Name: 探索序列空间,识别调节RNA结合蛋白的结合位点 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 学习饱和诱变技术识别RNA结合蛋白的特异性结合位点，该方法通过随机文库构建与多轮筛选分离实现高富集度。此技术可广泛应用于基因调控机制研究及疾病诊断治疗领域。

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作者感谢美国国立卫生研究院以往的资助。

注意：图1 概括了迭代筛选-扩增（SELEX）过程中的关键步骤。
1. 随机文库模板的构建
<ol>
	<li>使用DNA合成仪通过化学合成法合成正向引物 5’- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3’ 和反向引物 5’- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3’。 
	注意：引物和随机文库可委托商业公司合成。</li>
	<li>通过化学合成法合成随机文库寡核苷酸模板 5’- GGTGATCAGATTCTGATCCA(N1…N31)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3’。在合成过程中，对于上述所示的31个随机化位点（N），使用四种等摩尔的亚磷酰胺单体混合物。 
	注意：文库模板序列包含31个随机核苷酸（N1至N31）以及用于正向和反向引物结合的侧翼序列。正向引物包含T7 RNA聚合酶启动子序列（下划线标示），用于体外转录，以及用于克隆的限制性酶切位点Bcl1（斜体标示）。反向引物包含限制性内切酶位点BamH1和HindIII（斜体标示），以方便克隆操作。</li>
</ol>
2. DNA 随机文库池的构建
<ol>
	<li>通过聚合酶链式反应（PCR）将T7 RNA聚合酶启动子连接至文库，反应体系包含1 µM DNA随机文库模板、每种引物各1 µM、20 mM Tris（pH 8.0）、1.5 mM MgCl2、50 mM KCl、0.1 µg/µL乙酰化牛血清白蛋白、2单位Taq聚合酶，以及每种dNTP（脱氧鸟苷、脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷三磷酸）各200 µM。</li>
	<li>进行5个循环的变性、退火和延伸步骤（94 °C 1分钟、53 °C 1分钟、72 °C 1分钟），随后进行1个延伸循环（72 °C 10分钟）。</li>
</ol>
3. 第0组RNA的合成
<ol>
	<li>设置一个100 µL的转录反应12。混合T7转录缓冲液、1 µM随机文库池DNA、5 mM二硫苏糖醇（DTT）、2 mM鸟苷三磷酸（GTP）、每种各1 mM的腺苷三磷酸（ATP）、胞苷三磷酸（CTP）和尿苷三磷酸（UTP），以及2单位/µL的T7 RNA聚合酶。 
	注：可使用市售试剂盒在体外进行RNA转录，可选择T7或SP6 RNA聚合酶。</li>
	<li>将上述反应混合物置于微量离心管中，在37 °C下孵育2小时。</li>
	<li>在10%变性聚丙烯酰胺凝胶中对RNA进行凝胶纯化。</li>
	<li>通过亚甲蓝染色或放射自显影（在转录反应中加入微量放射性物质（如0.5 µL或更少的α-32P UTP））确定凝胶上转录产物的位置。
	<ol>
		<li>将凝胶切片放入离心管中，并用匀浆器尖端将其破碎成小块。加入蛋白酶K（PK）缓冲液（100 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，12.5 mM EDTA，1%十二烷基硫酸钠）以浸没凝胶碎片。将离心管置于摇床上，在室温下放置2小时至过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在高速微量离心机（14,000 rpm或16,873 × g）中于室温离心5分钟，以去除凝胶碎片并回收缓冲液。</li>
	<li>用等体积的酚-氯仿涡旋振荡样品两次，再用氯仿涡旋一次。</li>
	<li>将上述水相与十分之一体积的醋酸钠（3.0 M，pH 5.2）、10 µg tRNA或20 µg糖原以及乙醇（2–3体积，-20 °C保存）混合。将离心管置于-80 °C下1小时。</li>
	<li>在微量离心机（14,000 rpm或16,873 × g）中于4 °C离心5–10分钟。小心弃去上清液。用70%乙醇清洗RNA沉淀，再离心2–5分钟。小心吸除乙醇。将RNA沉淀在空气中干燥。</li>
	<li>将RNA沉淀溶于50 µL经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水中。将样品置于-20 °C保存。 
	注：可使用市售的离心柱对RNA进行纯化，目前这种方法更为常用，可有效去除未掺入的放射性物质，并作为RNA纯化的快速且便捷的替代方案。 
	注意：操作时应使用丙烯酸玻璃屏蔽装置、手套及其他防护措施，以防放射性物质暴露。</li>
</ol>
4. 蛋白质结合反应及结合RNA的分离
<ol>
	<li>在100 µL体积的10 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液中进行蛋白质与RNA的结合反应，加入以下成分至终浓度：50 mM KCl、1 mM DTT、0.09 µg/µL牛血清白蛋白、0.5 单位/µL RNasin、0.15 µg/µL tRNA、1 mM EDTA，以及30 µL适当浓度的重组蛋白（PTB）。从相应的RNA文库中加入RNA。 
	注意：剪接因子U2AF65通常以约1–10 nM的结合亲和力（平衡解离常数或Kd）结合模型内含子的多嘧啶 tract/3’剪接位点。因此，前两轮结合实验中使用的蛋白浓度为U2AF65的Kd值的10倍；对于SXL和PTB蛋白，该范围内的起始浓度仅为我们的最佳估计。这确保了能够结合的目标RNA物种被保留，尽管低亲和力序列也可能结合。在第3轮和第4轮（转录、结合和扩增）中，蛋白浓度降低三倍（见步骤4.1），以逐步淘汰低亲和力的RNA物种。</li>
	<li>将含有结合反应的离心管置于25 °C的温控金属块中（或置于冰上）约30分钟。</li>
	<li>在前四轮筛选-扩增过程中，使用以下步骤将结合的RNA与未结合的RNA分离。
	<ol>
		<li>在室温下，将样品（100 µL）通过连接真空泵的硝酸纤维素滤膜进行过滤。 
		注意：RNA-蛋白质复合物会留在滤膜上，而未结合的RNA则通过滤膜。</li>
		<li>用无菌剃刀片将保留有RNA的滤膜切碎，将碎片转移至离心管中。加入蛋白酶K（PK）缓冲液，使滤膜碎片浸没其中，轻轻翻转混匀至少3小时（或过夜），以回收RNA。</li>
		<li>在等体积的酚-氯仿（1:1）中涡旋振荡RNA样品以去除蛋白质，随后再用氯仿处理一次。每次处理后，在室温下高速离心5分钟，收集水相。</li>
		<li>加入乙酸钠（0.1倍体积的3.0 M，pH 5.2）和乙醇（2–3倍体积的无水乙醇，200 proof）。将离心管置于-80 °C冰箱中30分钟，高速离心10分钟，然后按洗涤和干燥步骤（步骤3.8）操作，最后将RNA溶解于经DEPC处理的水中。这些步骤如上所述（步骤3.6至3.9）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在最后两轮（第5轮和第6轮；转录、结合和扩增）中，按以下方法将蛋白结合的RNA组分与未结合组分分离。进一步将结合反应中的蛋白浓度（步骤4.1）降低三倍，以增强筛选压力，富集高亲和力结合序列，并优先去除低亲和力序列。
	<ol>
		<li>在设置上述RNA:蛋白结合反应（步骤4.1）之前，预先配制含0.5x TBE缓冲液（Tris-硼酸-EDTA）的非变性聚丙烯酰胺凝胶（5%，丙烯酰胺:双丙烯酰胺比例为60:1）。在低温室（4 °C）中对该凝胶施加250 V电压电泳15分钟。</li>
		<li>将上述RNA:蛋白结合反应液（步骤4.1）分别加入该凝胶的不同加样孔中。 
		注意：蛋白储存于-80 °C，使用前用含20 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）（pH 8.0）、20%甘油、0.2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.05% NP-40和1 mM二硫苏糖醇（DTT）的缓冲液稀释。可选择性添加0.5–1.0 mM蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）。在结合反应中，该缓冲液贡献约6%的甘油，因此样品可直接上样，无需额外加入上样缓冲液。</li>
		<li>在低温室（4 °C）中以250 V电压进行凝胶电泳1至2小时，分离结合与未结合的RNA。该过程也称为凝胶迁移率变动分析（gel mobility shift assay）。 
		注意：电泳时间根据所用RNA和蛋白的特性而有所不同。</li>
		<li>将凝胶暴露于X光胶片，通过放射自显影确定结合RNA的位置，切下含有结合RNA的凝胶条带并转移至离心管中。</li>
		<li>将破碎的凝胶条带在用于洗脱的PK缓冲液中孵育3小时或过夜。</li>
		<li>重复上述步骤3.5至3.9。简而言之，首先用酚-氯仿剧烈涡旋振荡洗脱的RNA样品，然后再用氯仿处理。</li>
		<li>在氯仿抽提后的水相中加入乙酸钠和乙醇。在-80 °C冰箱中孵育后，于4 °C离心5–10分钟以收集RNA沉淀。用乙醇洗涤RNA沉淀，并打开管盖在空气中干燥。将RNA溶解于经DEPC处理的水中。 
		注意：改用凝胶迁移率变动分析进行分离，可消除在初始筛选轮次中可能因非特异性结合（例如结合至硝酸纤维素滤膜或其他基质）而被富集的非目标RNA物种。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 逆转录与PCR扩增
<ol>
	<li>使用逆转录酶和反向引物，将溶解的RNA在20 µL反应体系（包含2 µL 10x RT缓冲液、2 µL AMV逆转录酶、1 µM反向引物、10 µL RNA，RNase抑制剂可选）中于42 °C孵育60分钟，合成cDNA。</li>
	<li>按照步骤2.1所述，使用20–25个PCR循环扩增cDNA。</li>
</ol>
6. 转录与蛋白质结合
<ol>
	<li>重复上述第3–5节中所述的RNA合成、蛋白质结合、分离结合与未结合组分的过程。</li>
</ol>
7. RNA-蛋白质相互作用的分析
<ol>
	<li>采用凝胶迁移率变动实验（步骤 4.4）或滤膜结合实验（步骤 4.3），测定所选文库或各文库中单个序列的结合亲和力与特异性（参见步骤 8.3）。</li>
	<li>使用放射自显影或磷屏成像仪检测并量化结合组分和未结合组分中的条带。</li>
</ol>
8. 克隆与测序
<ol>
	<li>用限制性内切酶 Bcl1 和 HindIII 对最终的 PCR DNA 产物进行消化，反应时间为 1–2 小时，然后与经相应酶切的 pGEM3 或其他含有相应限制性酶切位点的质粒连接，连接时间从 2 小时至过夜；再通过热激或电穿孔法，按照标准分子生物学操作流程13，将连接产物转化至感受态细菌细胞中。</li>
	<li>将转化后的细胞接种于含有氨苄青霉素（50 µg/mL）的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，于 37 °C 培养过夜。挑取单菌落接种至含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，在 37 °C 摇床培养箱中振荡培养过夜。采用标准质粒提取方法纯化含有DNA插入片段的质粒DNA13。 
	注意：市面上有商品化试剂盒可用于质粒纯化。</li>
	<li>采用双脱氧链终止测序法对含有DNA插入片段的质粒进行测序，操作步骤遵循测序试剂盒制造商的说明14。 
	注意：测序可在实验室内部完成，也可委托商业机构进行。</li>
</ol>
9. 序列比对
<ol>
	<li>使用现有的在线比对工具对序列进行比对，并获得一致性的结合位点（或结合位点区域） 
	(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)</li>
</ol>

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</ol>

作者声明其不存在竞争性经济利益。

核酸结合蛋白在动物和植物发育过程中起着重要的调控作用。SELEX 实验的关键要求之一是建立一种可用于分离蛋白质结合与未结合RNA组分的检测方法。原则上，该检测方法可以是体外结合实验，例如滤膜结合实验、凝胶迁移阻滞实验或基质结合实验19，适用于重组蛋白、纯化蛋白或蛋白复合物。该检测方法也可以是酶促反应实验，其中前体物质与产物（或中间产物）可根据分子大小或其他方式加以分离20。
尽管诱变技术已被广泛用于表征蛋白质的结合位点，但该方法费时费力，且较长的序列难以进行饱和诱变。本文所述的迭代结合与扩增方法的意义在于，它不仅克服了上述部分局限性，更重要的是能够识别先前未知的结合位点，同时提供每个位置核苷酸需求的重要信息。
迭代筛选-扩增成功的关键因素之一是结合亲和力和特异性。通常进行12至15轮筛选-扩增，可常规检测1012到1015个分子的序列空间。筛选-扩增流程的进展及最终成功可通过结合实验或直接...

在细胞生物学中，基因调控发挥着核心作用。在基因表达通路的一个或多个步骤中，基因都可能受到调控。这些步骤包括转录（起始、延伸和终止）、剪接、多聚腺苷酸化或3’端形成、RNA输出、mRNA翻译，以及初级转录本的降解与定位。在这些过程中，核酸结合蛋白可调节基因的表达。鉴定此类蛋白的结合位点是研究基因调控的重要方面。研究人员已通过突变分析和系统发育序列比对方法，用于发现核酸中的调控序列或蛋白质结合位点，例如启动子、剪接位点、多聚腺苷酸化元件以及翻译信号1,2,3,4。
前体mRNA剪接是基因表达和调控过程中的关键步骤。大多数哺乳动物基因（包括人类基因）都含有内含子。这些转录本中有很大一部分会经历可变剪接，从而从同一个基因或初级转录本产生多种mRNA和蛋白质异构体。这些异构体在细胞生物学中具有细胞特异性和发育阶段特异性的功能。5’剪接位点、分支点以及多嘧啶 tract/3’剪接位点是受调控的关键剪接信号。在负调控中，原本较强的剪接位点被抑制；而在正调控中，原本较弱的剪接位点被激活。这些调控事件的组合产生了大量功能各异的异构体。RNA结合蛋白在这些可变剪接事件中发挥着关键作用。
许多蛋白质的结合位点或RNA靶标仍有待鉴定5, 6。将调控蛋白与其下游生物学靶标或序列关联起来通常是一个复杂的过程。对于这类蛋白而言，鉴定其靶向RNA或结合位点是明确其生物学功能的重要步骤。一旦确定了结合位点，便可利用标准的分子与生化分析方法对其进行进一步表征。
本文所述方法具有两个优势。首先，该方法能够鉴定出目标蛋白此前未知的结合位点。其次，该方法的另一个优点在于可同时实现饱和突变，而若采用其他方法获得结合位点内序列需求的类似信息，则需耗费大量人力。因此，该方法为鉴定RNA中蛋白结合位点提供了一种更快捷、简便且成本较低的工具。最初，该方法（SELEX，即指数富集配体系统进化技术）被用于表征噬菌体T4 DNA聚合酶（基因43蛋白）的结合位点，该位点与其自身mRNA上的核糖体结合位点重叠。该结合位点包含一个8个碱基组成的环状序列，共有65,536种随机化变异体用于分析7。随后，该方法又被独立应用于证明：可从约1013条序列的文库中筛选出针对不同染料的特异性结合位点或适配体8。事实上，该方法已在多种不同背景下被广泛使用，用于筛选识别多种配体（如蛋白质、小分子和细胞）以及具有催化功能的适配体（RNA或DNA序列）9。例如，一种适配体能够区分两种黄嘌呤衍生物——咖啡因和茶碱，二者仅在咖啡因中多出一个甲基10。我们已广泛采用该方法（SELEX或迭代筛选-扩增）研究RNA结合蛋白在剪接或剪接调控中的作用机制11，这也将成为下文讨论的基础。
随机文库：我们使用了一个包含31个核苷酸的随机文库。选择该随机文库长度的依据大致如下：通用剪接因子U2AF65可结合于分支点序列与3’剪接位点之间的序列。在后生动物中，这两个剪接信号之间的平均间距约为20至40个核苷酸。另一种蛋白Sex-lethal已知可结合于其靶标pre-mRNA transformer 的3’剪接位点附近一段特征尚不明确的调控序列。因此，我们选择了一个长度为31个核苷酸的随机区域，并在其两侧添加了带有限制性酶切位点的引物结合位点，以便进行PCR扩增以及连接T7 RNA聚合酶启动子，用于体外转录。该文库的理论大小（即复杂性）为431，约等于1018。在后续实验中，我们仅使用了该文库的一小部分来制备随机RNA池（约~1012-1015）。

<table><tbody><tr><td>凝胶电泳设备</td><td>标准</td><td>标准</td><td></td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>标准</td><td>标准</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Millipore</td><td>HAWP</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Schleicher &amp;amp; Schuell</td><td>PROTRAN</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯酰胺凝胶溶液</td><td>标准</td><td>标准</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>重组PTB蛋白</td><td>实验室制备</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>逆转录酶</td><td>NEB</td><td>M0277S</td><td></td></tr><tr><td>真空抽滤装置</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX1002500</td><td>Millipore 25mm 玻璃微量分析真空滤器</td></tr><tr><td>真空抽滤装置</td><td>Millipore</td><td>XX2702552</td><td>1225 取样真空多联过滤器</td></tr><tr><td>X射线胶片</td><td>标准</td><td>标准</td><td></td></tr></tbody></table>

探索序列空间以鉴定调控性rna结合蛋白的结合位点

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

基因调控在所有细胞中均发挥重要作用。通过转录、转录后（或RNA加工）、翻译以及翻译后等步骤，可实现对特定基因的调控。序列特异性的核酸结合蛋白通过识别特定序列，从而控制基因在空间或时间上的表达。核酸中的结合位点通常通过突变分析进行表征。然而，许多感兴趣的蛋白质尚无已知的结合位点可供此类表征。本文介绍一种用于鉴定RNA结合蛋白先前未知结合位点的方法。该方法从一个随机序列库出发，通过序列的迭代筛选与扩增实现。经过多轮转录、结合和扩增步骤后，对富集的序列进行测序，以确定其偏好的结合位点。该方法的成功与否可通过体外结合实验进行监测。随后，可利用体外和体内功能实验评估所筛选序列的生物学意义。该方法适用于任何存在可分离蛋白结合与未结合RNA实验手段的RNA结合蛋白，可用于鉴定和表征其先前未知的结合位点。

以下观察结果表明筛选-扩增（SELEX）已成功。首先，我们分析了初始文库（pool 0）以及筛选获得的序列与用于迭代筛选-扩增过程的蛋白质之间的结合情况。图2显示，哺乳动物多嘧啶 tract 结合蛋白（PTB）对初始文库（pool 0）序列的结合几乎无法检测，但对筛选后获得的序列文库具有高亲和力。当使用比筛选后文库高约300倍的蛋白质浓度时，对初始文库的结合仍几乎无法检测。因此，随机或起始文库与筛选后文库之间在蛋白质结合亲和力上至少存在数百倍的差异。该结果通过实验验证了本文所述的筛选-扩增方案是成功的。
其次，我们对筛选出的序列库进行测序，并确定了其共有序列。通过对哺乳动物PTB筛选库中大多数选中序列进行比对，获得的共有序列为：GCCUG(Y/G)UGCYYYYCYYYG(Y/G)CCC。这表明我们已成功筛选出能够结合PTB的独特富含嘧啶的序列。11</su...

序列特异性对于基因调控至关重要。能够识别特定序列的调控蛋白在基因表达调控中具有重要作用。确定这些蛋白的功能性结合位点是一个具有挑战性的生物学问题。本文描述了一种用于鉴定RNA结合蛋白结合位点的迭代方法，该方法适用于所有RNA结合蛋白。

探索序列空间以鉴定调控性RNA结合蛋白的结合位点

基因调控在所有细胞中都起着重要作用。转录水平、转录后（或RNA加工）、翻译水平以及翻译后修饰……

该方案用于蛋白质结合位点的饱和突变。如果您的蛋白质结合位点未知，可使用此方案进行鉴定。该技术在疾病诊断与治疗中具有重要意义。我认为该方法在生物医学科学中的全部潜力仍有待充分发掘。该方法可广泛应用于任何蛋白质或反应体系，只要能够将目标分子与非目标分子分离开即可。确保文库经过充分随机化，并确保在每一次结合与分离步骤中，目标分子的富集倍数均保持较高水平。该过程包含多个步骤和诸多细节，通过演示比单纯文字描述更为直观。观看本视频后，您将能够熟练掌握如何制备随机文库、合成起始RNA文库，以及如何进行结合反应以分离目标分子与非目标分子，从而获得高亲和力和特异性的结合分子。首先，使用DNA合成仪通过化学合成方法合成正向引物和反向引物。同时，合成一个包含31个随机化位点的随机文库寡核苷酸模板。在PCR管中，加入1微摩尔的DNA随机文库模板、1微摩尔含有T7 RNA聚合酶启动子的正向引物和反向引物、pH为8的20毫摩尔Tris缓冲液、1.5毫摩尔氯化镁、50毫摩尔氯化钾、1微克/毫升乙酰化牛血清白蛋白、2单位Taq DNA聚合酶，以及每种200微摩尔的dNTPs。将PCR仪程序设置为进行5个循环的变性、退火和延伸步骤，随后进行1个循环的延伸反应，以将启动子连接至DNA文库。设置一个100微升的转录反应体系，其中包含T7转录缓冲液、1微摩尔的随机文库DNA、5毫摩尔的DTT、2毫摩尔的GTP、每种1毫摩尔的ATP、CTP和UTP，以及每微升2单位的T7 RNA聚合酶。现在戴上丙烯酸玻璃防护罩和手套。通过向转录反应体系中加入5微升或更少的α-32P UTP，引入放射性以用于放射自显影。将反应混合物置于微量离心管中，在 37 摄氏度下孵育两小时。为进行RNA凝胶纯化，配制10%变性聚丙烯酰胺凝胶。将样品加入凝胶的加样孔中。将凝胶暴露于X射线胶片，确定凝胶上转录本的位置，并切下相应的凝胶条带。将凝胶条带放入离心管中，用匀浆器尖端将其破碎成较小的碎片。加入蛋白酶K缓冲液，使凝胶碎片完全浸没。将离心管置于旋转混合仪上，室温孵育至少两小时。然后在室温下以高速微量离心机离心五分钟，以去除凝胶碎片并回收缓冲液。向含有上清液的离心管中加入等体积的苯酚-氯仿溶液，涡旋混匀，随后离心。再用酚-氯仿提取一次，然后用氯仿再提取一次。接着，向蛋白酶K缓冲液的水相中加入1/10体积的pH 5.2的3摩尔醋酸钠、10微克tRNA或20微克糖原，以及两到三倍体积的-20摄氏度保存的乙醇。将离心管置于-80摄氏度下静置1小时。将含有溶液的离心管在4 °C下以微量离心机离心5至10分钟。小心弃去上清液，并加入70%乙醇洗涤RNA沉淀。再离心2至5分钟。小心吸除乙醇，并将RNA沉淀在空气中干燥。接着，加入50 µL经DEPC处理的水以溶解RNA沉淀。将样品置于-20 °C保存。在100微升反应体系中结合蛋白质和RNA时，首先配制含有50毫摩尔氯化钾、1毫摩尔DTT、0.9微克/微升牛血清白蛋白、5单位/微升RNAsin、15微克/微升tRNA以及1毫摩尔EDTA的10毫摩尔Tris盐酸缓冲液（pH 7.5）。然后加入30微升重组蛋白PTB和10微升来自相应文库的RNA。将含有结合反应液的离心管置于25摄氏度的温控仪中孵育约30分钟。接下来，通过四轮筛选和扩增，将结合的 RNA 与未结合的 RNA 进行分离。首先，在室温下将 100 微升样品通过连接至真空过滤装置的硝酸纤维素滤膜进行过滤。RNA-蛋白质复合物将留在滤膜上。使用无菌剃须刀片将滤膜切成碎片，并将这些碎片插入离心管中。将滤膜碎片浸入蛋白酶K缓冲液中，置于旋转摇床中至少三小时或过夜，以回收RNA。为去除RNA样本中的蛋白质，加入等体积的苯酚-氯仿溶液，涡旋振荡，然后在室温下高速离心五分钟。取水相，再次用氯仿进行萃取。随后，向该上清液中加入1/10体积pH 5.2的3摩尔乙酸钠溶液以及2至3体积的无水乙醇，混匀。将离心管置于-80摄氏度冰箱中静置30分钟，然后高速离心10分钟。用70%乙醇重复洗涤和干燥步骤，并将RNA溶于经DEPC处理的水中。在完成第一轮滤膜结合实验后，再进行三轮实验。接下来，进行两轮转录、结合和扩增，以分离与蛋白质结合的RNA组分和未结合的RNA组分。使用5x TBE缓冲液配制天然5%聚丙烯酰胺凝胶，丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例为60:1。然后建立RNA-蛋白质结合反应。将凝胶置于装有5x TBE缓冲液的电泳装置中，并在4摄氏度的冷室中进行电泳。施加250伏电压持续15分钟，并将结合反应液转移至不同的孔中。然后以250伏电压进行电泳，持续1至2小时，进一步分离结合的RNA与未结合的RNA。接着将凝胶暴露于X射线胶片，通过放射自显影确定结合RNA的位置。用刀切下含有结合RNA的凝胶片段，并将其放入离心管中。将凝胶片段碾碎，加入蛋白酶K缓冲液，37℃孵育3小时或过夜。随后按照前述方法，用酚-氯仿和氯仿重复抽提一次。从溶解的RNA中合成cDNA。准备20微升反应体系，包含2微升10x RT缓冲液、2微升AMV逆转录酶、1微升逆转录引物、5微升水和10微升溶解的RNA。在42摄氏度孵育60分钟。使用先前所述的方法，通过20至25个PCR循环扩增cDNA。重复进行RNA合成、蛋白质结合以及结合与未结合组分的分离过程。为分析蛋白质结合情况，采用凝胶迁移率变动实验或滤膜结合实验，以确定所选文库或各文库中特定序列的结合亲和力和特异性。使用放射自显影或磷屏成像仪检测并定量结合组分和未结合组分中的条带。继续进行克隆和序列比对实验步骤。本研究中，成功实现了筛选-扩增。哺乳动物多嘧啶区结合蛋白在蛋白质浓度高出300倍的情况下，对零号序列的结合几乎无法检测，但对所选序列库表现出高亲和力。通过筛选-扩增方法成功鉴定了具有偏好性或共识结合位点的RNA结合蛋白。添加能够结合上游3'剪接位点的重组PTB蛋白，可导致替代性或下游3'剪接位点的激活。相比之下，加入重组hnRNP C会导致两个3'剪接位点均被抑制。加入重组的通用剪接因子U2AF65可逆转hnRNP C介导的3'剪接位点抑制作用。需要牢记的是，一个良好的随机化文库以及适当的结合条件（在每步结合中均能实现高倍数富集）是实验成功的关键。可采用适当的体外功能检测和体内实验来验证该方法的结果。在基因表达研究领域，已有大量蛋白质的功能通过该技术得到研究。在操作聚丙烯酰胺和放射性物质时，必须佩戴手套并使用放射性密封材料进行防护。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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本文优化了一种RNA下拉实验方案，用于检测RNA结合蛋白（RBPs）与非编码RNA以及编码RNA之间的相互作用。以雄激素受体（AR）的RNA片段为例，展示了如何从原代棕色脂肪细胞的裂解液中富集与其结合的RNA结合蛋白。...

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一种新型饱和突变方法：利用硫代磷酸酯一步法表征RNA中调控蛋白结合位点

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通过串联RNA免疫沉淀测序（RIPiT-Seq）鉴定RNA:蛋白质复合物的足迹

MAPS 技术已开发用于在体内深入分析特定调控 RNA 的靶标组。感兴趣的 sRNA 被标记上 MS2 适体，从而实现其 RNA 相互作用伙伴的共纯化，并通过 RNA...

MS2亲和纯化联合RNA测序在革兰氏阳性菌中的应用

学习饱和诱变技术识别RNA结合蛋白的特异性结合位点，该方法通过随机文库构建与多轮筛选分离实现高富集度。此技术可广泛应用于基因调控机制研究及疾病诊断治疗领域。

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