利用微图形技术和定量成像技术绘制哺乳动物细胞的自组织空间结构

该方法能够操控并量化细胞的集体组织方式。这一点非常重要，因为我们可以在体外模拟特定模式，并解析在体内紧密关联的信号线索。该技术仅需最少的专业设备，可在标准生物学实验室中建立，且具有定量性，从而能够发现亚显微水平的模式形成事件。

该方法可轻松应用于任何可能出现图案形成的细胞体系，用于发现分化、增殖以及细胞间竞争的非随机模式。该方法的主要挑战在于针对新细胞类型系统地优化微图形化参数，例如图案的大小和形状、基质类型以及细胞贴壁时间。

戴上手套，将一块实验室保鲜膜放入直径10厘米的培养皿底部。使用直径12毫米的打孔器切割疏水性塑料载玻片，制备直径约12毫米的盖玻片，并将盖玻片放入新的培养皿中。用镊子小心地从盖玻片上移除保护膜。

将光刻掩模放置在干净且稳定的表面上，镀铬面朝上，在所需芯片设计的位置滴加两微升双蒸水。轻轻将盖玻片压在液滴上，并将支架置于塑料载片上方。用夹子小心固定这一层叠结构，以确保塑料部件与光刻掩模保持接触。

将组装件置于紫外臭氧灯中，距离光源约两厘米，照射10分钟。照射结束后，用手握住底部带有光刻掩模的夹心结构，在拆卸夹心结构时，用一只手保持压力，小心地逐个取下夹具，以防止载玻片移动。当所有夹具均被移除后，取下支架，并注意确保所有塑料部件仍留在掩模上，而未粘附在支架上，然后向芯片中加入重蒸水，轻轻将芯片从光刻掩模上分离下来。

将光刻图案芯片放置于基质沉积室中，光面朝上，每片芯片上加入 200 微升包被溶液。然后，在室中加入一个含有三厘米双蒸水的培养皿，于 4 摄氏度下过夜以减少蒸发。为在芯片上接种胚胎细胞，每片芯片需用新鲜无菌 PBS 洗涤至少两次，每次洗涤不少于五分钟，随后每片芯片上加入 200 微升适当细胞培养基，其中含有 1 × 10⁵ 个细胞。

然后关闭接种室，孵育1小时，使细胞贴附在芯片上。待细胞贴壁后，用500微升预热的培养基填充多孔板的每个孔，并使用无菌镊子将芯片转移至各个孔中。

剧烈振荡培养板以去除任何未贴壁的细胞，并立即用新鲜的预温培养基更换上清液。然后在显微镜下观察，检查是否可见图案化结构。接种后48小时，细胞应形成致密的克隆，严格遵循图案的形状。

将芯片保留在培养板中，除去大部分培养基，仅保留足以防止芯片干燥的少量培养基，并向每孔中加入至少500微升的多聚甲醛或基于PFA的固定液。10分钟后，用洗涤液短暂洗涤各孔3次，随后用洗涤液稀释的50毫摩尔氯化铵溶液洗涤一次，以淬灭残留的PFA交联活性。最后一次洗涤后，用封闭液处理样品至少30分钟。

对于芯片培养物的免疫染色，将芯片转移至染色板中，细胞面朝上，并立即向每张芯片加入100 µL所需的一抗溶液。室温下在旋转平台上孵育1小时后，用洗涤液如图示洗涤芯片三次，然后在旋转平台上加入相应的二抗孵育1小时。二抗孵育结束后，用洗涤液再次洗涤芯片三次，再将芯片置于载玻片上，加入20 µL常规封片介质进行封片。

为了对芯片进行成像，首先调整扫描速度、图像分辨率、帧平均次数和探测器增益，以在图像质量和成像时间之间找到最佳平衡。然后获取每张芯片的图像。当所有图像采集完成后，根据在线提供的文档安装并运行 PickCells 软件，创建一个新的实验，并将图像导入程序中。

使用 Nessys 模块根据核膜信号对细胞核进行分割。使用基础分割模块识别模式的自发荧光信号。然后单击“完成”并等待所有图像处理完毕。

要创建细胞核对象并计算基本对象特征，请从任务栏启动“固有特征”模块，并关闭“椭球拟合器”和“表面提取器”面板，仅保留“基本特征”面板处于打开状态。将“对象类型”选择为“nucleus”，并选择为已分割图像提供的前缀。然后点击“Compute”，等待所有图像处理完成。

在此阶段，在导出数据进行分析之前，需要将额外的特征写入细胞核。例如，若要将每个细胞核所属图像的名称作为细胞核属性进行存储，请点击“数据”和“新建属性”，然后在弹出的对话框中选择“细胞核”。点击“确定”，选择“从与该节点相连的其他对象收集数据”，然后点击“下一步”。在左侧面板中选择“图像”，并双击问号，将图像节点设置为路径的目标。

展开“归约操作”窗格，选择“获取一个”；展开“可用属性”窗格，选择“名称”属性。然后单击“更改”和“下一步”。输入图像名称，按下 Tab 键，然后单击“完成”。随后将数据导出为制表符分隔值文件。在我们的分析中，将导出的数据循环至 R-Script 文件夹的数据文件夹中。

打开“我们的工作室”并打开分箱地图模板R-Script，然后将工作目录设置为源文件位置，并运行脚本以生成密度图。在细胞接种后一小时，由于细胞随时间增殖，单个细胞培养图案可能尚未完全融合。然而，随着时间推移，图案区域将被完全定植，仅有极少数细胞位于黏附表面之外。

接种后长达两小时仍无清晰的图案形成，表明实验操作失败。通过将小鼠胚胎干细胞限制在大圆盘或环形微图案上，可引导表达中胚层标志物brachyury的细胞亚群形成特定的空间分布模式。例如，当小鼠胚胎干细胞培养在大圆盘微图案上时，表达brachyury的阳性细胞主要局限于图案的边缘区域，该区域的局部细胞密度最低。

这种模式化分布通过脑-Brachyury强度图得到证实。这些数据表明，该方法能够揭示亚显微水平的信息，因为仅通过观察单个克隆不足以识别目标标记物表达中的任何空间组织形式。这尤其归因于克隆间存在显著的变异性。

该技术还表明，DNA结合抑制因子1不存在可检测到的图式化分布，这可能说明在此情况下，T图式化并非由骨形态发生蛋白信号通路驱动。操作时务必记清盖玻片哪一侧已被切除并涂覆，同时确保细胞已充分贴附，然后再洗去多余的细胞。该方法可用于研究在引导细胞自组织过程中起重要作用的环境信号，并可为有助于我们更好理解初级图式形成的数学模型提供依据。