		<li>将小鼠从载物台上移开。</li>
		<li>实施颈椎脱位术。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像处理
	<ol>
		<li>将所有图像载入 ImageJ，并将其格式化为五维超堆栈（x、y、z、t 和颜色通道）。</li>
		<li>使用 established 方法对超堆栈进行光谱重叠分离（例如：GFP 和 CFP）以及消除 x-y 漂移38.</li>
		<li>使用亮度和对比度调节功能，提高血流通道的白色水平，使背景信号变得可见。</li>
		<li>对于每个z轴切片，需仔细检查每段视频中是否存在短暂的血管渗漏迹象（ &#34;爆发&#34;以较快的帧率（40 fps）播放视频可能有助于识别。</li>
		<li>一旦检测到爆发信号，将该通道的亮度恢复至正常水平，并将超堆栈裁剪至该区域及对应的z层面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用固定组织分析评估血管外右旋糖酐
<ol>
	<li>肿瘤及样本制备 
	注意：2nd 本方案的部分内容假设乳腺肿瘤已从乳腺癌原位移植小鼠模型（即 MMTV-PyMT）中获取。该模型可与第 1 部分所述模型相同。st 该步骤为实验方案的一部分，尽管目前无需使用荧光标记的肿瘤。
	<ol>
		<li>在实验流程结束（即药物处理等）后，在处死小鼠前1小时，通过尾静脉注射100 μL浓度为10 mg/mL的155 kDa葡聚糖-四甲基罗丹明。</li>
		<li>处死小鼠并收获乳腺肿瘤。</li>
		<li>将肿瘤组织置于10%福尔马林中固定48-72小时，随后进行石蜡包埋。</li>
		<li>使用切片机从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中连续切取两张5 μm厚的切片。一张切片用于葡聚糖染色，另一张用于进行TMEM三重免疫组化（TMEM triple-IHC）作为对照。 
		注意：TMEM三重免疫组织化学方案已在其他地方描述 10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对连续切片中的第一张切片进行免疫荧光染色和扫描
	<ol>
		<li>将切片送入标准脱蜡程序，包括在二甲苯中连续浸入两次（每次10分钟），随后在梯度稀释的乙醇溶液中脱水（依次为100%、95%、70%和50% EtOH in H2每次浸泡2分钟。</li>
		<li>将切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，加热至接近沸点，持续 20 分钟，进行抗原修复。</li>
		<li>让样品在室温下冷却15-20分钟，然后用PBS洗涤3次，每次2分钟。</li>
		<li>在封闭缓冲液（10% FBS；1% BSA；0.0025% 鱼皮明胶；0.05% PBST，即含 0.05% Tween-20 的 PBS）中封闭 60–90 分钟。</li>
		<li>将样本与一抗混合物（大鼠来源的Endomucin抗体和兔来源的TMR抗体）共同孵育，随后用PBST洗涤3次，每次2分钟。</li>
		<li>将样品与针对大鼠IgG（偶联Alexa-647）和兔IgG（偶联Alexa-488）的驴二抗混合物共同孵育，随后用PBST洗涤，每次2分钟，共洗3次。</li>
		<li>进行常规DAPI染色（即在DAPI溶液中浸泡5–6分钟），使用无甘油封片剂封片 &#34;硬性封片剂封片，避光保存至扫描。</li>
		<li>为获得最佳结果，请使用数字全片扫描仪扫描切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>每例采集10个高倍视野（HPFs），可使用任何适用于数字病理学的软件。</li>
		<li>分别将Endomucin（红色）和TMR（绿色）通道保存为TIFF格式。</li>
		<li>使用 ImageJ 导入 TIFF 文件，并将其转换为 8 位图像。</li>
		<li>将8位图像以阴性对照水平进行阈值处理，生成两张二值化图像，分别显示Endomucin和TMR &#34;口罩&#34;.</li>
		<li>从 二元 工具，选择 填补孔洞 在内粘蛋白掩模上。</li>
		<li>生成并保存以下五个感兴趣区域：1) 阈值化后的葡聚糖图像作为 &#34;葡聚糖ROI（ROI1），2）经阈值处理的内粘蛋白图像作为 &#34;血管ROI（ROI2），3）倒置的内粘蛋白图像作为 &#34;血管外感兴趣区域（ROI3），4）交集 &#34;血管外ROI" 和 &#34;葡聚糖ROI“图像（ROI1 ∩ ROI3）作为 &#34;血管外右旋糖酐ROI（ROI4），以及5）整张图像作为 &#34;肿瘤感兴趣区域 (ROI5)</li>
		<li>将 ROI4 区域面积除以 ROI5 区域面积，再乘以 100，得到血管外葡聚糖覆盖整个肿瘤的百分比面积。</li>
		<li>对每例样本重复该过程，观察10-20个高倍视野（HPFs）（根据组织可用性而定），并为每例样本计算平均血管外右旋糖酐（%面积）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文概述了两种可用于可视化和量化特定类型血管通透性的实验方案，该通透性存在于TMEM通道处，并与血管紧密连接和黏附连接的破坏相关。如上所述，这种血管通透性是短暂的，由三联TMEM细胞复合物所调控5。识别并量化与TMEM相关的血管通透性，对于评估促进转移的癌细胞微环境至关重要，同时也适用于研究传统细胞毒性疗法对肿瘤微环境的影响，以及靶向和非靶向治疗药物抗转移潜力的临床前研究。重要的是，本文证明了该评估既可通过活体成像，也可通过固定组织的免疫荧光染色来完成。两种方法各有优缺点：活体成像可直接观察血管通透性的动态过程，但需要专门的设备和技术培训；而固定组织的免疫荧光染色仅能提供静态图像，但可在大多数实验室常规开展。
癌症患者通常接受某种形式的全身治疗，而全身治疗的效果通常通过评估与癌细胞存活相关的参数（如细胞凋亡、增殖或肿瘤总体大小）来判断。然而，考虑到大多数癌症相关死亡是由转移引起的，因此同样重要的是理解这些全身治疗如何影响癌细胞的播散；转移过程既涉及癌细胞的增殖，也涉及癌细胞的播散1。例如...

近年来，随着对癌症转移机制的深入理解，研究发现仅靠上皮-间质转化（EMT）以及迁移性/侵袭性癌细胞亚群的产生本身并不足以实现血行播散1事实上，人们曾认为转移性癌细胞会穿过整个肿瘤相关内皮，因为肿瘤新生血管通常缺乏周细胞覆盖，因而具有高通透性和不稳定性2,3,4尽管这些现象强烈提示肿瘤内部存在功能缺陷，但在癌变过程中观察到的血管改变本身并不能证明肿瘤细胞能够轻易且不受控制地穿透血管壁。活体成像（IVI）研究提供了进一步见解，其中肿瘤细胞被荧光标记，血管系统则通过静脉注射荧光探针（如葡聚糖或量子点）进行标记。研究表明，尽管肿瘤血管对低分子量葡聚糖（例如70 kD）具有普遍通透性，但高分子量葡聚糖（155 kD）和肿瘤细胞仅能在特定的侵入位点穿越内皮层，这些位点优先分布于血管分支点处。5,6,7. 利用动物模型和人类患者来源材料进行的免疫组织化学（IHC）分析表明，这些位点是 &#34;“门户”，专门负责局部且短暂地调节血管通透性，为迁移性/侵袭性癌细胞进入循环系统提供短暂的窗口期。这些门户被称为 &#34;转移性肿瘤微环境 &#34;TMEM&#34;，而且在意料之中的是，其密度与乳腺癌患者发生转移性疾病的风险增加相关8,9,10.
每个TMEM通道由三种不同类型的细胞组成：血管周巨噬细胞、过表达肌动蛋白调控蛋白哺乳动物Enabled（Mena）的肿瘤细胞，以及内皮细胞，这三种细胞彼此之间直接发生物理接触1,5,9,10,11,12,13。TMEM作为肿瘤细胞进入血管通道发挥功能的关键事件，是血管周巨噬细胞向其下方血管局部释放血管内皮生长因子（VEGF）14。VEGF可破坏内皮细胞之间的同型连接15,16,17,18,19，这一现象导致短暂的血管渗漏，在活体成像（IVI）研究中被称为&#34;爆发性”通透性5。研究表明，TMEM巨噬细胞表达酪氨酸激酶受体TIE2，该受体对VEGF介导的TMEM功能以及这些巨噬细胞向血管周微环境的归巢至关重要5,20,21,22。除了调控癌细胞的播散和转移外，TIE2+巨噬细胞还被证实是肿瘤血管生成的核心调控者21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31。因此，TIE2+巨噬细胞是肿瘤微环境的关键组分，也是转移级联过程的主要调控者。
为了更好地理解由TMEM介导的血管通透性（即&#34;爆发式&#34;通透），必须将其与其他不涉及内皮细胞间连接溶解的血管通透模式区分开来。在完整的内皮层（其紧密连接和黏附连接未被破坏）中，存在三种主要的血管通透形式：(a) 胞饮作用，该过程可能伴随或不伴随所摄取物质的穿胞运输；(b) 物质通过内皮细胞窗孔的运输；(c) 物质通过细胞旁路途径的运输，该途径受内皮紧密连接的调控15,16,17,18,19,32,33,34。尽管这些血管通透模式在多种肿瘤中出现失调，但其主要描述仍集中于正常组织生理学与稳态的背景下，其极端情况表现为通透性极低的组织（如血脑屏障、血睾屏障）或通透性极高的组织（如肾小球装置中的有窗毛细血管）34,35,36,37。
利用多光子活体成像和多重免疫荧光显微镜技术，我们能够区分由TMEM介导的血管通透性（&#34;破裂&#34;）以及乳腺肿瘤中其他形式的血管通透性。为实现这一目标，我们在小鼠体内进行一次静脉注射高分子量、荧光标记的探针。随后可通过活体成像技术在活体小鼠中捕捉自发性渗漏事件；或者通过探针与血管结构（如 CD31）的共定位研究来定量分析探针的外渗情况。+ 或内粘蛋白+)以及利用免疫荧光显微镜检测TMEM通道的方法。本文所述方案涵盖了这两种技术，可单独使用，也可联合应用。

<table><tbody><tr><td>抗兔 IgG（Alexa 488）</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠 IgG（Alexa 647）</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐</td><td>Eng Scientific Inc</td><td>9770</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72296-08</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯粘合剂</td><td>Henkel Adhesive</td><td>1647358</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1490</td><td></td></tr><tr><td>四甲基罗丹明-葡聚糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>内粘蛋白（一抗）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td></td></tr><tr><td>恩诺沙星</td><td>Bayer</td><td>84753076 v-06/2015</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>鱼皮明胶</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB40234</td><td>人工细胞外基质</td></tr><tr><td>针头（30 G）</td><td>Becton Dickinson</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>PBS</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>脉搏血氧仪</td><td>Kent Scientific</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 软膏</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>量子点</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>Q21561MP</td><td></td></tr><tr><td>橡胶</td><td>McMaster Carr</td><td>1310N14</td><td></td></tr><tr><td>TMR（一抗）</td><td>Invitrogen</td><td>A6397</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biologicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>184835</td><td></td></tr></tbody></table>

利用活体成像与固定组织分析评估与癌细胞播散相关的转移门户介导的血管通透性肿瘤微环境

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

癌症相关死亡最常见的原因是转移，这一过程需要癌细胞从原发肿瘤扩散到继发部位。近期我们发现，在原发性乳腺癌中以及肺部转移部位的癌细胞扩散仅发生在一种称为转移性肿瘤微环境（Tumor MicroEnvironment of Metastasis, TMEM）的“门户”结构处。TMEM门户的数量可作为乳腺癌患者远处复发的预后指标。TMEM门户由一个过表达肌动蛋白调控蛋白Mena的癌细胞组成，该癌细胞直接接触一个表达高水平TIE2和VEGF的血管周围促血管生成型巨噬细胞，且这两个细胞均紧密地与一个血管内皮细胞结合。由于TMEM相关巨噬细胞与表达Mena的癌细胞协同作用，诱导了短暂的血管通透性，使得癌细胞能够通过TMEM门户进入血管内。在本文中，我们描述了两种评估TMEM介导的短暂性血管通透性的方法：活体成像和固定组织免疫荧光染色。尽管这两种方法各有优缺点，但联合使用可提供对TMEM介导的血管通透性及其功能所需微环境前提条件的最全面分析。由于乳腺癌（可能还包括其他类型癌症）的转移过程涉及通过TMEM门户的癌细胞扩散，因此必须采用成熟可靠的方法来分析TMEM门户的活性。本文所述的两种方法为分析TMEM门户活性提供了全面的策略，适用于未经处理或经药物处理的动物模型，这对于开发阻止癌细胞经TMEM扩散的药物的临床前试验具有至关重要的意义。

本方案文章中描述的实验步骤在图1A-C中进行了简要总结和图示说明。
为了测量由TMEM介导的血管通透性（“爆发样活动”），并减少来自其他类型血管通透性模式（即跨细胞和旁细胞通透性，如引言中所述）的实验噪声，我们进行了静脉内（i.v.）注射高分子量示踪物，例如与四甲基罗丹明偶联的155 kDa葡聚糖。低分子量的葡聚糖无法区分这三种血管通透性模式。我们以往的经验表明，155 kDa TMR-葡聚糖在全身循环中可有效标记正常组织（如乳腺和肺组织）（图2A,B）以及肿瘤组织（如原发性乳腺癌和肺部乳腺癌转移灶）的血管系统（图2C,D）。正如先前研究5,46所证实的，155 kDa TMR-葡聚糖是检...

我们描述了两种方法，用于评估与转移微环境（TMEM）通道功能及癌细胞内渗相关的短暂性血管通透性，该方法通过向小鼠静脉注射高分子量（155 kDa）葡聚糖实现。这些方法包括在活体动物中进行活体成像以及利用免疫荧光对固定组织进行分析。

导致癌症相关死亡的最常见原因是转移，这一过程需要癌细胞从原发肿瘤扩散至继发性...

这些互补技术利用高分子量葡聚糖评估和测量肿瘤血管的通透性。固定组织实验方案具有更大的肿瘤覆盖范围、高通量优势，且无需多光子成像设备。而活体成像实验方案则可提供关于转移性肿瘤微环境或TMEM中细胞动力学、功能及其动态相互作用的实时信息。因此，本文所述的实验方案可直接测量依赖于TMEM的血管通透性，该通透性与癌细胞的播散密切相关，因而这些方案可用于评估肿瘤的转移潜能。为获得适合移植的肿瘤组织片段，首先按照文本方案中所述方法对荷瘤小鼠实施安乐死。在生物安全柜中，将含有DMEM/F12细胞培养基的培养皿置于冰上。将小鼠移至超净工作台，用70%乙醇消毒小鼠腹部。佩戴无菌手套并使用无菌手术器械，取出肿瘤并放入培养皿中。在培养皿中将肿瘤切成小块，弃去任何坏死部分。为了将肿瘤组织移植到受体宿主体内，需按照文本方案中所述，对携带经基因工程标记的荧光巨噬细胞的小鼠进行麻醉。将麻醉剂异氟烷浓度降至约3%，并在小鼠眼部涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。去除小鼠第四乳腺区域的毛发。用消毒剂清洁皮肤后，使用无菌器械在第四对乳头下方约2至3毫米处做一个小切口。解剖至暴露乳腺脂肪垫。从培养皿中取出一块肿瘤组织，包被人工细胞外基质。将肿瘤移植至第四对乳腺脂肪垫下方。使用氰基丙烯酸酯粘合剂闭合切口。最后，在动物的饮用水中加入一毫升恩诺沙星抗生素。麻醉小鼠，并按照文本方案中所述插入尾静脉导管。从生殖器上方立即开始，做一条纵向正中切口，并将切口向上延伸至第四乳腺上缘水平。随后将切口横向延伸至第四乳腺的上缘。此时必须避免破坏血液供应。通过将一块 2 厘米 × 2 厘米的刚性橡胶固定在皮瓣的皮肤侧，以稳定皮瓣。肿瘤应位于橡胶固定区域的中心。在定制的成像窗框外缘涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯。然后在盖玻片中心滴加少量 PBS。避免窗框上的氰基丙烯酸酯与玻片上的 PBS 接触，以防止氰基丙烯酸酯过早聚合。用实验室擦拭纸擦干周围皮瓣组织。将小型成像窗口固定在组织皮瓣上，使肿瘤位于透明孔径的中心。将麻醉后的小鼠及尾静脉导管转移至显微镜载物台。需格外小心，确保尾静脉导管不会脱落。此时，按照本文方案及我们此前在 JoVE 发表的文章中所述，进行长期活体成像。为实现更高通量的分析和更广泛的肿瘤覆盖，可采用固定组织中的免疫荧光方法来评估 TMEM 介导的血管通透性。进行免疫荧光染色时，首先按照文本方案中的描述制备样品，然后将切片浸入柠檬酸盐溶液中，加热至接近沸点，持续20分钟以进行抗原修复。将样品室温冷却15至20分钟后，用PBS洗涤样品三次，每次洗涤2分钟。在封闭缓冲液中封闭60至90分钟，然后将样品与一抗混合物（包括靶向内粘蛋白的鼠源一抗和靶向四甲基罗丹明的快速抗体）共同孵育。孵育后，用PBST将样品洗涤三次，每次两分钟。将样品与针对大鼠IgG和快速IgG的驴源二抗混合物共同孵育，然后用PBST将样品洗涤三次，每次两分钟。进行常规DAPI染色，并使用无甘油的硬封片介质封片。将样本存放在避光处直至扫描。为获得最佳结果，使用数字全片扫描仪对玻片进行扫描。进行图像分析时，采用适用于数字病理学的任意软件，每例采集10个高倍视野。将内粘蛋白和TMR通道分别保存为TIFF格式。使用ImageJ上传TIFF文件，并将其转换为8位图像。将8位图像的阈值调整至阴性对照水平，生成两个二值化图像，分别显示内粘蛋白和TMR的掩膜。从二值化工具中，选择对内粘蛋白掩膜进行“填充孔洞”操作。生成经阈值处理的葡聚糖图像，并将其保存为葡聚糖感兴趣区域（Dextran ROI）。同时，生成经阈值处理的内粘蛋白图像，将其保存为血管感兴趣区域（Vascular ROI），并生成内粘蛋白图像的反相图像，保存为血管外感兴趣区域（Extravascular ROI）。接下来生成血管外ROI与葡聚糖ROI图像的交集区域，并将其保存为血管外葡聚糖ROI。最后将整个图像保存为肿瘤ROI。用血管外葡聚糖ROI面积除以肿瘤ROI面积，再乘以100，计算血管外葡聚糖在整块肿瘤中所占的百分面积。对每例样本重复此过程，观察10至20个高倍视野，并为每例计算平均血管外右旋糖酐值。图中显示的是转基因动物体内一个健康发育中的乳腺组织图像。血管结构由红色的TMR标记右旋糖酐标记，乳腺导管上皮由绿色的荧光蛋白dendra2标记，巨噬细胞则由一种青色荧光蛋白标记。相比之下，图中显示了移植的表达dendra2的浸润性导管癌，在携带标记巨噬细胞和血管的动物体内。通过成像窗观察到携带标记血管系统的活体小鼠中的健康肺组织。在将肿瘤细胞注射到携带标记巨噬细胞和血管系统的转基因动物后，可明显观察到肺转移灶。图中所示为移植的dendra2标记的乳腺侵袭性癌组织内，高分子量Dextran标记的新生血管的延时活体成像序列图像。黄色虚线标示了血管渗漏事件发生前、发生中及发生后，暂时性血管渗漏区域的轮廓。活体成像捕捉到了一个TMEM通道结构。多通道免疫荧光显示内粘蛋白、高分子量右旋糖酐、它们与DAPI的合并图像，以及相应的血管和血管外右旋糖酐的阈值化掩膜图像。同时展示了TMEM免疫组织化学的连续切片。远离TMEM的血管形态表现为非渗漏性血管特征，而与TMEM相关的血管形态则表现为渗漏性血管特征。在手术暴露肿瘤过程中，避免损伤供应肿瘤的血管至关重要。本文所述方法可与药物治疗相结合，例如抑制TMEM功能、防止血管通透性增加，或甚至使肿瘤血管正常化，以评估这些干预措施的影响和疗效。通过该方案，我们先前已证明化疗会增强血管通透性和癌细胞播散，而这些促进转移的变化可通过联合使用TMEM功能抑制剂得以避免。

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