Name: 一种冷冻-解冻方法，用于制备奇托桑-波里（乙烯基酒精）水凝胶，无交联剂和二分释放研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学习冷冻-解冻法制备无交联剂壳聚糖-聚乙烯醇水凝胶，用于生物医学和药物递送应用。该方法通过控制冷冻条件调节水凝胶性能，具有良好的生物相容性和可控释药特性。

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作者感谢 C. Luzuriaga 在孔隙率测量方面的支持。作者还感谢西班牙经济与竞争力部提供的经费支持（项目编号 MAT2014-59116-C2-2-R）以及 PIUNA（项目编号 2018-15）。作者谨向来自索诺拉大学物理系的 Amir Maldonado 博士致谢，感谢其提供的支持与有益建议；同时感谢来自索诺拉大学 DIPM 的 S. E. Burruel-Ibarra 博士提供的扫描电镜图像，以及 Rubio Pharma y Asociados S. A. de C. V. 提供的经费支持。M. E. Martínez-Barbosa 感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT）项目 No. 104931 和 No. 256753 的资助，以及 CONACyT 主题网络计划中纳米科学与纳米技术主题网络提供的经费支持，同时也感谢项目 USO316001081 的资助。M. D. Figueroa-Pizano 感谢 CONACyT 提供的经费支持（奖学金编号 373321）。

1. 壳聚糖-PVA 水凝胶的制备
<ol>
	<li>制备2% (w/w) 壳聚糖和10% (w/w) 聚乙烯醇（PVA）溶液。将0.2 g壳聚糖溶解于10 mL已预先过滤的0.1 M CH3COOH溶液中，在室温下持续机械搅拌过夜。将1 g PVA溶解于10 mL蒸馏水中，在80 °C下搅拌1 h。</li>
	<li>使用磁力搅拌器在室温下将两种溶液按1:1比例混合至均匀，然后将混合物倒入培养皿中。在常压下静置样品2 h以脱气。</li>
	<li>将水凝胶分别在-4 °C、-20 °C或-80 °C下冷冻20 h并进行4个冻融循环（样品分别为CP4-4、CP4-20和CP4-80）。另将一种水凝胶在-80 °C下冷冻20 h，进行5或6个冻融循环（样品分别为CP5-80和CP6-80）。在第三次冻融循环后，用去离子水洗涤水凝胶。最后，在-46 °C下冷冻干燥48 h，保存以备进一步表征（方法学参考自2）。</li>
</ol>
2. FT-IR 表征
<ol>
	<li>将一小块（1 mm × 2 mm）水凝胶置于傅里叶变换红外光谱仪的ATR模式下。采集4000至600 cm-1范围内的FT-IR光谱（分辨率为2 cm-1，累积32次扫描取平均值）。</li>
</ol>
3. 肿胀实验
<ol>
	<li>从水凝胶中切下圆片（直径13 mm，高度10 mm）并称重。将圆片置于50 mL去离子水中，在25 °C下振荡孵育。重复三次。</li>
	<li>每30分钟将样品从介质中取出，用吸水纸吸去多余水分后称重。使用公式1计算溶胀度，并使用公式2计算24小时时的溶胀平衡状态，<img alt="DNA分离过程的色谱图；PCR工作站；光谱拟合分析。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式1">。 
	<img alt="静态平衡方程：SD(%) = [(Ws-Wd)/Wd]*100，公式。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式2">) 
	其中 <img alt="静态平衡；ΣFx=0；受力图，自由体分析；教育性物理概念。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式3"> 为干燥水凝胶的质量，<img alt="静态平衡图，ΣFx=0；梁平衡分析和力矢量计算设置。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式4"> 为溶胀后水凝胶的质量。 
	<img alt="科学分析中土壤含水量比的方程，q=Ws/Wd。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式5"></li>
</ol>
4. 电子显微镜
<ol>
	<li>在溅射镀膜仪中，用薄金层（30 秒，10 mA）覆盖一小块水凝胶。</li>
	<li>将样品放入扫描电子显微镜（SEM）中。在真空条件下以 20 kV 分析样品，并以 500 倍和 1500 倍放大倍数拍摄图像。</li>
</ol>
5. 孔隙率测定
<ol>
	<li>将直径为15 mm、重量约为0.26 g的圆片放入 penetrometer（一种实体 penetrometer，其整体体积为0.3660 mL，茎部体积为5.7831 mL）中。采用压汞法（Mercury Intrusion Porosimetry, MIP）分析孔隙率和孔径。</li>
	<li>以滞后模式（进汞-退汞）进行实验。测定总进汞体积（mL/g）、总孔面积（m2/g）、孔径（µm）、孔隙率（%）、渗透率（mDarcy）和曲折度。重复实验两次。</li>
</ol>
6. 药物负载与释放
<ol>
	<li>在上样前，配制4 L浓度为15 mg/L的双氯芬酸溶液，并搅拌过夜。通过紫外-可见分光光度法确认溶液浓度（初始浓度）。将400 mg冻干水凝胶样品置于6 mL蒸馏水中溶胀24 h。</li>
	<li>上样时，将50 mL双氟尼酸溶液加入烧瓶中并保持 25 °C 持续搅拌。将每个溶胀的水凝胶浸入烧瓶中。
	<ol>
		<li>在不同时间点取剩余的双氟尼酸溶液等分试样（2 mL），以测定其 高原 曲线的特定时间点，例如：3、6、24、27、30 和 48 小时。24 小时后，更换为新鲜溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在252 nm处测定每份等分试样的吸光度，并利用双氟尼酸的标准曲线确定溶液中双氟尼酸的浓度。根据初始浓度与最终浓度的差值，结合总体积（56 mL），计算24小时和48小时时水凝胶中保留的双氟尼酸含量。
	<ol>
		<li>使用公式 3 计算包封率（EE）。 
		<img alt="包封效率计算公式；EE% = 水凝胶与溶液中的浓度比；公式3。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 6"></li>
		<li>将负载的水凝胶在 -80 °C 下冷冻80 °C 并在 -50 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物释放实验中，将300 mg冷冻干燥的双氟尼酸负载水凝胶浸入50 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中 25 °C持续搅拌。在不同时间点吸取2 mL等分样品，并补充新鲜培养基以维持恒定体积。
	<ol>
		<li>根据标准曲线，通过紫外分光光度法在252 nm处测定双氟尼酸的释放量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据Korsmeyer-Peppas模型（公式4）拟合水凝胶中药物释放数据的前60%，推断主要的药物释放机制，以获得动力学参数k）以及扩散（n）常数。该 n 数值表明药物释放机制24,25然后， n 接近 0.5 的值对应于菲克扩散，0.5–1.0 的值对应于反常传输，其中涉及扩散与链段松弛过程，而 1.0 的值则对应于情况 II 传输。 
	<img alt="用于药物释放动力学研究的Korsmeyer-Peppas模型方程，Mt/M∞ = kKPtn。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 7">
	<ol>
		<li>为验证结果，采用Higuchi、一级和零级数学模型（公式5至7），并选择拟合度最佳的模型。</li>
		<li><img alt="Higuchi 模型方程 \(M_t/M_\infty = k_H t^{0.5}\)，药物释放动力学公式。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq8.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 8"> 
		<img alt="一级动力学模型方程；Mt/M∞=1-e^-k1*t。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq9.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 9"> 
		<img alt="零级模型方程，\( M_t/M_\infty = k_0 t \)，用于动力学分析。" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq10.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 10"> 
		其中 t 表示释放时间， Mt 在特定时间内递送的药物量，以及 M∞ 过程结束时递送的药物总剂量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

冻融法是一种适用于制备用于生物医学、制药或化妆品领域的生物相容性水凝胶的合适方法34,35,36。与其它制备水凝胶的常用方法相比，该方法最重要的优势在于无需使用交联剂，从而避免了可能引发人体炎症反应或不良副作用的风险34。该方法具有良好的通用性，因为它能够以聚乙烯醇（PVA）或其与其他聚合物的混合物为原料制备水凝胶11,37，从而在新材料中引入其他聚合物的新特性（例如更高的吸水能力、抗菌或抗氧化性能2,18,35）。然而，需要注意的是，引入其他聚合物可能会降低水凝胶的机械强度<sup class="xre...

近年来，水凝胶因其具有高含水量、柔软且柔韧的三维网络结构，在生物医学领域受到广泛关注，能够轻易模拟天然组织1。此外，水凝胶在生理温度和pH条件下不溶于水性介质，但可发生显著溶胀2。水凝胶可用作组织工程支架、卫生用品、隐形眼镜和伤口敷料；由于其能够包埋并释放活性化合物和药物，因此也被用作药物递送系统3。根据具体应用需求，水凝胶可由天然聚合物、合成聚合物或两者的组合制备，以获得最佳性能特征4。
水凝胶的性质是多种物理和化学因素共同作用的结果。在物理层面，其结构和形貌取决于孔隙率、孔径大小以及孔分布5。在化学和分子层面，聚合物类型、聚合物链中亲水基团的含量、交联点类型以及交联密度是决定溶胀能力和机械性能的关键因素6,7。
根据形成网络所用交联剂的类型，水凝胶可分为化学水凝胶和物理水凝胶。化学水凝胶通过链间的共价相互作用连接而成，这种共价键可通过紫外光或γ射线辐照，或使用交联剂形成7,8。化学水凝胶通常具有较高的强度和稳定性，但一般而言，所用交联剂对细胞具有毒性，且难以完全去除，因此其应用受到限制。另一方面，物理水凝胶通过聚合物链之间的非共价相互作用连接而成，无需使用交联剂4,9。网络中的主要非共价相互作用包括疏水相互作用、静电作用力、互补作用以及氢键7。
聚乙烯醇（PVA，图1a）是一种合成的水溶性聚合物，具有优异的机械性能和生物相容性，可通过冻融法制备无需交联剂的水凝胶10,11。当该聚合物冻结时，其分子链上的羟基（-OH）之间可形成高浓度的氢键区域（即结晶区）12。这些结晶区在凝胶网络中起到交联点的作用，其形成受到两个过程的促进：一是冰晶膨胀使聚合物链相互靠近，二是在冷冻过程中PVA的构象从全同立构转变为间同立构13。由于冷冻干燥过程中冰晶发生升华，留下空隙，从而形成水凝胶中的孔隙14。为了获得性能更优的水凝胶，PVA可 facile 地与其他聚合物复合使用。
从这一角度来看，壳聚糖是一种理想的选择，因为它是自然界来源中唯一带正电荷的生物聚合物。壳聚糖通过甲壳素的脱乙酰化获得，由β-1,4连接的D-葡糖胺（脱乙酰化单元）和N-乙酰-D-葡糖胺（乙酰化单元）随机组合构成15,16（图1b）。壳聚糖可被人源酶降解，且具有良好的生物相容性。此外，由于其阳离子特性，能够与细胞表面的负电荷相互作用，这一性质被认为与其抗菌活性相关17。该聚合物易于加工处理，但其机械性能不足，因此常添加其他材料形成具有更优特性的复合物。
考虑到壳聚糖和聚乙烯醇（PVA）的特定性质，已通过冻融法成功制备出水凝胶2,18，从而避免使用有毒交联剂。在壳聚糖-PVA 水凝胶中，PVA 的结晶区同样形成，壳聚糖链相互贯穿，并与 PVA 中的 -NH2 基团和 -OH 基团形成简单的氢键。最终的壳聚糖-PVA 水凝胶具有良好的机械稳定性、高溶胀率、低毒性以及抗菌性能18。然而，最终材料的特性会因制备过程中所采用的冷冻条件（温度、时间及循环次数）不同而发生变化。一些研究表明，增加冷冻循环次数会降低溶胀度，同时提高拉伸强度19,20。为了增强网络结构，在冻融制备后还可额外采用伽马射线或紫外光辐照以及化学交联剂等辅助手段21,22,23。壳聚糖比例较高的水凝胶具有更多孔的网络结构和更高的溶胀能力，但机械强度和热稳定性较低。因此，在制备过程中需充分考虑工艺条件，以获得适用于特定应用目标的合适水凝胶。
本研究的目的是详细阐述冷冻条件（冷冻温度和冻融循环次数）如何影响CS-PVA水凝胶的最终特性。评估了其傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、形态与孔隙特性、溶胀能力，以及药物负载和释放能力。在释放实验中，选用双氟尼酸（图1c）作为模型药物，因其分子尺寸与水凝胶结构相匹配。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>中等分子量壳聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448877</td><td>通过毛细管粘度法测定的分子量（637,000 Da），脱乙酰度为70%</td></tr><tr><td>双氟尼柳（2'-4'-二氟-4-羟基-3-联苯甲酸）</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1005706</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>分子量89,000–98,000，水解度≥99%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cressington Sputter Coater 108 auto</td><td>TED PELLA INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryodos 冷冻干燥机</td><td>Telstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管</td><td>Thermo Fisher Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）</td><td>Nicolet iS50</td><td>采用ATR模式</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromeritics Autopore IV 9500</td><td>Micromeritics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Pemtron SS-300LV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种无需交联剂制备壳聚糖-聚（乙烯醇）水凝胶的冻融方法及双氟尼酸释放研究

A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Poly(vinyl alcohol) Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies

通过冻融法可制备壳聚糖-聚（乙烯醇）水凝胶，且无需使用有毒交联剂。这些体系的应用受限于其特性（如孔隙率、柔韧性、溶胀能力、载药能力及药物释放能力），而这些特性取决于冷冻条件以及聚合物的种类和比例。本实验方案描述了如何以50/50 w/w%的聚合物配比制备壳聚糖和聚（乙烯醇）水凝胶，并通过改变冷冻温度（-4 °C、-20 °C、-80 °C）和冻融循环次数（4、5、6次冻融循环）来调控其性能。获取了水凝胶的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电镜（SEM）图像及孔隙度数据。同时评估了水凝胶的溶胀能力以及双氟尼酸的载药与释放行为。SEM图像和孔隙度分析结果表明，随着温度降低，孔径减小而孔隙率增加。在较低冷冻温度下，溶胀百分比更高。研究了双氟尼酸从水凝胶中的释放行为。所有凝胶网络均可维持药物释放达30小时，且根据Korsmeyer-Peppas模型和Higuchi模型分析，双氟尼酸的释放由简单的扩散机制调控。

水凝胶的制备 
采用先前报道的冻融法，在 -4 °C、-20 °C 和 -80 °C 条件下进行 4 次冷冻循环，以及在 -80 °C 条件下进行 5 次和 6 次冷冻循环，制备得到壳聚糖-PVA 水凝胶2。所有水凝胶均呈均匀、半透明状，具有良好的柔韧性及抗操作损伤能力。
FT-IR 表征 
FT-IR 光谱如图 2所示。检测到壳聚糖和聚乙烯醇（PVA）聚合物的七个特征信号：在 3286 cm-1 处为 PVA 羟基（-OH）的伸缩振动模式，在 2918 cm-1 处为 -CH 基团的伸缩振动模式26,27。...

冻融法用于制备无需交联剂的壳聚糖-聚（乙烯醇）水凝胶。采用该方法时，需考虑冷冻条件（温度、冻融循环次数）和聚合物比例，这些因素会影响所获得水凝胶的性能和应用。

壳聚糖-聚（乙烯醇）水凝胶可通过冻融法制备，无需使用有毒交联剂。这些水凝胶的应用包括……

本方案具有重要意义，因为我们的冻融方法是一种适用于制备生物相容性水凝胶的适宜工艺，可用于生物医学、制药或化妆品领域。该方法的主要优势在于无需使用可能引起出生缺陷的化学交联剂。此外，该方法中采用的冷冻条件可调控水凝胶的最终性能，如交联程度等。该方法可应用于具有其他用途的水凝胶。该方法可用于处理水污染。实际上，它还可用于制备聚合物微珠，作为新培养体系中的储水容器。彻底均质化所测量的聚合物溶液非常重要，否则水凝胶会出现裂纹点。此外，每个循环中的冷冻时间也必须严格控制。开始此实验步骤时，将0.2克壳聚糖和10毫升0.1摩尔的乙酸在室温下溶解，并持续进行机械搅拌过夜，以制备2%的壳聚糖溶液。第二天，将1克聚乙烯醇（PVA）溶于10毫升蒸馏水中，在80摄氏度下搅拌一小时。使用磁力搅拌器在室温下将两种溶液等量混合，持续搅拌至形成均匀的混合溶液。将混合物倒入培养皿中。在常压下静置样品两小时以去除气泡。将水凝胶在负四摄氏度、负20摄氏度或负80摄氏度下冷冻20小时，并进行四个冻融循环。使用五次或六次冷冻循环，将另一种水凝胶在-80摄氏度下冷冻20小时。在第三次冷冻循环后，用去离子水洗涤水凝胶。在最后一次冷冻循环结束后，将水凝胶在-50摄氏度下冷冻干燥48小时，并进行搅拌以进一步表征。准备进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征时，将一小块水凝胶置于傅里叶变换红外光谱仪的ATR模式下。采集波数范围为4000至600 cm⁻¹的FT-IR光谱。首先，从水凝胶中切取直径为13毫米、高度为10毫米的圆片。称重。将圆片置于50毫升去离子水中，在25摄氏度下振荡孵育。每隔30分钟从培养基中取出样品。用吸水纸吸去样品上多余的水分并称重。然后根据文本方案计算溶胀度，并进行电子显微镜观察和孔隙非对称性分析。上样前，配制4升浓度为15毫克/升的双氟尼酸溶液，搅拌过夜。通过紫外-可见光谱法确认溶液的浓度。然后将400毫克冻干水凝胶样品与6毫升蒸馏水在24小时内溶胀。对于载药过程，将50毫升双氟尼酸溶液加入烧瓶中，并在25°C下持续搅拌维持。将每个溶胀后的水凝胶浸入烧瓶中。随后，在不同时间点取2毫升剩余的双氯芬酸溶液样品，以确定曲线的平台区域。24小时后，更换为新鲜溶液。在252纳米处测定每份等分试样的吸光度，并利用双氟尼酸的标准曲线确定溶液中双氟尼酸的浓度。根据文本方案中的说明，计算水凝胶中保留的双氟尼酸含量及包封率。随后将载药水凝胶在-80摄氏度下冷冻，并在-50摄氏度下进行冻干。对于药物释放，将300毫克冻干的双氟尼酸负载水凝胶浸入50毫升pH为7.4、25摄氏度的磷酸盐缓冲液中，保持持续搅拌。在不同时间点取出2毫升等分试样，并补充新鲜介质以维持恒定体积。根据标准曲线，通过紫外-可见分光光度法在252纳米处测定双氟尼酸的释放量。随后，依据文本方案推断水凝胶中主要的药物释放机制。此处，CSPVA水凝胶采用冻融法制备，无需使用交联剂。FT-IR 谱图显示出两种聚合物的七个特征信号。所有 CSPVA 水凝胶均表现出高度多孔的表面，并且根据制备条件观察到明显的结构变化。在零下 4 °C 条件下制备的水凝胶具有最大的孔径。在零下80摄氏度制备的水凝胶似乎具有更疏松的多孔网络结构，且冷冻循环次数似乎促进了更清晰且更圆的孔隙形成。然而，在零下80摄氏度下经过六次冷冻循环制备的水凝胶比经过四次冷冻循环制备的水凝胶渗透性更低，这可能是由于其较高的曲折度所致，表现为总侵入体积较低。在溶胀行为方面，水凝胶能迅速吸收大量水分，在最初五小时内可吸收并保持相当于其自身重量十倍的水分，20小时后可达其自身重量的15倍。观察温度影响时发现，在–80 °C下经过四次冻融循环制备的水凝胶在前五小时内表现出较低的溶胀能力。在任何时间点均未观察到冻融循环次数产生显著差异。在所有情况下，双氯芬酸从水凝胶中的释放动力学持续约30小时，其中在–80 °C下经过四次冻融循环制备的水凝胶释放量最高。在–80摄氏度下经过四次冷冻循环制备的水凝胶与在–80摄氏度下经过六次冷冻循环制备的水凝胶之间的释放行为没有差异。进行此操作时最重要的是冷冻条件。为了获得完全形成、结构完整的水凝胶，必须至少进行约三次冷冻循环。该方法可与细胞培养相结合，用于评估体外生物相容性，也可与降解研究相结合。在这些方法开发完成后，我们意识到可以进一步探索在混合物中添加其他聚合物，甚至芦荟等天然化合物的可能性。这样做将使我们能够将新特性融入这些材料中。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一种冷冻-解冻方法，用于制备奇托桑-波里（乙烯基酒精）水凝胶，无交联剂和二分释放研究

目前干细胞治疗面临的主要障碍之一是确定将这些细胞递送至宿主组织的最有效方法。在此，我们描述了一种基于壳聚糖的递送方法，该方法操作简便且效率高，同时能够维持脂肪来源干细胞的多向分化潜能。...

构建用于递送负载干细胞的壳聚糖微球的胶原水凝胶

本实验方案重点利用干细胞固有的能力，即响应其周围细胞外基质的信号，进而被诱导分化为多种表型。本方法学论文扩展了我们对一种双层水凝胶模型的描述与表征，该模型由聚乙二醇-纤维蛋白（PEG-fibrin）和胶原蛋白组成，可同时共诱导脂肪来源的干细胞分化1。...

构建双层水凝胶以调控ASC分化

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