一种无需交联剂制备壳聚糖-聚（乙烯醇）水凝胶的冻融方法及双氟尼酸释放研究

本方案具有重要意义，因为我们的冻融方法是一种适用于制备生物相容性水凝胶的适宜工艺，可用于生物医学、制药或化妆品领域。该方法的主要优势在于无需使用可能引起出生缺陷的化学交联剂。此外，该方法中采用的冷冻条件可调控水凝胶的最终性能，如交联程度等。

该方法可应用于具有其他用途的水凝胶。该方法可用于处理水污染。实际上，它还可用于制备聚合物微珠，作为新培养体系中的储水容器。

彻底均质化所测量的聚合物溶液非常重要，否则水凝胶会出现裂纹点。此外，每个循环中的冷冻时间也必须严格控制。

开始此实验步骤时，将0.2克壳聚糖和10毫升0.1摩尔的乙酸在室温下溶解，并持续进行机械搅拌过夜，以制备2%的壳聚糖溶液。第二天，将1克聚乙烯醇（PVA）溶于10毫升蒸馏水中，在80摄氏度下搅拌一小时。使用磁力搅拌器在室温下将两种溶液等量混合，持续搅拌至形成均匀的混合溶液。

将混合物倒入培养皿中。在常压下静置样品两小时以去除气泡。将水凝胶在负四摄氏度、负20摄氏度或负80摄氏度下冷冻20小时，并进行四个冻融循环。

使用五次或六次冷冻循环，将另一种水凝胶在-80摄氏度下冷冻20小时。在第三次冷冻循环后，用去离子水洗涤水凝胶。在最后一次冷冻循环结束后，将水凝胶在-50摄氏度下冷冻干燥48小时，并进行搅拌以进一步表征。

准备进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征时，将一小块水凝胶置于傅里叶变换红外光谱仪的ATR模式下。采集波数范围为4000至600 cm⁻¹的FT-IR光谱。首先，从水凝胶中切取直径为13毫米、高度为10毫米的圆片。

称重。将圆片置于50毫升去离子水中，在25摄氏度下振荡孵育。每隔30分钟从培养基中取出样品。

用吸水纸吸去样品上多余的水分并称重。然后根据文本方案计算溶胀度，并进行电子显微镜观察和孔隙非对称性分析。上样前，配制4升浓度为15毫克/升的双氟尼酸溶液，搅拌过夜。

通过紫外-可见光谱法确认溶液的浓度。然后将400毫克冻干水凝胶样品与6毫升蒸馏水在24小时内溶胀。对于载药过程，将50毫升双氟尼酸溶液加入烧瓶中，并在25°C下持续搅拌维持。

将每个溶胀后的水凝胶浸入烧瓶中。随后，在不同时间点取2毫升剩余的双氯芬酸溶液样品，以确定曲线的平台区域。24小时后，更换为新鲜溶液。

在252纳米处测定每份等分试样的吸光度，并利用双氟尼酸的标准曲线确定溶液中双氟尼酸的浓度。根据文本方案中的说明，计算水凝胶中保留的双氟尼酸含量及包封率。随后将载药水凝胶在-80摄氏度下冷冻，并在-50摄氏度下进行冻干。

对于药物释放，将300毫克冻干的双氟尼酸负载水凝胶浸入50毫升pH为7.4、25摄氏度的磷酸盐缓冲液中，保持持续搅拌。在不同时间点取出2毫升等分试样，并补充新鲜介质以维持恒定体积。

根据标准曲线，通过紫外-可见分光光度法在252纳米处测定双氟尼酸的释放量。随后，依据文本方案推断水凝胶中主要的药物释放机制。此处，CSPVA水凝胶采用冻融法制备，无需使用交联剂。

FT-IR 谱图显示出两种聚合物的七个特征信号。所有 CSPVA 水凝胶均表现出高度多孔的表面，并且根据制备条件观察到明显的结构变化。在零下 4 °C 条件下制备的水凝胶具有最大的孔径。

在零下80摄氏度制备的水凝胶似乎具有更疏松的多孔网络结构，且冷冻循环次数似乎促进了更清晰且更圆的孔隙形成。然而，在零下80摄氏度下经过六次冷冻循环制备的水凝胶比经过四次冷冻循环制备的水凝胶渗透性更低，这可能是由于其较高的曲折度所致，表现为总侵入体积较低。在溶胀行为方面，水凝胶能迅速吸收大量水分，在最初五小时内可吸收并保持相当于其自身重量十倍的水分，20小时后可达其自身重量的15倍。

观察温度影响时发现，在–80 °C下经过四次冻融循环制备的水凝胶在前五小时内表现出较低的溶胀能力。在任何时间点均未观察到冻融循环次数产生显著差异。在所有情况下，双氯芬酸从水凝胶中的释放动力学持续约30小时，其中在–80 °C下经过四次冻融循环制备的水凝胶释放量最高。

在–80摄氏度下经过四次冷冻循环制备的水凝胶与在–80摄氏度下经过六次冷冻循环制备的水凝胶之间的释放行为没有差异。进行此操作时最重要的是冷冻条件。为了获得完全形成、结构完整的水凝胶，必须至少进行约三次冷冻循环。

该方法可与细胞培养相结合，用于评估体外生物相容性，也可与降解研究相结合。在这些方法开发完成后，我们意识到可以进一步探索在混合物中添加其他聚合物，甚至芦荟等天然化合物的可能性。

这样做将使我们能够将新特性融入这些材料中。