April 30th, 2019
这里介绍的方法使用微模式和定量成像来揭示哺乳动物文化内的空间组织。该技术在标准细胞生物学实验室中易于建立,为体外研究模式提供了一个可操作的系统。
此方法可以操作和量化细胞如何集体组织。这一点很重要,因为我们可以在体外建模模式,并在体内分离紧密耦合的暗示。该技术需要最少的专业设备,允许在标准生物学实验室中建立,并且它是定量的,因此有可能发现子视觉模式事件。
此方法可以很容易地应用于任何可以出现模式的细胞系统,并发现非随机的分化、增殖和细胞对细胞竞争模式。该方法的主要方法是系统优化新细胞类型的微模式参数。例如,图案大小和形状、矩阵类型和单元格粘附时间。
戴上手套,将一块实验室薄膜放入10厘米见方的培养皿底部。使用 12 毫米孔冲头切割疏水塑料滑梯,以创建 12 毫米左右的盖滑,并将盖滑放在新的 Petri 盘中。使用钳子小心地从盖滑道上取下保护膜。
将照片面罩放在干净稳定的表面上,镀铬侧向上,并在所需芯片设计的位置添加两微升的双蒸馏水滴。轻轻按盖滑到跌落处,将支架放在塑料滑梯的顶部。小心地用夹子固定这个三明治,以保持塑料碎片与照片面罩接触。
将组件放在距离光源约 2 厘米的紫外线臭氧灯中,进行 10 分钟的照明。在照明期结束时,用底部的照片面罩抓住三明治,小心地取下夹子,同时用一只手保持压力,以防止滑轨在拆卸三明治时移动。拆下所有夹子后,拆下支架,注意所有塑料件仍放在面罩上,不粘在支架上,并将双蒸馏水添加到芯片中,轻轻地将芯片从照片面罩中分离。
将光型芯片放在基质沉积室内,向上照明,并将 200 微升涂层溶液添加到每个芯片上。然后,在室内加入一个三厘米的培养皿,里面装满了双蒸馏水,以在四摄氏度的温度下限制蒸发。为了将胚胎细胞播种到芯片上,每次洗涤用两个至少五分钟的新鲜无菌PBS清洗芯片,然后在每个芯片上分配1倍10至第5细胞,其中200微升的细胞培养培养。
然后关闭播种室。孵育一小时,让细胞粘附在芯片上。当细胞连接后,将多井板的井中每孔填充500微升热介质,并使用无菌钳子将芯片转移到单个板孔中。
大力摇动板以分离任何非粘附细胞,并立即用新鲜、温暖的介质更换上一液。然后在显微镜下检查图案是否可见。电镀48小时后,细胞应形成密集的菌落,严格遵循图案的形状。
将芯片留在板中,除足够介质外,除足够介质外,可防止芯片干燥,每井添加至少 500 微升的半形式醛或基于 PFA 的固定溶液。十分钟后,用洗涤液短暂洗井三次,然后用洗涤溶液中稀释的50毫摩尔氯化铵洗涤,以淬火残留PFA交联活性。最后一次洗涤后,用阻解溶液处理样品至少30分钟。
对于芯片培养物的免疫染色,将芯片转移到染色室细胞侧向上,并立即向每个芯片添加100微升的原抗体溶液。在室温下旋转平台上一小时后,如演示的洗涤溶液洗涤芯片三次,并在旋转平台上用适当的二级抗体孵育芯片一小时。在二次抗体孵育结束时,在洗涤溶液中清洗芯片三次,并在显微镜幻灯片上安装芯片,并安装任何标准安装介质的 20 微升。
要对芯片进行成像,请首先调整扫描速度、图像分辨率、帧平均和探测器增益,以确定图像质量和成像时间之间的最佳效果。然后获取每个芯片的图像。获取所有映像后,按照联机可用的文档安装并运行 PickCell,创建新实验,然后将映像导入程序。
使用Nessys 模块根据核包络信号对核进行分段。使用基本分段模块识别阵列的自荧光信号。然后单击"完成"并等待处理所有图像。
若要创建核对象并计算基本对象要素,请从任务栏启动"内部要素"模块,并关闭椭圆体拟合体和曲面提取器面板,使"基本要素"面板保持打开状态。选择"原子核"作为对象类型,然后选择为分段图像提供的前缀。然后单击"计算"并等待处理所有图像。
在此阶段,在导出数据以进行分析之前,需要将其他功能写入原子核。例如,要存储每个核心所属的图像名称,请在弹出式对话中单击"数据"和"新属性"并选择"核"。单击"确定""选择从连接到节点的其他对象收集数据",然后单击"左面板中的下一步",选择"图像",然后双击询问标记以将图像节点设置为路径的目标。
展开"缩减操作"窗格并选择"获取一个"展开可用属性窗格并选择"名称"属性。然后单击"更改"和"下一步"输入图像名称,按 Tab 键,然后单击"完成",然后将数据导出到选项卡分隔的值文件。为了我们的分析,将导出的数据循环到 R-Script 文件夹的数据文件夹中。
打开我们的工作室"并打开装箱的地图模板 R-Script",然后将工作目录设置为源文件位置,然后运行脚本生成密度图。在细胞播种后一小时,单个细胞培养的培养片可能不会完全汇合,因为细胞会随着时间而增殖。然而,这些图案将完全殖民,只有很少的细胞外粘合表面。
播种后两小时不清楚的模式表示过程失败。小鼠胚胎干细胞的空间禁闭在大圆盘或环微模式上,引导表达中皮胸毛标记的细胞子群的形态。例如,当小鼠胚胎干细胞生长在大磁盘微模式上时,胸膜阳性细胞被优先限制在局部细胞密度最低的模式的外围。
这种模式是由脑筋奇力的地图证实的。这些数据表明,该方法可以揭示子视觉信息,因为对一个群体的检查不足以识别任何形式的空间组织,以标记利益表达。这一点明显地由重要的殖民地到殖民地的变异性所解释。
该技术还表明,DNA结合抑制剂不存在可检测的模式,这可能表明T型板不是由骨形态遗传蛋白信号驱动的。始终记住盖滑的哪一侧已经消除和涂层,并确保细胞在洗掉多余的细胞之前正确粘附。这种方法允许在指导细胞自我组织方面重要的环境线索的研究,也可以为数学模型提供信息,在基本模式下更好地帮助我们。
这种方法能够在体外操控和量化细胞组织,使研究人员能够模拟模式并分解体内线索。它易于在标准生物实验室中实施,并有助于发现亚视觉模式事件。
Quantitative micropatterning and imaging of mammalian cells enables biopharma teams to interrogate emergent spatial organization and patterning mechanisms in vitro, decoupling environmental and endogenous cues. This approach supports predictive confidence in early discovery by revealing sub-visual patterning events and non-random differentiation within controlled systems. The method's accessibility and quantitative outputs position it as a reusable capability for target validation and mechanistic de-risking across diverse cell models.
This method integrates from early discovery through assay development and translational research, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in a standardized, quantitative framework.