探索序列空间,识别调节RNA结合蛋白的结合位点

该协议用于蛋白质结合位点的饱和突变。如果您的蛋白质结合位点不知道，可以使用此协议进行识别。该技术与疾病诊断和治疗有关。

我认为，它在生物医学科学方面的充分潜力仍有待充分挖掘。这种方法可以广泛应用于任何蛋白质或反应，其中所需的分子可以从不需要的分子分离。确保库正确随机化，并确保在每个结合和分离步骤中，所需分子的折叠富集性很高。

它涉及几个步骤和许多细节，更好地证明，而不是用文字解释。观看此视频后，您应该能够适应如何准备随机库、合成启动的 RNA 池，并执行结合反应以分离所需的和不需要的分子，以获得高亲和力和特定的粘合剂。首先，在DNA合成器上通过化学合成合成前底和反向底剂合成。

此外，合成一个随机库寡核苷酸模板与31个随机位置。在PCR管中，混合一微摩尔DNA随机库模板， 含有T7RNA聚合酶促进剂和反向底因的一微摩尔前底板，pH8下20毫摩尔三酯，1.5毫摩尔氯化镁，50毫摩尔氯化钾，每毫升1微克乙酰化牛血清白蛋白，两个单位的Taq聚合酶，和200微摩尔每个dNTP。设置 PCR 机器，具有变性、退火和扩展步骤的五个周期，然后设置一个扩展周期，将启动子连接到 DNA 库。

设置含有T7转录缓冲液、单微摩尔随机库DNA、5毫摩尔DTT、2毫摩尔GTP、ATP、CTP和 UTP各1毫摩尔以及每微升2单位T7RNA聚合酶的100微升转录反应。现在戴上丙烯酸玻璃护罩和手套。通过将 5 微升或更少的 alpha-32P UTP 添加到自皮造影的转录反应中来引入放射性。

在37摄氏度的微离心管中孵育反应混合物两小时。要凝胶净化RNA，请准备10%变性聚丙烯酰胺凝胶。将样品装入凝胶的孔中。

将凝胶暴露在 X 射线膜中，并确定凝胶上转录本的位置并切掉凝胶片。将凝胶片放入离心管中，用均质器尖端分解成更小的片断。加入蛋白酶K缓冲液，浸入凝胶片。

在室温下将管子放在螺母上至少两个小时。然后在室温下高速微离心中旋转五分钟，以清除凝胶碎屑并回收缓冲液。与上流剂、涡流和离心机一起，将同等体积的酚氯仿加入管中。

再用苯酚氯仿重复提取，再用氯仿重复一次。接下来，将蛋白酶K缓冲液的水相与pH5.2、10微克tRNA或20微克糖原的1/10体积三摩尔醋酸钠混合，并在零下20摄氏度储存2至3卷乙醇。将管子在零下80摄氏度下离开一小时。

在微离心中旋转含有溶液的管子5至10分钟，温度为4摄氏度。小心丢弃上清液，加入70%乙醇冲洗RNA颗粒。旋转两到五分钟。

小心吸制乙醇，并风干RNA颗粒。接下来，加入50微升用DEPC处理的水，使RNA颗粒溶解。将样品留在零下20摄氏度，储存。

将蛋白质和RNA结合在100微升的反应量中， 首先在含有50毫摩尔氯化钾、1毫摩尔DTT、每微升牛血清白蛋白、每微升5单位RNAsin、每微升15微克、微升tRNA和1毫摩尔EDTA时，以7微升盐酸十分法，15微克盐酸酯。盐酸十足三氯酸酯。磷酸盐，每微升TRNA，每微升5微升，每微升TRNA，1微升，1微升，1微升TRNA，1微升TRNA，1微升。1微升，每微升TRNA。1毫摩尔-12，00微升，每微升TRNA。中，每微升TRNA。1米摩尔，每微升TRNA。10微升，每微升TRNA15米。1微升，每微升TRNA。10微升，每微升TRNA。10微克，每微升tRNA，每微升TRNA15微升TRNA，每然后从适当的池中加入30微升重组蛋白PTB和10微升RNA。将含有结合反应的管子在温度块中放置约30分钟，温度为25摄氏度。

接下来，通过四轮选择和扩增，从未绑定RNA中对绑定RNA进行分馏。首先，通过连接到真空歧管的硝基纤维素过滤器，在室温下过滤100微升样品。RNA-蛋白质复合物仍保留在过滤器上。

用无菌剃须刀刀片，将过滤器切成碎片，然后插入离心管。将滤片浸入蛋白酶K缓冲液中，并放在滚筒上至少三个小时或过夜以回收RNA。要使RNA样品脱蛋白，加入同等体积的酚-氯仿、涡流，然后在室温下高速离心五分钟。

获得水相，并再次提取氯仿。之后，将上经剂与1/10体积的三摩尔醋酸钠混合在pH 5.2和2至3卷绝对乙醇中。将管子放在零下80摄氏度的冰柜中30分钟，然后高速离心10分钟。

使用 70% 乙醇重复洗涤和干燥步骤，并在 DEPC 处理的水中溶解 RNA。第一轮过滤结合测定后，进行三轮。接下来，执行两轮转录、结合和扩增，将蛋白结合的RNA分数与未结合的馏分分离。

在 5 倍 TBE 缓冲液中预制一种原生 5%聚丙烯酰胺凝胶，丙烯酰胺比为 60 比 1。然后建立RNA蛋白结合反应。将凝胶放在充满 5x TBE 缓冲液的电泳装置中，温度为 4 摄氏度。

应用250伏特15分钟，将结合反应移液到不同的井中。然后，通过以250伏电压运行电泳一到两个小时，进一步从未绑定RNA中对绑定RNA进行分馏。接下来，将凝胶暴露在 X 射线膜中，并使用自扫描确定绑定 RNA 的位置。

用绑定的RNA切掉凝胶片，并将其插入管中。粉碎凝胶片，在蛋白酶K缓冲液中孵育三小时或过夜。如前面所述，使用苯酚氯仿和氯仿重复萃取。

从溶解的RNA合成cDNA。准备20微升的反应，包括两个10倍RT缓冲液微升，2个MV逆转录酶微升，一个反素转微升，5微升水，10微升溶解RNA。在42摄氏度下孵育60分钟。

如前所述，使用 20 到 25 个 PCR 周期放大 cDNA。重复RNA合成、蛋白质结合和蛋白质结合和未结合分数分离的过程。要分析蛋白质结合，请使用凝胶移动移位测定或过滤器结合测定来确定每个池内选定池或单个序列的结合亲和力和特异性。

使用自动测量或荧光成像仪检测和量化绑定分数和未绑定分数中的波段。使用克隆和序列对齐继续协议。在这项研究中，成功地实现了选择放大。

具有300倍高蛋白浓度的哺乳动物多酰胺-二聚酰胺结合蛋白显示，与池零序列几乎检测不拟结合，但对所选序列池的相关性很高。选择扩增成功识别在RNA结合蛋白与首选或共识结合位点。添加与上游三等分线拼接站点绑定的重组 PTB 会导致替代或下游三等拼接站点的激活。

相比之下，如果重新组合的 hnRNP C 导致对两个三个黄金拼接站点的压制。添加重组一般拼接因子 U2AF65 扭转了 hnRNP C 中压三个黄金拼接站点的压制。重要的是要记住，一个好的随机库和适当的绑定条件，在每个绑定步骤给予高折叠丰富是必要的成功。

适当的功能测定和体内测试可用于验证此方法的结果。在基因表达领域，利用该技术对多种蛋白质的功能进行了研究。使用聚丙烯酰胺和放射性时，使用手套和放射性密封进行保护非常重要。